Name: Ensayos para estudiar el rol de vitronectina en la adhesión bacteriana y resistencia de suero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Aprende ensayos de citometría de flujo y ELISA para estudiar la adhesión bacteriana mediada por vitronectina humana. Estos métodos revelan cómo los patógenos evaden el sistema inmune y establecen infecciones.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Anna y Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. y Edla Johansson Foundation, el Consejo de investigación médica sueco (concesión número K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), la Fundación de cáncer en la Universidad Hospital de Malmö, la sociedad fisiográfica (Fundación de Forssman) y del Consejo de Condado de Skåne investigación y Fundación para el desarrollo.

1. Análisis de Vn como un ligando de la proteína bacteriana de la superficie
<ol><li>
Detección de Vn-atascamiento en la superficie bacteriana mediante citometría de flujo Nota: En citometría de flujo, utilizamos lado dispersión y dispersión hacia delante para puerta de sucesos positivos. Para examinar las interacciones con Vn, Hif clínico aislados (n = 10) fueron seleccionados7 junto con e. coli BL21 (DE3) como control negativo (figura 1A).<ol>
<li>Cultura Hif clínico aislados de cerebro corazón infusión (BHI) suplementado con 10 μg/mL NAD y hemina a 37 ° C con agitación a 200 rpm. Uso medio de Luria-Bertani a la cultura de e. coli14. Cosecha de Hif en fase logarítmica media (OD600 = 0.3)15y resuspender las bacterias en tampón fosfato salino (PBS), pH 7,2, que contiene 1% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) (solución amortiguadora de bloqueo; PBS-BSA). Ajustar la suspensión a 109 UFC/mL.</li>
		<li>Transferencia las alícuotas que contienen 5 x 106 UFC para tubos de fondo redondo poliestireno de 5 mL (12 x 75 mm2) y añadir 1 mL de solución amortiguadora de bloqueo. Centrifugar la suspensión a 3.500 × g a temperatura ambiente (RT)16 durante 5 minutos para las bacterias de la pelotilla, y luego aspirar con cuidado para retirar el sobrenadante sin perturbar el pellet.</li>
		<li>Vuelva a suspender los pellets bacterianos con 50 μL de solución amortiguadora de bloqueo que contiene 250 nM Vn e incubar las muestras durante 1 hora a temperatura ambiente sin agitar. Después de la incubación de la pelotilla de las bacterias por centrifugación a 3.500 x g durante 5 min, luego lavar los gránulos tres veces con PBS y pasos de centrifugación similares.</li>
		<li>Para el pellet bacteriano, añada 50 μL de ovejas primaria contra Vn policlonales (pAbs) en dilución 1: 100 en PBS-BSA. Incubar la suspensión durante 1 h a temperatura ambiente, luego lavar las bacterias tres veces con PBS para eliminar los anticuerpos no Unidos (como se describe en el paso 1.1.3).</li>
		<li>A continuación, añada 50 μL de PBS-BSA con isotiocianato de fluoresceína (FITC)-conjugados burro anti-oveja PAB (dilución 1: 100) e incube a temperatura ambiente durante 1 h en la oscuridad.</li>
		<li>Preparar un control en blanco incubando las bacterias con el bloqueo solamente de buffer y PAB sin Vn.</li>
		<li>Lave las bacterias tres veces con 1 mL de solución amortiguadora de bloqueo y la suspensión de pellets por centrifugación, como se describe en la sección 1.1.2. Finalmente, Resuspender el precipitado bacteriano con 300 μL de PBS y analizar mediante citometría de flujo7.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análisis de ELISA de la interacción entre PH recombinante y Vn Nota: Los controles deben ser incluidos para excluir el atascamiento no específico. Proteína humana del Factor H (FH) o unión a C4b (C4BP) se utilizan como controles positivos y negativos, respectivamente.<ol>
<li>Diluir cada una de las proteínas humanas (Vn FH y C4BP) por separado a 50 nM en Tris-HCl, pH 9.0 (tampón de recubrimiento). Añada 100 μl de solución de proteína en cada pocillo de una microplaca Polysorp. Cierre las placas con la tapa y almacenar a 4 ° C durante la noche (16 h) para facilitar la inmovilización de proteínas sobre pocillos de la placa.</li>
