Avanzada modelo animal de colorrectal metástasis en hígado: Técnicas de imagen y propiedades metastásicas de los clones

El objetivo general de este enfoque es modelar la colonización hepática por clones de tumores metastásicos generados por cánceres colorrectales, y utilizar este modelo para mejorar el diagnóstico y el tratamiento de las metástasis hepáticas. Las observaciones clínicas indican la heterogeneidad de la enfermedad metastásica. Nuestro modelo proporciona la capacidad de capturar esta heterogeneidad para detectar genes que están asociados con la enfermedad oligometastásica y polimetastásica.

Y utilizar este conocimiento para mejorar la detección precoz y el tratamiento de las metástasis. La principal ventaja de nuestra técnica es que utilizamos líneas celulares monoclonales de doble marcaje derivadas de pacientes con cáncer colorrectal, y podemos observar el desarrollo de metástasis hepáticas tanto in vivo como ex vivo. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia una terapia de la enfermedad metastásica.

Nos da la capacidad de probar cualquier fármaco potencial con una estimación cuantitativa del número de lesiones metastásicas y la cinética de crecimiento de cada lesión. Después de generar células HCT116 marcadas con luciferasa tdTomato y preparar los medios, reactivos e instrumentos, de acuerdo con el protocolo de texto, coloque las células transpeccionadas a las siguientes densidades por pocillo, por triplicado, en placas de 96 pocillos. Después de la incubación de las células durante cinco horas, cuantifique las intensidades fluorescentes de tdTomato utilizando un sistema IVIS iniciando el software de imagen en el escritorio.

Haga clic en el botón Inicializar para inicializar el tiempo de imagen, la agrupación de medios, dos para F/Stop, 535 para el filtro de excitación y 580 para el filtro de emisión. Coloque la placa de 96 pocillos en la estación de imágenes y haga clic en Adquirir para iniciar la toma de imágenes. Una vez adquirida la imagen, en la paleta de herramientas, haga clic en Herramientas de ROI y seleccione 12x8 en el icono de hendidura.

Cree rendijas de 12x8 para cubrir el área de la señal en la imagen de la placa de 96 pocillos y haga clic en la pestaña Mediciones. Observe una ventana con la tabla de mediciones de ROI con unidades de fotones por segundo, por esteradiano, por centímetro cuadrado. Una vez que las células alcancen el 70 al 80 por ciento de confluencia, aproximadamente una hora antes de la inyección en el bazo, agregue 0.05 por ciento de tripsina y 0.53 milimolar de EDTA a las células para disociarlas.

Después de incubar las células durante tres a cinco minutos, use un volumen igual de C-DMEM para neutralizar la tripsina. Pipetee minuciosamente los cultivos para evitar la aglomeración, luego use un contador automático de células para contar las células. Congele las células suspendidas en 1x DBPS a una concentración de 1,2 a 2 x 10 por 6 células por cada 100 microlitros, pipeteando a fondo para evitar la formación de grumos.

Luego, mantenga las células en hielo hasta la inyección, volviéndolas a suspender ocasionalmente en el tubo. Después de administrar analgésicos y anestesiar a una hembra de ratón atímico desnudo de seis a ocho semanas de edad de acuerdo con el protocolo de texto, identifique el bazo como un área púrpura vista externamente a través de la piel en el flanco izquierdo, y haga una incisión de ocho milímetros en el flanco izquierdo en la piel justo encima del órgano. A continuación, levante la pared abdominal y haga una pequeña incisión.

Permita que entre aire en la cavidad abdominal para que los órganos internos se alejen del sitio de la incisión. A continuación, amplíe la incisión de la pared abdominal a aproximadamente cinco milímetros. Los pasos demostrados para la inyección son críticos para el procedimiento.

La fuga de células tumorales durante la inyección puede provocar metástasis extrahepáticas. La inyección debe realizarse lentamente, durante 30 a 60 segundos, con no más de 1,5 millones de células para prevenir la trombosis venosa portal. Exponga el bazo usando un hisopo de algodón para aplicar presión suavemente alrededor de la incisión.

Si es necesario, la grasa pancreática se puede manipular suavemente para ayudar con la exposición, a fin de no lesionar el bazo. Con una jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 27, durante un período de 30 a 60 segundos, inyecte 100 microlitros de células en la punta del bazo expuesto. Al final de la inyección, coloque un microclip en el bazo antes de retirar la aguja, para evitar fugas de la suspensión celular inyectada, y déjelo en su lugar durante cinco minutos.

Cinco minutos después de la inyección, use un dispositivo de cauterización manual para realizar una esplenectomía para la hemostasia. Comience con el hilio esplénico en el lado anterior precoagulando el lado proximal de los vasos con tejido graso adyacente. Puede producirse sangrado esplénico en el lugar de la inyección.

El microclip se aplica en el bazo para evitar la fuga de células tumorales y controlar el sangrado esplénico. Los métodos de hemostasia pueden incluir cauterización, mantener la presión durante tres a cinco minutos y ligadura de sutura si es necesario. Cierre la pared abdominal con una sutura trenzada reabsorbible 5.0 y una sola puntada horizontal.

A continuación, utiliza una sutura monofilamento no absorbible 4.0 para cerrar la piel, también con una sola puntada horizontal. Monitorear al animal postoperatorio, de acuerdo con el protocolo de texto. Para realizar imágenes bioluminiscentes, después de anestesiar a los ratones según el protocolo de texto, inyectar intraperitonealmente a los animales 150 microlitros de luciferina de luciérnaga previamente preparada.

