Name: Avanzada modelo animal de colorrectal metástasis en hígado: Técnicas de imagen y propiedades metastásicas de los clones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Aprende a modelar la colonización hepática por clones tumorales metastásicos de cáncer colorrectal usando líneas celulares monoclonales doble marcadas. Este método permite visualizar in vivo y ex vivo el desarrollo de metástasis hepáticas para identificar genes asociados con oligometástasis y polimetástasis.

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Nos gustaría agradecer al Dr. Geoffrey L. Greene (Universidad de Chicago) para el plásmido Luc2-tdTomato y la línea celular HCT116, el Sr. Solanki Ani (Centro de Recursos de animales) para la gestión de los ratones, y el Dr. Lara Leoni por la asistencia con la DLIT. Cuantificaciones de intensidades fluorescentes y luminiscentes se realizaron en la Investigación de Recursos de imagen Pequeños Animales integrada en la Universidad de Chicago en un espectro IVIS (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Virginia y DK Ludwig para la Investigación del Cáncer, la Fundación de Investigación de Cáncer de Pulmón (LCRF), la Fundación de Cáncer de Próstata (PCF), y el Centro de soporte de Grant Cáncer (P30CA014599). Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.

<ol><li>Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+score+for+predicting+recurrence+after+hepatic+resection+for+metastatic+colorectal+cancer%3A+analysis+of+1001+consecutive+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases.</a> Ann. Surg. 230 (3), 309-318 (1999).</li>
<li>Pawlik, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surgical+margin+status+on+survival+and+site+of+recurrence+after+hepatic+resection+for+colorectal+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases.</a> Ann. Surg. 241 (5), 715-722 (2005).</li>
<li>Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+Cancer%2C+Systemic+Inflammation%2C+and+Outcome%3A+Staging+the+Tumor+and+Staging+the+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host.</a> Ann. Surg. 263 (2), 326-336 (2016).</li>
<li>Veen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Follow-Up+and+Survivorship+After+Completing+Systematic+Surveillance+in+Stage+I-III+Colorectal+Cancer%3A+Who+Is+Still+at+Risk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastrointest.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk.</a> J. Gastrointest. Cancer. 46 (3), 259-266 (2015).</li>
<li>Siegel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+treatment+and+survivorship+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J.+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer treatment and survivorship statistics.</a> CA Cancer J. Clin. 62 (2), 220-241 (2012).</li>
<li>O'Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colon+cancer+survival+rates+with+the+new+American+Joint+Committee+on+Cancer+sixth+edition+staging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging.</a> J. Natl. Cancer Inst. 96 (19), 1420-1425 (2004).</li>
<li>House, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+after+hepatic+resection+for+metastatic+colorectal+cancer%3A+trends+in+outcomes+for+1%2C600+patients+during+two+decades+at+a+single+institution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Surg%22%5BJournal%5D)">Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution.</a> J. Am. Coll. Surg. 210 (5), 744-752 (2010).</li>
<li>Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+bioluminescence+imaging+of+colorectal+liver+metastases+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse.</a> J. Surg. Res. 122 (2), 225-230 (2004).</li>
<li>Rajendran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+bioluminescent+hepatic+tumour+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine bioluminescent hepatic tumour model.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li>
<li>Oshima, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+tumor+clones+with+differential+liver+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Imaging of tumor clones with differential liver colonization.</a> Sci. Rep. 5 (10946), (2015).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+from+human+breast+tumors+are+involved+in+spontaneous+metastases+in+orthotopic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (42), 18115-18120 (2010).</li>
<li>Wang, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analyses+identify+osteopontin%2C+LAMB3+and+ITGB1+as+critical+pro-metastatic+genes+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer.</a> PLoS One. 8 (2), e55714(2013).</li>
<li>Fidler, I. J., Kripke, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+results+from+preexisting+variant+cells+within+a+malignant+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor.</a> Science. 197 (4306), 893-895 (1977).</li>
<li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li>
<li>Khodarev, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT1+pathway+mediates+amplification+of+metastatic+potential+and+resistance+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy.</a> PLoS One. 4 (6), e5821(2009).</li>
<li>Langley, R. R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell-organ+microenvironment+interactions+in+the+pathogenesis+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis.</a> Endocr. Rev. 28 (3), 297-321 (2007).</li>
<li>Lussier, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligo-+and+polymetastatic+progression+in+lung+metastasis%28es%29+patients+is+associated+with+specific+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs.</a> PLoS One. 7 (12), e50141(2012).</li>
<li>Lussier, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+characterizes+oligometastasis%28es%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es).</a> PLoS One. 6 (12), e28650(2011).</li>
<li>Calon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+of+colorectal+cancer+on+a+TGF-beta-driven+program+in+stromal+cells+for+metastasis+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation.</a> Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).</li>
<li>Vanharanta, S., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+metastatic+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Origins of metastatic traits.</a> Cancer Cell. 24 (4), 410-421 (2013).</li>
<li>Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathways%3A+Interferon%2FStat1+Pathway%3A+Role+in+the+tumor+resistance+to+genotoxic+stress+and+aggressive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth.</a> Clin. Cancer Res. 18 (11), 3015-3021 (2012).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-stimulated+gene+15+%28ISG15%29+is+a+trigger+for+tumorigenesis+and+metastasis+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma.</a> Oncotarget. 5 (18), 8429-8441 (2014).</li>
<li>Cespedes, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+microinjection+of+human+colon+cancer+cells+in+nude+mice+induces+tumor+foci+in+all+clinically+relevant+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites.</a> Am. J. Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).</li>
<li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> J. Vis. Exp. (10), (2007).</li>
<li>Soares, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+murine+model+of+hepatic+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A preclinical murine model of hepatic metastases.</a> J. Vis. Exp. (27), e51677(2014).</li>
<li>Evans, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+mice+to+men%3A+Murine+models+of+colorectal+cancer+for+use+in+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncol.+Hematol%22%5BJournal%5D)">From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El modelo animal presentado en el informe actual se basa en dos enfoques principales. En primer lugar, a fin de garantizar la capacidad de observar clones metastásicos con diferentes propensiones a colonizar y proliferar en el hígado, se estableció un panel de líneas celulares monoclonales altamente heterogéneos, en lugar de una línea celular de cáncer no fraccionada establecido 12,13. El enfoque monoclonal para el desarrollo de la metástasis es justificado por los datos genómicos últimos 14 y fue ...