		<li>Deseche la solución de la placa de microtitulación inclinando hacia abajo sobre el fregadero y lavar los pocillos 3 veces con 300 μL de PBS/pozo. Bloquear los pocillos recubiertos por 1 h a temperatura ambiente con PBS conteniendo 2,5% (p/v) de BSA (BSA-PBS).</li>
		<li>Después de retirar la solución de bloqueo, lavar los pocillos 3 veces con 300 μL de PBS que contenga 0.05% (v/v) Tween 20 (SAFT) por pozo. Añada 100 μl de recombinante de nM 50 PH su etiquetado a cada muestra así e incubar durante 1 h a TA. En pozos de control, agregar 100 μl de PBS-BSA. Nota: El PH de Hif la codificación del gene de la lph fue amplificado por PCR y clonado en el vector de expresión pET26b que añade una 6 × su-etiqueta en el c-término de la proteína expresada. El vector recombinante fue transformado en e. coli BL21(DE3) para la expresión. Ni-NTA resina se utiliza para purificar la proteína recombinante15.</li>
		<li>Deseche la solución de la proteína y eliminar las proteínas no Unidas por lavar los pocillos 3 veces con 300 μL de SAFT por pozo. Añada 100 μl de PBS-BSA con rábano picante con peroxidasa (HRP)-conjugado anti-su PAB (1:10, 000 dilución) e incubar 1 h a TA.</li>
		<li>Preparar solución de 20 mM A disolviendo Tetrametilbencidina en una solución de 5% de acetona y el 45% de metanol. Para preparar la solución B, disolver 19,2 g de ácido cítrico en 1.000 mL de H2O, ajustar el pH a 4.25 por adición de KOH y luego añadir 230 μl de 30% H2O2. Almacenar ambas soluciones en la oscuridad a TA. Justo antes del uso, mezclar 500 μl de la solución B con 9,5 mL de solución A preparar el reactivo de detección de ELISA.</li>
		<li>Lavar los pozos tres veces con 300 μL de SAFT por pozo y detectar complejos antígeno-anticuerpo mediante la adición de 100 μl de reactivo de detección ELISA a cada pocillo.</li>
		<li>Añadir 50 μl de 1 M H2hasta4/well para detener la reacción. Medir la densidad óptica de los pocillos a 450 nm utilizando un lector de microplacas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estudio de la cinética de interacción de recombinante PH y Vn con BLI
	<ol>
<li>Inmovilizar Vn humano en sensores reactivos amina amina acoplamiento método, según directrices11 el fabricante.</li>
		<li>En serie con PBS, diluir el ligando (recombinante PH) de 0 a 4 μm y transferir las soluciones resultantes a una microplaca de 96 pozos negros, fondo plano. Ejecutar el experimento a 30 ° C usando un instrumento BLI del17.</li>
		<li>Cargue la carpeta de datos en el software de análisis de datos BLI. Seleccione la opción 'sensor selección' . A continuación, seleccione 'referencia bien' (sensor de Vn-revestida en PBS) para la resta.</li>
		<li>Seleccione 'alinear el eje y a la línea de base' y 'interstep corrección y alinear a la Asociación'. Pulse 'datos de proceso' que se abren automáticamente la ficha de análisis.</li>
		<li>En la ficha de análisis, seleccione la opción 'Asociación y disociación' el ajuste de curvas. Seleccione el modelo de ' Unión 1:1 y conexión global'. Pulse 'ajustar curva' y exportación ajuste datos17.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Caracterización del papel de Vn en la adhesión bacteriana
<ol><li>
Estudio de la adherencia bacteriana a las superficies de vidrio recubierto de Vn
	<ol>
<li>Preparar una solución de 2 μg/mL de Vn en PBS y pipetee 10 μl de esta solución en un microscopio de vidrio Deslice como una sola gota. Permitir que la gota se seque sobre el portaobjetos durante 30 min a TA. capa una diapositiva con albúmina sérica humana (HSA) como control negativo.</li>