Coloque a los ratones en un IVIS en posición supina con espaciadores entre los animales para minimizar la señal a los ratones adyacentes. Tres minutos después de la inyección de luciferina, después de inicializar el IVIS, seleccione luminiscente, tiempo de exposición de un segundo y agrupamiento de medio. Haga clic en el botón Adquirir para iniciar la obtención de imágenes, asegurándose de que las imágenes se realicen de manera constante tres minutos después de la inyección de luciferina.

Una vez adquirida la imagen y apareciendo una ventana de imagen y una paleta de herramientas, haga clic en Herramientas de ROI y seleccione un número del uno al cinco en el icono del círculo que corresponda al número de ratones de los que se ha tomado una imagen. Para definir el ROI, encierre en un círculo el área de la señal luminiscente en la cavidad abdominal del ratón y, a continuación, haga clic en las mediciones del ROI como una unidad arbitraria de radiancia. Incluye un círculo de ROI adicional para el fondo.

Cuatro semanas después de la inyección, para llevar a cabo la tomografía de imagen luminiscente difusa, o DLIT, después de inicializar el IVIS, seleccione Imaging Wizard, Bioluminiscence y haga clic en Next (Siguiente). Seleccione DLIT y haga clic en Siguiente. Seleccione Sondas Firefly y haga clic en Siguiente.

Seleccione Ratón para Sujeto de la imagen, Automático para el parámetro de exposición C-13 Centímetro para Campo de visión y 0,5 centímetro como Tipo de sujeto y haga clic en Siguiente. A continuación, haga clic en el botón Adquirir para iniciar la toma de imágenes. Después de adquirir una imagen, seleccione la pestaña Reconstrucción 3D de DLIT, en la pestaña Analizar, y haga clic en Reconstruir para generar la imagen de reconstrucción 3D.

Haga clic en Herramientas y animación 3D. A continuación, en la ventana Animación 3D, seleccione Girar CCW en el eje Y. Haga clic en Grabar y guardar para guardar el archivo en un archivo en formato mov.

Para llevar a cabo imágenes fluorescentes ex vivo, después de recolectar y diseccionar hígados de ratones de acuerdo con el protocolo de texto, mida las intensidades fluorescentes para cada colonia tumoral utilizando el IVIS. Al seleccionar Fluorescencia, cuatro segundos de Tiempo de exposición, Agrupación media, 2 para F/Stop, 535 para el filtro de excitación y 580 para el filtro de emisión. Haga clic en el botón Adquirir para iniciar la creación de imágenes.

Después de adquirir la imagen, localice la ventana Imagen en la Paleta de herramientas. Haga clic en Herramientas de ROI y seleccione 1 en el icono del círculo. Para definir el retorno de la inversión, encierre en un círculo el área de señal de las colonias tumorales individuales en la imagen.

Adquiera un círculo de ROI adicional del fondo y, a continuación, haga clic en Mediciones del ROI como una unidad arbitraria de radiancia. Adquiera un círculo de ROI adicional del fondo. Por último, realice los cálculos según el protocolo de texto.

Como se muestra aquí por bioluminiscencia, tres semanas después de la inyección en el bazo, los clones P1 y P2 de HCT116 L2T tenían una mayor carga tumoral, en comparación con los clones O1 y O2. Estos datos indicaron que los clones O1 y O2 pueden imitar la enfermedad oligometastásica, mientras que P1 y P2 representan una colonización metastásica agresiva y generalizada del hígado. La cuantificación de la fluorescencia ex vivo del hígado, a partir de cuatro semanas después de la inyección en el bazo, confirmó que P1 y P2 tenían intensidades fluorescentes más altas en comparación con los hígados O1 y O2. El marcaje fluorescente de clones tumorales identificó el número y el tamaño de las colonias metastásicas individuales en el hígado.

En general, las imágenes fluorescentes ex vivo fueron consistentes con los hallazgos macroscópicos, pero las pequeñas colonias ocultas bajo la superficie se detectaron mejor mediante imágenes fluorescentes. Como se muestra aquí, se contaron y midieron el número y el tamaño de las colonias metastásicas en cada hígado, y se realizaron imágenes de fluorescencia ex vivo en cada colonia metastásica para cada monoclon. Como se muestra en estos gráficos, el número total de metástasis en P1 fue mayor en comparación con P2, O1 y O2, mientras que el tamaño promedio de las colonias individuales fue mayor en P2 que en P1, O1 y O2. Nuestro modelo proporciona una aproximación para identificar nuevos genes de persuasión asociados con la heterogeneidad molecular de la metástasis.

Estos genes se pueden utilizar como dianas para nuevos enfoques para el tratamiento de la metástasis. Nuestro modelo también se puede utilizar para la validación de diferentes genes codificantes y no codificantes de proteínas que emergen de las grandes bases de datos clínicas actuales, pero que aún no están definidos funcionalmente en el contexto de la enfermedad metastásica. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, debido a la delicadeza de la cirugía animal.

Sin embargo, con la práctica, se pueden lograr buenos resultados en poco tiempo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar seguir las pautas de cirugía con animales, controlar cuidadosamente el sangrado y evitar la fuga de la suspensión de células tumorales.