Los pacientes con metástasis hepáticas de los cánceres primarios de colon (CRC) se caracterizan por un mal pronóstico. La tasa de supervivencia a 5 años para los primarios no metastásicos CRC (estadios I - III) se estima en un 75 - 88% 3,4, mientras que los pacientes con metástasis hepáticas (estadio IV) tienen una tasa de supervivencia a 5 años de sólo el 8 - 12% 5 , 6. Sin embargo, los pacientes metastásicos representan un grupo heterogéneo presentando con diferente número de metástasis y recurrencia diferentes momentos. Las observaciones clínicas indican que el número de metástasis (que puede ser proporcional a la capacidad de colonización o la frecuencia de colonización) y el tamaño de cualquier metástasis única (proporcional a la tasa de crecimiento local) son factores pronósticos independientes 1,7. En otras palabras, el éxito de clones metastásicos que colonizan el hígado depende de dos propiedades principales: su capacidad para crecer y su capacidad para difundir y sobrevivir en el microambiente de hígado. El diseñode modelos clínicos exitosos con la capacidad de capturar y cuantificar las propiedades de clones metastásicos puede mejorar drásticamente nuestra comprensión de la biología del hígado metástasis y proporcionar una herramienta eficaz para el diseño de posibles enfoques terapéuticos. Modelos de metástasis hepática experimental se ha informado anteriormente 8,9, pero ninguno de ellos siempre que la capacidad de capturar y describir las propiedades de clones metastásicas individuales tanto in vivo como ex vivo cuantitativamente. A continuación, presentamos un nuevo modelo, avanzada de la metástasis hepática que incluye la generación de clones tumorales con diferentes eficiencias de colonización del hígado y propiedades de crecimiento. Empleamos una combinación de de doble etiquetado de las células cancerosas con la luciferasa y la proteína fluorescente tdTomato con la generación de líneas de células monoclonales que tienen diferencias intrínsecas en la capacidad metastásica. En este modelo experimental, los datos indican que el desarrollo demetástasis hepáticas pueden ser descritos en términos de frecuencia de colonización y el tiempo de duplicación (Td), que es coherente con las observaciones clínicas. La naturaleza cuantitativa de este modelo hace que sea fácil adopción para el descubrimiento de fármacos y diagnóstico.