		<li>Lavar los portaobjetos de vidrio recubierto de proteína tres veces sumergiendo los portaobjetos durante dos segundos en un vaso de precipitados que contiene PBS para eliminar el exceso proteína sin recubrimiento. Añadir 20 mL de cultivo fresco de Hif (descrito en el paso 1.1.1) en un plato de petri de plástico estéril y sumergir la Vn- / vidrio revestido de HSA se desliza en el medio de cultivo. Incubar los platos a 37 ° C por 1 h con agitación a 20 rpm. Nota: Hif M10 y Hif M10Δlph fueron cultivadas en medio BHI líquido o en placas de agar chocolate. El medio para el mutante de la lph fue suplementado con 10 μg/mL de kanamicina15.</li>
		<li>Después de la incubación, retirar cualquier bacteria sumergiendo los portaobjetos tres veces en un vaso de precipitado con PBS. Visualizar las bacterias por tinción de Gram, como se describe.<ol>
<li>Quitar exceso PBS de cada diapositiva inclinándolo y contacto con el borde en papel de seda. Deje secar al aire los portaobjetos durante 3-5 min a temperatura ambiente y se fijan bacterias adheridas pasando cada diapositiva 3 veces sobre una llama.</li>
			<li>Sujete la corredera por los bordes con dos dedos en una bandeja de tinción, luego agregar 3 – 4 gotas (200 – 300 μL) de solución de violeta cristal de 2.3%. Espera 60 s, después lave el portaobjetos bajo un chorro suave del grifo de agua para 3 – 4 s.</li>
			<li>Añadir 3-4 gotas de solución de yodo de 0,33% en las diapositivas. Espere 1 minuto, luego enjuagar el portaobjetos bajo un chorro suave de agua del grifo. Seque cuidadosamente las diapositivas por papel secante.</li>
			<li>Añadir 3-4 gotas de solución decolorante alcohol isopropílico al 75% y 25% de acetona en la diapositiva. Después de 5 a 10 s, lavar el portaobjetos bajo un chorro suave de agua del grifo.</li>
			<li>Añadir 3-4 gotas (200 – 300 μL) de solución básica carbolfuchsin. Espere 1 minuto, luego enjuague los portaobjetos bajo un chorro suave de agua del grifo. Seque el portaobjetos con papel secante.</li>
			<li>Visualizar las bacterias bajo el microscopio de luz, seleccionar un objetivo de inmersión en aceite a 100 X de aumento18. Comparar la adherencia de la WT de Hif y bacterias mutantes en las superficies de vidrio recubiertas de Vn y HSA.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estudio de adherencia Vn-dependientes de las bacterias a las células epiteliales Nota: Este análisis eficiente adherencia fue utilizado en nuestros estudios anteriores4,7.<ol>
<li>Cultura A549 (células tipo II alveolares epiteliales) en un matraz de cultivo de tejidos de 75 cm2 con F12 suplementado con 10% de suero de ternero fetal (vol/vol) (FCS) (medio completo) y 5 μg/mL gentamicina. Incube el frasco en una incubadora con 5% CO2 a 37 ° C por 3 días hasta 80% confluente (confluencia puede estimarse al visualizar la cobertura de la superficie de las células con microscopio invertido). Los cuatro pasos siguientes describen cómo preparar las células epiteliales para el ensayo19,20.<ol>
<li>Lavar la monocapa de células en el frasco dos veces con 20 mL de PBS agitando suave. Para separar las células de la superficie del frasco, agregar 2 mL de solución de enzima de desprendimiento de células e incubar el matraz durante 5 min a 37 ° C. Golpear el frasco con su palma para separar todas las células de la superficie de plástico. Pipetee hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para dispersar a grupos de células.</li>
			<li>Agregar 18 mL de medio completo F12 al matraz y transferir la suspensión de toda la célula a un tubo estéril de Falcon de 50 mL. Centrifugar la suspensión celular por 5 min a 200 x g a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante. Resuspender el precipitado de células en 10 mL de medio completo F12.</li>
			<li>Extraiga 10 μl de la suspensión de células y colocar en un tubo Eppendorf, luego agregar 90 μl de solución de azul tripán. Cargar la muestra en un hemocitómetro (profundidad de 0,1 mm) después de colocar el cubreobjetos.</li>
			<li>Contar todas las células viables en las zonas A, B, C y D (cada campo consta de 16 cuadrados y cada cuadrado tiene una superficie de 0.0025 mm2), luego calcular el número promedio de células ([A + B + C + D] / 4). Calcular el número de células por mililitro, utilizando la siguiente ecuación: Células viable/mL = promedio células cuenta × 104 × dilución factor20. Nota: Aquí, el factor de dilución es 10.</li>
			<li>Diluir la suspensión de células a 5.0 x 103 células/mL usando gentamicina de 5 μg/mL con medio completo. Pipetear 500 μL de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pozos. Incubar la placa a 37 ° C en 5% de CO2 hasta que las células son 90% confluente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Antes de una infección bacteriana, eliminar el medio de los pozos y añadir medio de F12 (sin FCS), luego incubar durante una noche a 37 ° C.</li>
		<li>Lavar la monocapa celular tres veces con 500 μl de PBS en lugar del RT. la placa de hielo y añadir 100 μl de medio de F12 previamente refrigerado que contiene 10 μg/mL de Vn. Incubar la placa a 4 ° C por 1 h. Para los pozos de control, agregar únicamente medio de F12.</li>
		<li>Después de la incubación, deseche la solución mediante pipeteo y lavar la capa de células dos veces con 1 mL de PBS en RT. resuspender una cultura recién crecido Hif M10 (paso 1.1.1) en medio F12 (2 × 108 UFC/mL). Añadir 100 μl de esta suspensión bacteriana a cada pozo e incubar la placa por 2 h a 37 ° C. Nota: Cada uno bien contiene aproximadamente 2 x 105 A549 células. Para la infección, 2 x 107 UFC bacteriana fueron agregados, correspondientes a una multiplicidad de infección de 100.</li>
		<li>El medio mediante pipeteo Lave y las células epiteliales A549 tres veces con PBS. Añadir 50 μL/pocillo de solución de la separación de células e incubar la placa por 5 min a 37 ° C.</li>
		<li>A continuación, añada 50 μl de medio completo F12 por pozo para detener la reacción enzimática. Transferencia de las células epiteliales (≈100 μL [es decir, el volumen entero]) de cada bien a un tubo de vidrio de 6 mL que contiene cuatro bolas de cristal. Lyse las células en el RT con un vórtex durante 2 minutos.</li>
		<li>Diluir 10 μl de la célula lisada 100-fold añadiendo 10 μl de lisado a 990 μl de medio de F12. Placa 10 μl de la muestra diluida en una placa de agar chocolate.</li>
		<li>Incubar la placa de agar chocolate a 37 ° C durante la noche, y luego contar las colonias. Cada colonia representa una UFC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Análisis de la resistencia Vn-dependiente a la actividad bactericida del suero humano
<ol><li>NHS de la compra de una fuente comercial. Preparar VDS como se describió anteriormente12. Reponer el VDS con 180 nM Vn equivalente a Vn presente de NHS.</li>
	<li>Preparar suero inactivado con calor (HIS) calentando el NHS a 56 ° C por 30 min para inactivar proteínas del complemento. Nota: La concentración óptima del suero (5%) y tiempo de incubación (15 min) para el ensayo que se describe en pasos 3.3 – 3.7 se determinaron empíricamente por Hif15; estos parámetros podrían variar para otros patógenos bacterianos.</li>
	<li>Bacterias (en este caso, Hif M10 y el mutante Hif M10Δlph) de la cultura a la fase de registro medio (OD600 = 0.3). De la pelotilla de las bacterias por centrifugación a 3.500 x g por 10 min.</li>
	<li>Resuspender el precipitado bacteriano con 1 volumen de dextrosa gelatina Veronal búfer (DGVB++; pH 7.3) con 2,5% (p/v) glucosa 2 mM de MgCl2, 0.15 mM CaCl2y 0,1% (peso/vol) gelatina.</li>
	<li>Añadir 1,5 x 103 UFC de bacteria a 100 μl de DGVB++ que contiene 5% de suero (NHS, sus, VDS, o VDS + 180 nM Vn). Incubar la muestra a 37 ° C durante 15 min con agitación a 300 rpm.</li>
	<li>Quitar una alícuota de 10 μl de la mezcla de reacción en el minuto 0 (T0 de muestra) y 15 min (Tt de muestra) y placa de agar chocolate. Incubar la placa a 37 ° C durante la noche.</li>
	<li>Después de la incubación, contar las colonias que aparecen en la placa. Calcular el porcentaje de bacterias mató12 utilizando la siguiente ecuación: (UFC Tt) / (UFC en T0) × 100.</li>
</ol>