<table><tbody><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo sistema</td><td>de imagen Caliper Life Sciences</td><td>124262</td><td>In Vivo software</td></tr><tr><td>LivingImage 4.0 Caliper</td> Life <td>Sciences</td><td></td><td>128165 software de imagen</td></tr><tr><td>VAD-MGX Research Máquina de anestesia</td><td>Vetamac</td><td>VAD-MGX</td><td>máquina de anestesia inhalatoria</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-118</td><td>Reactivos de cultivo celular</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>Reactivos de cultivo celular</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina, líquido (10.000 unidades de penicilina; 10.000 &mu; g estreptomicina)</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td>Reactivos de cultivo celular</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>24020117</td><td>Reactivos de cultivo celular</td></tr><tr><td>Buprenex Inyección (0,3 mg/mL)</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.</td><td>12496-0757-5</td><td>Clorhidrato de buprenorfina</td></tr><tr><td>Gemini Cauteriy</td><td>System Braintree Scientific</td><td>GEM 5917</td><td>Cauterio manual para esplenectomía</td></tr><tr><td>Micro Clip; Recto; 70 gramos de presión; Ancho de clip de 1,5 mm; Longitud de la mandíbula de 10 mm</td><td>Instrumento quirúrgico Roboz</td><td>RS-5426</td><td>Hemoclip: Instrumentos de hemostasia después de la inyección en el bazo</td></tr><tr><td>D-luciferina, sal de potasio</td><td>Tecnología Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td>Luciferina sal de potasio</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Medio de suero reducido</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>Medio de suero reducido</td></tr><tr><td>TC20 Contador de células automatizado BIO-RAD</td><td></td><td>1450102</td><td>Contador de células automático</td></tr><tr><td>Software JMP10&nbsp;</td><td>SAS Institute</td><td></td><td>Software de análisis de datos</td></tr><tr><td>BD FACSAria II clasificador de células</td><td>BD Biocsiences Clasificador de</td><td></td><td>células</td></tr></tbody></table>

avanzada modelo animal de colorrectal metástasis en hígado: técnicas de imagen y propiedades metastásicas de los clones

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Los pacientes con un número limitado de metástasis hepáticas y bajas tasas de progresión pueden ser tratados con éxito con el tratamiento local se aproxima a 1,2. Sin embargo, poco se sabe acerca de la heterogeneidad de las metástasis hepáticas, y se necesitan modelos animales capaces de evaluar el desarrollo de las colonias metastásicas individuales. A continuación, presentamos un modelo avanzado de las metástasis hepáticas que proporciona la capacidad de visualizar cuantitativamente el desarrollo de clones individuales del tumor en el hígado y estimar su cinética de crecimiento y la eficiencia de la colonización. Hemos generado un panel de derivados monoclonales de células de cáncer colorrectal humano HCT116 de forma estable con la etiqueta luciferasa y tdTomato y que poseen diferentes propiedades de crecimiento. Con una inyección esplénica seguido de una esplenectomía, la mayoría de estos clones son capaces de generar metástasis hepáticas, pero con diferentes frecuencias de la colonización y diferentes tasas de crecimiento. Uso de la Syste In Vivo Imagingm (IVIS), es posible visualizar y cuantificar el desarrollo de metástasis con luminiscente in vivo y ex vivo de imagen fluorescente. Además, Diffuse luminiscentes tomografía (DLIT) proporciona una distribución 3D de las metástasis hepáticas in vivo. Ex vivo de imágenes de fluorescencia de hígados cosechadas proporciona mediciones cuantitativas de colonias metastásicas hepáticas individuales, lo que permite la evaluación de la frecuencia de colonización hígado y la cinética de crecimiento de metástasis. Puesto que el modelo es similar a metástasis hepáticas clínicamente observados, puede servir como una modalidad para la detección de genes asociados a metástasis de hígado y para probar posibles tratamientos ablativos o adyuvante para la enfermedad metastásica de hígado.

El objetivo de este experimento fue establecer un modelo animal consistente y fácilmente reproducible con el potencial para la cuantificación de serie de la carga tumoral metastásica in vivo y para la estimación de la frecuencia de colonización y la cinética de crecimiento de desarrollar metástasis hepáticas. Figuras 2-6, con leyendas, están provistos de nuestra publicación anterior bajo una licencia Creative Commons CC-BY 10. <p class="jove_step"...

La capacidad de los clones metastásicos para colonizar sitios distantes depende de su capacidad de proliferación y/o de su capacidad para sobrevivir en el microambiente del huésped sin una proliferación significativa. En este trabajo se presenta un modelo animal que permite la visualización cuantitativa de ambos tipos de colonización hepática por clones metastásicos.

Avanzada modelo animal de colorrectal metástasis en hígado: Técnicas de imagen y propiedades metastásicas de los clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

El objetivo general de este enfoque es modelar la colonización hepática por clones tumorales metastásicos generados por cánceres colorrectales, y utilizar este modelo para mejorar el diagnóstico y tratamiento de las metástasis hepáticas. Las observaciones clínicas indican la heterogeneidad de la enfermedad metastásica. Nuestro modelo permite capturar esta heterogeneidad con el fin de detectar genes asociados con enfermedad oligometastásica y polimetastásica.Y utilizar este conocimiento para mejorar la detección temprana y el tratamiento de la metástasis. La principal ventaja de nuestra técnica es que utilizamos líneas celulares monoclonales doblemente marcadas derivadas de pacientes con cáncer colorrectal, y podemos observar el desarrollo de metástasis hepáticas tanto in vivo como ex vivo. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia una terapia para enfermedades metastásicas.Nos proporciona la capacidad de probar cualquier fármaco potencial con una estimación cuantitativa del número de lesiones metastásicas y de la cinética de crecimiento de cada lesión. Después de generar células HCT116 marcadas con luciferasa y tdTomato y preparar los medios, reactivos e instrumentos según el protocolo descrito, siembre las células transfectadas en las siguientes densidades por pozo, en réplicas triples, en placas de 96 pocillos. Tras incubar las células durante cinco horas, cuantifique las intensidades fluorescentes de tdTomato utilizando un sistema IVIS, iniciando primero el software de imagen en el escritorio.Haga clic en el botón Inicializar para establecer el tiempo de adquisición de imágenes, la agrupación media, dos para la apertura (F/Stop), 535 para el filtro de excitación y 580 para el filtro de emisión. Coloque la placa de 96 pocillos en la estación de adquisición de imágenes y haga clic en Adquirir para comenzar la adquisición. Una vez adquirida la imagen, en la Paleta de Herramientas, haga clic en las herramientas de ROI y seleccione 12x8 a partir del icono de rendija.Cree 12x8 hendiduras para cubrir el área de la señal en la imagen de la placa de 96 pocillos y haga clic en la pestaña Mediciones. Observe una ventana con la tabla de mediciones de ROI con unidades de fotones por segundo, por estereorradián, por centímetro cuadrado. Una vez que las células alcancen una confluencia del 70 al 80 por ciento, aproximadamente una hora antes de la inyección en el bazo, agregue tripsina al 0,05 por ciento y EDTA 0,53 milimolar a las células para disociarlas.Después de incubar las células durante tres a cinco minutos, utilice un volumen igual de C-DMEM para neutralizar la tripsina. Pipetee cuidadosamente los cultivos para evitar la formación de grumos, luego use un contador automático de células para contarlas. Congele las células en suspensión en DBPS 1x a una concentración de 1,2 a 2 x 10⁶ células por 100 microlitros, pipeteando cuidadosamente para evitar grumos.A continuación, mantenga las células en hielo hasta la inyección, resuspendiéndolas ocasionalmente en el tubo. Después de administrar analgésicos y anestesiar un ratón