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<li>Su, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemophilus+influenzae+P4+Interacts+With+Extracellular+Matrix+Proteins+Promoting+Adhesion+and+Serum+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance.</a> J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).</li>
<li>Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+structure+of+Haemophilus+influenzae+protein+E+reveals+multiple+binding+sites+for+host+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors.</a> Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).</li>
<li>Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+as+a+tool+for+exploring+bacterial+proteins%3A+model+of+RickA+in+Rickettsia+conorii%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiolog%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii.</a> New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).</li>
<li>Pinne, M., Haake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-fluorescence+assay+of+leptospiral+surface-exposed+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.+JoVE%22%5BJournal%5D)">Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses financieros.

Patógenos bacterianos reclutan Vn a la superficie de la célula y utilizan este regulador complemento para evitar la deposición de los factores de complemento y completar el complejo de ataque de membrana2. VN también funciona como una molécula puente entre proteínas de la superficie bacterianas y receptores de superficie celular host, permitiendo así que los patógenos se adhieren a la superficie de las células epiteliales y posteriormente median internacionalización. En este estudio, se describen ...

Vitronectina (Vn) es una importante glucoproteína humana implicados en el mantenimiento de la homeostasis a través de la regulación del sistema fibrinolítico. VN también funciona como un regulador del complemento mediante la inhibición de la vía del complemento terminal durante la formación de complejos de C5b6-7 y la polimerización de C9. Varios patógenos bacterianos se han demostrado para reclutar Vn a la superficie celular como medio de resistencia complemento deposición1,2,3. Además, Vn funciona como una molécula "sandwich" entre bacterias y receptores de las células epiteliales host, tal modo de promover la adhesión y la internalización de patógenos2,4,5. Unión de Vn a la superficie de la célula bacteriana está mediada por otras proteínas actualmente no identificados. Elucidar completamente el papel funcional de Vn-enlace de evasión de la respuesta inmune de la manguera por lo tanto requerirá identificación de proteínas Vn-reclutamiento.
El paso inicial en la identificación de proteínas de unión a Vn es probar si un patógeno de interés puede enlazar purificada Vn. flujo cytometry es un método conveniente y sencillo para determinar si Vn está limitado a las células del patógeno. En este estudio, se evaluó el atascamiento de Vn a varios Haemophilus influenzae tipo f (Hif) aislamientos clínicos6. El método descrito en este documento es cuantitativo y puede utilizarse para distinguir la capacidad de unión de una gran variedad de cepas bacterianas. En un estudio anterior hemos caracterizado proteína H (PH) de Hif como Vn vinculante proteínas7. Por lo tanto, en el presente estudio, el potencial de unión a Vn de los mutantes de tipo salvaje (WT) Hif y Hif M10Δlph se compararon utilizando los protocolos descritos.
Una vez que determine que un patógeno une Vn, el segundo paso es caracterizar el proteoma superficial con el fin de identificar potenciales proteínas Vn. Una variedad de enfoques se puede utilizar para este propósito8,9, pero estas metodologías no se describen en este informe. El método más adecuado para examinar las interacciones proteína-proteína es expresar las proteínas de la superficie bacterianas de e. coli por vía recombinante y purificar por cromatografía de afinidad. Aquí, utilizamos el PH y su interacción molecular con Vn para ilustrar el método. Interacciones entre recombinante PH y Vn se caracterizaron usando una enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) de ensayo7 y una técnica recientemente desarrollada etiqueta-libre conocido como bio-capa interferometría (BLI)10,11. Mientras que Elisa puede utilizarse para confirmar las interacciones proteína-proteína, BLI proporciona datos detallados sobre los parámetros cinéticos de la interacción.
Para estudiar el papel funcional de Vn en la adhesión bacteriana, se pueden utilizar dos diferentes ensayos. El primer ensayo que se describe aquí es la medición directa de la adherencia bacteriana a las superficies de vidrio recubierto de Vn, mientras que el segundo ensayo examina adhesión a la superficie de las células epiteliales. Para el primer ensayo, portaobjetos fueron recubiertos con Vn y el atascamiento de WT o estirpes mutantes de Hif se evaluó por tinción de Gram y microscopía. Esta técnica distingue fácilmente las bacterias basadas en la capacidad de atar Vn12. Luego se analizó la adherencia bacteriana a las células de mamífero mediante la adición de bacterias cultivadas sobre una monocapa de células epiteliales alveolares de tipo II; fijación bacteriana se evaluó contando el número de la Colonia formando unidades (UFC). Bacterias adheridas e interiorizadas se pueden diferenciar en la presencia o ausencia de Vn4,13.
El papel de la adquisición de Vn en la resistencia bacteriana del suero fue evaluado usando un análisis de muerte de suero (es decir, la actividad bactericida del suero). Para evaluar la importancia de la adquisición de Vn en resistencia de suero, la actividad bactericida del suero Vn-agotado (VDS) se comparó con la del suero humano normal (NHS). El método utilizado fácilmente distingue Vn vinculante frente a bacterias no vinculante basadas en resistencia de suero. Utilizamos este método para estudiar el papel de Vn en la resistencia de suero de varios patógenos bacterianos4,12.
Se han reportado numerosos métodos para el estudio de las interacciones huésped-patógeno. Aquí, describimos un conjunto de protocolos que se pueden adaptar fácilmente al estudio de cualquier agente patógeno con el fin de evaluar el papel de Vn en patogenesia. Hemos probado estos protocolos utilizando diversos agentes patógenos, y Hif fue elegido como un ejemplo para este informe.