hembra desnudo atímico de seis a ocho semanas de edad según el protocolo descrito en el texto, identifique el bazo como una zona púrpura visible externamente a través de la piel en el flanco izquierdo, y realice una incisión de ocho milímetros en la piel del flanco izquierdo justo por encima del órgano. A continuación, levante la pared abdominal y haga una pequeña incisión.Permita que el aire entre en la cavidad abdominal para que los órganos internos se alejen del sitio de la incisión. Luego amplíe la incisión en la pared abdominal hasta aproximadamente cinco milímetros. Los pasos demostrados para la inyección son fundamentales para el procedimiento.La fuga de células tumorales durante la inyección puede provocar metástasis extrahepáticas. La inyección debe realizarse lentamente, durante 30 a 60 segundos, con no más de 1,5 millones de células para prevenir la trombosis venosa portal. Exponga el bazo utilizando un hisopo de algodón para aplicar presión suavemente alrededor de la incisión.Si es necesario, se puede manipular suavemente la grasa pancreática para facilitar la exposición, sin lesionar el bazo. Utilizando una jeringa de un mililitro con una aguja de 27 gauge, inyecte 100 microlitros de células en la punta del bazo expuesto durante un período de 30 a 60 segundos. Al final de la inyección, coloque un microclip en el bazo antes de retirar la aguja, para evitar la fuga de la suspensión celular inyectada, y déjelo en su lugar durante cinco minutos.Cinco minutos después de la inyección, utilice un dispositivo de cauterización manual para realizar una esplenectomía con fines de hemostasia. Comience por el hilio esplénico en la cara anterior, pre-coagulando el lado proximal de los vasos junto con el tejido adiposo adyacente. Puede producirse sangrado esplénico en el sitio de inyección.El microclip se aplica en el bazo para prevenir la fuga de células tumorales y controlar la hemorragia esplénica. Los métodos de hemostasia pueden incluir cauterización, aplicación de presión durante tres a cinco minutos y ligadura con sutura si es necesario. Cierre la pared abdominal utilizando una sutura trenzada absorbible 5.0 y un solo punto horizontal.Luego, utilice una sutura mono-filamento no absorbible 4.0 para cerrar la piel, también con un solo punto horizontal. Monitoree el animal en el período postoperatorio, según el protocolo descrito en el texto. Para realizar la imagen bioluminiscente, después de anestesiar los ratones según el protocolo descrito en el texto, inyecte intraperitonealmente a los animales 150 microlitros de luciferina de luciérnaga previamente preparada.Coloque los ratones en un IVIS en posición supina con espaciadores entre los animales para minimizar la señal a los ratones adyacentes. Tres minutos después de la inyección de luciferina, tras inicializar el IVIS, seleccione luminiscencia, un tiempo de exposición de un segundo y agrupamiento medio. Haga clic en el botón Adquirir para comenzar la imagen, asegurándose de que la adquisición se realice consistentemente tres minutos después de la inyección de luciferina.Después de adquirir la imagen, aparecerán una ventana de imagen y una paleta de herramientas; haga clic en las herramientas de ROI y seleccione un número del uno al cinco en el icono circular que corresponde al número de ratones imagenados. Para definir las ROI, marque con un círculo el área de la señal luminiscente en la cavidad abdominal del ratón y luego haga clic en las mediciones del ROI como una unidad arbitraria de radiancia. Incluya un círculo adicional de ROI para el fondo.Cuatro semanas después de la inyección, para realizar tomografía de imágenes luminiscentes difusas, o DLIT, tras inicializar el IVIS, seleccione Asistente de imágenes, Bioluminiscencia y haga clic en Siguiente. Seleccione DLIT y haga clic en Siguiente. Seleccione sondas Firefly y haga clic en Siguiente.Seleccione Ratón como Sujeto de la Imagen, Auto para el Parámetro de Exposición C-13 Centímetro para Campo de Visión y 0,5 Centímetro como Tipo de Sujeto, y haga clic en Siguiente. Luego, haga clic en el botón