<table><tbody><tr><td>Termomezclador de 1,5</td><td>mL Eppendorf</td><td>5355</td><td>agitador de calentamiento y enfriamiento de bloque seco</td></tr> 5 <tr><td>mL de poliestireno tubo de fondo redondo&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>60819-138</td><td>12 &times; 75 mm estilo</td></tr><tr><td>5% CO2 incubadora suministrada&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>BBD6220</tr><tr><td>Tubo de poliestireno de fondo redondo de 6 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89000-478</td><td>12 &times; 75 mm estilo con tapón</td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos</td><td>BD Falcon</td><td>08-772-1H</td><td>Grado de cultivo celular</td></tr><tr><td>30% Peróxido de hidrógeno (H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td>Grado de análisis de laboratorio</td></tr><tr><td>75 cm2 matraz de cultivo de tejidos</td><td>BD Falcon</td><td>BD353136</td><td>Vented</td></tr><tr><td>Placa de fondo plano negro de 96 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655090</td><td>Cultivo de tejidos tratado y micro; Placas negras transparentes</td></tr><tr><td>A549 Línea celular humana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86012804-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de desprendimiento de células (Accutase)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Sensores AR2G</td> de grado de cultivo celular <td>Pall Life Science</td><td>18-5095</td><td>Sensor para proteína inmovilizada por acoplamiento de aminoácidos&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>VWR</td><td>97064-786 Grado de</td><td>análisis</td></tr><tr><td>Albúminas séricas bovinas (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td>Adecuado para cultivo celular</td></tr><tr><td>Papel bibuloso&nbsp;</td><td>VWR</td><td>28511-007</td><td></td></tr><tr><td>Interferómetro biocapa</td><td>Pall Life Science</td><td>FB-50258 Equipo de</td><td>medición de interferometría bicapa</td></tr><tr><td>Solución violeta cristalina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT90132-1L</td><td></td></tr><tr><td>C4BP (proteína de unión C4b)</td><td>Complement Technology, Inc.</td><td>A109</td><td>Comprado como forma líquida congelada</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Solución de carbol-fucsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT8018-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275-500G</td><td>Grado de la American Chemical Society (ACS)</td></tr><tr><td>Solución decolorante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75482-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>E. coli huésped (E. coli BL21)</td><td>Novagen</td><td>69450-3</td><td>Expresión de proteínas huésped</td></tr><tr><td>F12 medio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421</td><td>Citómetro</td></tr> de flujo de grado de cultivo celular<tr><td>&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>651154</td><td>Grado de análisis celular para aplicaciones de investigación&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero fetal de ternera (FCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td>Adecuado para cultivo celular</td></tr><tr><td>Suero humano normal (NHS)</td><td>Complement Technology, Inc.</td><td>NHS</td><td>Suero humano agrupado</td></tr><tr><td>FITC-conjugado burro anti-ovejas anti-ovejas&nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>STAR88F</td><td>Gentamicina policlonal</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>Grado de cultivo celular</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td>Adecuado para cultivo celular</td></tr><tr><td>Hemotómetro</td><td>Marienfeld</td><td>640210</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugado anti-His tag anticuerpos</td><td>Abcam</td><td>ab1269</td> Tecnología <td>policlonal</td></tr> del <tr><td>complemento del factor humano H</td><td>, Inc.</td><td>A137</td><td>Comprado como líquido congelado de</td></tr><tr><td>C4BP</td><td>Complement Technology, Inc.</td><td>A109</td><td>Solución congelada</td></tr><tr><td>Albúmina sérica humana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1653-10G</td><td>polvo liofilizado</td></tr><tr><td>Columna de resina de afinidad con histidina (HisTrap HP)</td><td>GE Health Care Life Science</td><td>17-5247-01</td><td>Columnas preempaquetadas con Ni Sepharose</td></tr><tr><td>PH marcado con His</td><td></td><td></td><td>Recombinante expresado y purificado en nuestro laboratorio</td></tr><tr><td>Solución de yodo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT902-8FOZ</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135-1LP</td><td>Grado de análisis</td></tr><tr><td>&nbsp; Microscopio</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td>Microscopio invertido Portaobjetos</td></tr><tr><td>de microscopio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8902</td><td>liso, tamaño 25 mm y 75 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido que contiene C terminal 6x His-tag en la columna vertebral (pET26(b)</td><td>)Novagen</td><td>69862-3</td><td>DNA vector</td></tr><tr><td>Polysorb microtitulación placas&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9410</td><td>para ELISA</td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6009</td> American <td>Chemical Society (ACS)</td></tr><tr><td>grado Anticuerpos Vn antihumanos para ovejas</td><td>AbD Serotec</td><td>AHP396</td><td>Agitador policlonal</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Stuart Scientific</td><td>STR6</td><td>Agitador</td></tr><tr><td>de plataforma Matraz de cultivo de tejidos</td><td>BD Falcon</td><td>3175167</td><td>75 cm2</td></tr><tr><td>&nbsp; Termomezclador&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3317</td><td>Agitador de calentamiento y enfriamiento de bloque seco</td></tr><tr><td>Tetrametilbencidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>860336-100MG</td><td>Grado ELISA</td></tr><tr><td>Vitronectina (Vn) de plasma humano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V8379-50UG</td><td>grado de cultivo celular</td></tr></tbody></table>

ensayos para estudiar el rol de vitronectina en la adhesión bacteriana y resistencia de suero

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Las bacterias utilizan reguladores del complemento como un medio de evadir la respuesta inmune del huésped. Aquí, describimos protocolos para la evaluación de la adquisición de vitronectina de papel en los juegos de célula bacteriana superficial en la resistencia al sistema inmune anfitrión. Experimentos de citometría de flujo identifican vitronectina de plasma humano como un ligando de la proteína de membrana externa bacteriana del receptor H de Haemophilus influenzae tipo f. Un análisis enzima-ligado del inmunosorbente era empleado para caracterizar las interacciones proteína-proteína entre proteínas recombinantes purificadas H y vitronectina y atar afinidad se evaluó mediante interferometría de la bio-capa. La importancia biológica de la Unión de la vitronectina a H la proteína en la superficie de la célula bacteriana en evasión de la respuesta inmune del huésped fue confirmada usando una prueba de resistencia de suero con suero humano normal y vitronectina-agotado. La importancia de la vitronectina en la adhesión bacteriana se analizó utilizando portaobjetos de vidrio con y sin recubrimiento de vitronectina, seguido de la tinción de Gram. Por último, se investigó la adherencia bacteriana a las monocapas de células epiteliales alveolares humanas. Los protocolos descritos aquí pueden adaptarse fácilmente al estudio de cualquier especies bacterianas de interés.

VN-Unión a la superficie de las bacterias fue determinada por citometría de flujo. Hif todos los aislados clínicos probados en este estudio reclutó a Vn a la superficie de la célula. Se observó ninguna interacción de Vn con la superficie de la célula para la cepa de control negativo e. coli (figura 1A). Como se muestra en la figura 1B, el PH es una importante proteína Vn en la superficie...

Este informe describe los protocolos para la caracterización de las interacciones entre proteínas de membrana externa bacteriana y la vitronectina de regulador del complemento humano. Los protocolos pueden utilizarse para estudiar las reacciones de enlace y función biológica de vitronectina en cualquier especie bacteriana.

Ensayos para estudiar el rol de vitronectina en la adhesión bacteriana y resistencia de suero

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la interacción huésped-patógeno, como cómo los patógenos bacterianos causan enfermedades en los seres humanos mediante la utilización de proteínas humanas. La principal ventaja de esta técnica es que puede responder si cualquier patógeno puede utilizar Vitronectin para establecer la infección del huésped. Nos centraremos en Vitronectin, una proteína huésped que participa en la matriz extracelular, pero también funciona como un inhibidor del complemento en la vía determinante de activación del complemento.Estos hechos son muy importantes y muy atractivos para los patógenos que causan enfermedades en los seres humanos. Para prepararse para la citometría de flujo, resuspender los gránulos bacterianos con 50 microlitros de tampón de bloqueo que contiene 250 nanomolar Vitronectin. Luego, incubar las muestras durante una hora a temperatura ambiente sin agitar.Después de la incubación, peletizar la bacteria por centrifugación a 3,500 g durante cinco minutos. Luego, lave los pellets tres veces usando PBS y pasos similares de centrifugación. Después del lavado, añadir 50 microlitros de anticuerpos policlonales antihumanos p

assays-for-studying-role-vitronectin-bacterial-adhesion-serum

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este protocolo es un ensayo simple adhesión bacteriana consiste en contar el número de unidades formadoras de colonias bacterianas que se adhieren a las células cultivadas. El ensayo es sólida, independiente de la adhesina estudiados, y numerosas variantes se utilizan en la mayoría de los laboratorios que trabajan en la patogénesis bacteriana.