Adquirir para comenzar la adquisición de imágenes. Después de adquirir una imagen, seleccione la pestaña Reconstrucción 3D DLIT, en la pestaña Analizar, y haga clic en Reconstruir para generar la imagen de reconstrucción 3D.Haga clic en Herramientas y Animación 3D. Luego, en la ventana de Animación 3D, seleccione Girar en sentido antihorario sobre el eje Y. Haga clic en Grabar y Guardar para guardar el archivo en un archivo con formato mov.Para realizar la imagenología fluorescente ex vivo, después de extraer y disecar hígados de ratones según el protocolo descrito, mida las intensidades fluorescentes de cada colonia tumoral utilizando el IVIS. Seleccione Fluorescencia, un Tiempo de Exposición de cuatro segundos, Binning Medio, 2 para F/Stop, 535 para el filtro de excitación y 580 para el filtro de emisión. Haga clic en el botón Adquirir para comenzar la imagenología.Después de adquirir la imagen, localice la ventana de imagen en la paleta de herramientas. Haga clic en Herramientas de ROI y seleccione 1 en el icono de círculo. Para definir las ROI, marque con un círculo el área de señal de colonias tumorales individuales en la imagen.Adquiera un círculo adicional de ROI del fondo, y luego haga clic en Mediciones del ROI como una unidad arbitraria de radiancia. Adquiera un círculo adicional de ROI del fondo. Finalmente, realice los cálculos según el protocolo descrito en el texto.Como se muestra aquí mediante bioluminiscencia, tres semanas después de la inyección en el bazo, los clones P1 y P2 de HCT116 L2T presentaron una mayor carga tumoral en comparación con los clones O1 y O2. Estos datos indicaron que los clones O1 y O2 pueden imitar una enfermedad oligometastásica, mientras que P1 y P2 representan una colonización metastásica agresiva y diseminada en el hígado. La cuantificación de la fluorescencia ex vivo del hígado, a las cuatro semanas posteriores a la inyección en el bazo, confirmó que los hígados de P1 y P2 tenían intensidades fluorescentes más altas en comparación con los de O1 y O2. La marcación fluorescente de los clones tumorales permitió identificar el número y tamaños de las colonias metastásicas individuales en el hígado.En general, las imágenes fluorescentes ex vivo fueron coherentes con los hallazgos macroscópicos, pero se detectaron mejor mediante imágenes fluorescentes las pequeñas colonias ocultas bajo la superficie. Como se muestra aquí, se contaron y midieron los números y tamaños de las colonias metastásicas en cada hígado, y se realizó una imagen fluorescente ex vivo en cada colonia metastásica para cada monoclonal. Como se observa en estas gráficas, el número total de metástasis en P1 fue mayor en comparación con P2, O1 y O2, mientras que el tamaño promedio de las colonias individuales fue mayor en P2 que en P1, O1 y O2. Nuestro modelo proporciona un enfoque para identificar nuevos genes de persuasión asociados con la heterogeneidad molecular de la metástasis.Estos genes pueden utilizarse como dianas para nuevos enfoques en el tratamiento de la metástasis. Nuestro modelo también puede emplearse para la validación de diferentes genes que codifican proteínas y genes no codificantes que surgen de las actuales bases de datos clínicas extensas, pero que aún no están definidos funcionalmente en el contexto de enfermedades metastásicas. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la delicadeza de la cirugía animal.Sin embargo, con práctica, es posible obtener buenos resultados en poco tiempo. Al realizar este procedimiento, es importante recordar seguir las directrices para cirugía en animales, controlar cuidadosamente la hemorragia y prevenir la fuga de la suspensión de células tumorales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Dos técnicas se pueden utilizar para establecer este modelo: la inyección de una suspensión de células de cáncer en la pared del ciego o el trasplante de un trozo de tumor subcutáneo en el ciego. Este modelo es útil para el estudio de la evolución natural del cáncer colorrectal y ensayo de nuevos agentes terapéuticos contra el cáncer colorrectal.

Modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal

En este artículo se describe un procedimiento para la inducción de tumores en el hígado ortotópico bioluminiscentes en ratones, y el posterior análisis del crecimiento del tumor confinado al hígado, con imágenes en directo toda la luminiscencia del cuerpo.

Murino hepática Bioluminiscente modelo tumoral

Los modelos animales se utilizan con frecuencia para estudiar la metástasis del cáncer de hueso. En este protocolo vamos a describir dos métodos comunes de la inoculación del tumor para los estudios de metástasis óseas y describir brevemente algunos de los análisis utilizados para supervisar y cuantificar estos modelos.

Los modelos de metástasis en los huesos

Este video describe el protocolo para establecer un modelo de ratón de metástasis espontánea de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer colorrectal o PDX. Estos modelos de xenoinjertos imitan parcialmente las características de los carcinomas humanos y comprenden los aspectos críticos de las neoplasias malignas humanas, incluidas la invasión y la metástasis.

Modelos de ratón con metástasis espontánea: una plataforma para estudiar el potencial metastásico de las células de cáncer colorrectal inyectadas ortotópicamente

Un modelo preclínico, murino de metástasis hepáticas realiza a través de una técnica de inyección hemispleen.

A preclínicos modelo murino de metástasis hepática

Se desarrolló un procedimiento quirúrgico para administrar células tumorales mamarias al hígado murino mediante inyección en la vena porta. Este modelo permite la investigación de las etapas tardías de la metástasis hepática en un huésped totalmente competente para el sistema inmunitario, incluida la extravasación de células tumorales, la siembra, la supervivencia y el crecimiento metastásico en el hígado.

Una inyección Modelo vena porta del hígado para estudiar la metástasis del cáncer de mama

Describimos el establecimiento de tumores colorrectales ortotópicos mediante la inyección de células tumorales o organoides en el ciego de ratones y el subsiguiente aislamiento de células tumorales circulantes (CTC) de este modelo.

Aislamiento de células tumorales circulantes en un modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal

Este protocolo describe la generación de modelos de xenoinjerto ortotópico derivados del paciente inculcando intravesicamente células carcinoma de células uroteliales de alto grado o inyectando intrarectalmente células cancerosas colorrectales en combinación diabética/grave no obesa ratones de inmunodeficiencia (NOD/SCID) para el crecimiento tumoral primario y metástasis espontáneas bajo la influencia de células estromales de ganglios linfáticos, lo que imita la progresión de las enfermedades...

Modelos de xenoinjerto ortotópico derivados del paciente para el carcinoma de células uroteliales humanas y el crecimiento tumoral del cáncer colorrectal y la metástasis espontánea

Describimos en detalle un modelo de tumor de metástasis hepáticas de cáncer colorrectal clínicamente relevante (CRLM) y la influencia de la reperfusión de isquemia hepática (I/R) en el crecimiento tumoral y la metástasis. Este modelo puede ayudar a entender mejor los mecanismos subyacentes promoción inducida por cirugía del crecimiento metastásico hepático.

Modelo murino de tumores hepáticos metastásicos en el escenario de la lesión por reperfusión de isquemia

El enfoque descrito combina ensayos experimentales de metástasis de la vena de cola con imágenes animales vivos in vivo para permitir el monitoreo en tiempo real de la formación y el crecimiento de metástasis de cáncer de mama, además de la cuantificación del número y tamaño de metástasis en los pulmones.

Uso combinado de ensayos de metástasis de vena de cola e imágenes en tiempo real en vivo en vivo para cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama y la carga en los pulmones

La inyección de organoides de cáncer colorrectal (CCR) en la vena porta genera metástasis hepáticas ricas en estroma. Este modelo de ratón de metástasis hepática del CCR representa una herramienta útil para estudiar las interacciones tumor-estroma y desarrollar nuevas terapias dirigidas al estroma, como las terapias génicas mediadas por virus adenoasociadas.

Inyección en la vena porta de organoides de cáncer colorrectal para estudiar la metástasis hepática del estroma

Aprende a modelar la colonización hepática por clones tumorales metastásicos de cáncer colorrectal usando líneas celulares monoclonales doble marcadas. Este método permite visualizar in vivo y ex vivo el desarrollo de metástasis hepáticas para identificar genes asociados con oligometástasis y polimetástasis.

Avanzada modelo animal de colorrectal metástasis en hígado: Técnicas de imagen y propiedades metastásicas de los clones

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