Ensayo in vitro de la adhesión bacteriana a las células epiteliales de mamíferos

Este video describe una técnica basada en ELISA que detecta las interacciones proteína-proteína entre dos proteínas midiendo la unión de la segunda proteína a la primera proteína inmovilizada. La segunda proteína unida se detecta utilizando anticuerpos específicos marcados con una enzima, como la peroxidasa de rábano picante.

Método basado en ELISA para analizar las interacciones entre las proteínas de cebo y presa

En este vídeo, demostramos un ensayo para estudiar el papel de la vitronectina en la adherencia de Haemophilus influenzae a las células epiteliales del huésped.

Un ensayo para estudiar el papel de la vitronectina en la adherencia bacteriana a las células epiteliales del huésped

Este video demuestra el papel de la vitronectina, una glicoproteína sérica humana, en la resistencia bacteriana. Los anticuerpos en el suero interactúan con las proteínas de superficie bacterianas, activando las proteínas del complemento y formando el complejo de ataque a la membrana, causando la lisis celular bacteriana. La unión de la vitronectina a la proteína de la membrana bacteriana evita la formación del complejo de ataque de la membrana, lo que resulta en la supervivencia bacteriana.

Determinación del papel de la vitronectina en la resistencia bacteriana a la actividad bactericida del suero humano

En este video, demostramos un ensayo que utiliza microscopía de fluorescencia para detectar la adhesión de las células cancerosas a las trampas extracelulares de neutrófilos (NETs). En los pocillos de prueba, hay un aumento notable en el número de células cancerosas marcadas con fluorescencia que se adhieren a los NET, mientras que los pocillos tratados con DNasa exhiben una adhesión reducida de las células cancerosas a los NET.

Ensayo de adhesión in vitro para detectar la adherencia de las células cancerosas a las trampas extracelulares de neutrófilos

Este video muestra la detección de la interacción de la vitronectina con las proteínas de superficie bacterianas. El análisis de citometría de flujo mide la señal de fluorescencia de los anticuerpos marcados con fluorescencia unidos a la vitronectina, confirmando su presencia en la superficie bacteriana. Esta técnica proporciona información sobre las interacciones huésped-patógeno y las posibles terapias para infecciones bacterianas.

Detección de la unión de la vitronectina a las superficies bacterianas mediante citometría de flujo

Adherencia de los neutrófilos al endotelio activado en los sitios de infección es un componente integral de la respuesta inflamatoria del huésped. Se describe en el presente informe es un ensayo de unión de neutrófilos, que permite...

Cuantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

Para estudiar la interacción de las bacterias con los vasos sanguíneos sometidos a esfuerzo cortante, se describe una cámara de flujo y un modelo de microscopía mesentérica intravital in vivo que permiten diseccionar los factores bacterianos y del huésped que contribuyen a la adhesión vascular.

In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

La unión bacteriana a las células huésped es un paso clave durante la colonización e infección del huésped. Este protocolo describe la generación de adhesinas recombinantes acopladas a polímeros como materiales biomiméticos que permiten analizar la contribución de adhesinas individuales a estos procesos, independientemente de otros factores bacterianos.

Materiales biomiméticos para caracterizar las interacciones bacteria-huésped

En este documento se describe un método para la determinación de la asociación y competencia entre reinos (bacteriana y fúngica) por la adherencia a las monocapas de células HeLa infectadas por virus. Este protocolo puede extenderse a múltiples combinaciones de procariotas, eucariotas y virus.

Determinación de Biofilm Iniciación, el virus de las células infectadas por bacterias y hongos

Se proporciona un protocolo detallado para obtener imágenes de plaquetas migratorias individuales utilizando ataduras de avidina-biotina funcionalizadas con RGD con densidad sintonizable, que revela que las plaquetas generan suficiente fuerza para romper el enlace avidina-biotina.

Un ensayo in vitro para estudiar la migración plaquetaria utilizando ataduras de avidina-biotina funcionalizadas con RGD

Aprende ensayos de citometría de flujo y ELISA para estudiar la adhesión bacteriana mediada por vitronectina humana. Estos métodos revelan cómo los patógenos evaden el sistema inmune y establecen infecciones.

Ensayos para estudiar el rol de vitronectina en la adhesión bacteriana y resistencia de suero

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