Avanzada modelo animal de colorrectal metástasis en hígado: Técnicas de imagen y propiedades metastásicas de los clones

El objetivo general de este enfoque es modelar la colonización hepática por clones tumorales metastásicos generados por cánceres colorrectales, y utilizar este modelo para mejorar el diagnóstico y tratamiento de las metástasis hepáticas. Las observaciones clínicas indican la heterogeneidad de la enfermedad metastásica. Nuestro modelo permite capturar esta heterogeneidad con el fin de detectar genes asociados con enfermedad oligometastásica y polimetastásica.

Y utilizar este conocimiento para mejorar la detección temprana y el tratamiento de la metástasis. La principal ventaja de nuestra técnica es que utilizamos líneas celulares monoclonales doblemente marcadas derivadas de pacientes con cáncer colorrectal, y podemos observar el desarrollo de metástasis hepáticas tanto in vivo como ex vivo. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia una terapia para enfermedades metastásicas.

Nos proporciona la capacidad de probar cualquier fármaco potencial con una estimación cuantitativa del número de lesiones metastásicas y de la cinética de crecimiento de cada lesión. Después de generar células HCT116 marcadas con luciferasa y tdTomato y preparar los medios, reactivos e instrumentos según el protocolo descrito, siembre las células transfectadas en las siguientes densidades por pozo, en réplicas triples, en placas de 96 pocillos. Tras incubar las células durante cinco horas, cuantifique las intensidades fluorescentes de tdTomato utilizando un sistema IVIS, iniciando primero el software de imagen en el escritorio.

Haga clic en el botón Inicializar para establecer el tiempo de adquisición de imágenes, la agrupación media, dos para la apertura (F/Stop), 535 para el filtro de excitación y 580 para el filtro de emisión. Coloque la placa de 96 pocillos en la estación de adquisición de imágenes y haga clic en Adquirir para comenzar la adquisición. Una vez adquirida la imagen, en la Paleta de Herramientas, haga clic en las herramientas de ROI y seleccione 12x8 a partir del icono de rendija.

Cree 12x8 hendiduras para cubrir el área de la señal en la imagen de la placa de 96 pocillos y haga clic en la pestaña Mediciones. Observe una ventana con la tabla de mediciones de ROI con unidades de fotones por segundo, por estereorradián, por centímetro cuadrado. Una vez que las células alcancen una confluencia del 70 al 80 por ciento, aproximadamente una hora antes de la inyección en el bazo, agregue tripsina al 0,05 por ciento y EDTA 0,53 milimolar a las células para disociarlas.

Después de incubar las células durante tres a cinco minutos, utilice un volumen igual de C-DMEM para neutralizar la tripsina. Pipetee cuidadosamente los cultivos para evitar la formación de grumos, luego use un contador automático de células para contarlas. Congele las células en suspensión en DBPS 1x a una concentración de 1,2 a 2 x 10⁶ células por 100 microlitros, pipeteando cuidadosamente para evitar grumos.

A continuación, mantenga las células en hielo hasta la inyección, resuspendiéndolas ocasionalmente en el tubo. Después de administrar analgésicos y anestesiar un ratón hembra desnudo atímico de seis a ocho semanas de edad según el protocolo descrito en el texto, identifique el bazo como una zona púrpura visible externamente a través de la piel en el flanco izquierdo, y realice una incisión de ocho milímetros en la piel del flanco izquierdo justo por encima del órgano. A continuación, levante la pared abdominal y haga una pequeña incisión.

Permita que el aire entre en la cavidad abdominal para que los órganos internos se alejen del sitio de la incisión. Luego amplíe la incisión en la pared abdominal hasta aproximadamente cinco milímetros. Los pasos demostrados para la inyección son fundamentales para el procedimiento.

La fuga de células tumorales durante la inyección puede provocar metástasis extrahepáticas. La inyección debe realizarse lentamente, durante 30 a 60 segundos, con no más de 1,5 millones de células para prevenir la trombosis venosa portal. Exponga el bazo utilizando un hisopo de algodón para aplicar presión suavemente alrededor de la incisión.

Si es necesario, se puede manipular suavemente la grasa pancreática para facilitar la exposición, sin lesionar el bazo. Utilizando una jeringa de un mililitro con una aguja de 27 gauge, inyecte 100 microlitros de células en la punta del bazo expuesto durante un período de 30 a 60 segundos. Al final de la inyección, coloque un microclip en el bazo antes de retirar la aguja, para evitar la fuga de la suspensión celular inyectada, y déjelo en su lugar durante cinco minutos.

Cinco minutos después de la inyección, utilice un dispositivo de cauterización manual para realizar una esplenectomía con fines de hemostasia. Comience por el hilio esplénico en la cara anterior, pre-coagulando el lado proximal de los vasos junto con el tejido adiposo adyacente. Puede producirse sangrado esplénico en el sitio de inyección.

El microclip se aplica en el bazo para prevenir la fuga de células tumorales y controlar la hemorragia esplénica. Los métodos de hemostasia pueden incluir cauterización, aplicación de presión durante tres a cinco minutos y ligadura con sutura si es necesario. Cierre la pared abdominal utilizando una sutura trenzada absorbible 5.0 y un solo punto horizontal.

Luego, utilice una sutura mono-filamento no absorbible 4.0 para cerrar la piel, también con un solo punto horizontal. Monitoree el animal en el período postoperatorio, según el protocolo descrito en el texto. Para realizar la imagen bioluminiscente, después de anestesiar los ratones según el protocolo descrito en el texto, inyecte intraperitonealmente a los animales 150 microlitros de luciferina de luciérnaga previamente preparada.

Coloque los ratones en un IVIS en posición supina con espaciadores entre los animales para minimizar la señal a los ratones adyacentes. Tres minutos después de la inyección de luciferina, tras inicializar el IVIS, seleccione luminiscencia, un tiempo de exposición de un segundo y agrupamiento medio. Haga clic en el botón Adquirir para comenzar la imagen, asegurándose de que la adquisición se realice consistentemente tres minutos después de la inyección de luciferina.

Después de adquirir la imagen, aparecerán una ventana de imagen y una paleta de herramientas; haga clic en las herramientas de ROI y seleccione un número del uno al cinco en el icono circular que corresponde al número de ratones imagenados. Para definir las ROI, marque con un círculo el área de la señal luminiscente en la cavidad abdominal del ratón y luego haga clic en las mediciones del ROI como una unidad arbitraria de radiancia. Incluya un círculo adicional de ROI para el fondo.

Cuatro semanas después de la inyección, para realizar tomografía de imágenes luminiscentes difusas, o DLIT, tras inicializar el IVIS, seleccione Asistente de imágenes, Bioluminiscencia y haga clic en Siguiente. Seleccione DLIT y haga clic en Siguiente. Seleccione sondas Firefly y haga clic en Siguiente.

Seleccione Ratón como Sujeto de la Imagen, Auto para el Parámetro de Exposición C-13 Centímetro para Campo de Visión y 0,5 Centímetro como Tipo de Sujeto, y haga clic en Siguiente. Luego, haga clic en el botón Adquirir para comenzar la adquisición de imágenes. Después de adquirir una imagen, seleccione la pestaña Reconstrucción 3D DLIT, en la pestaña Analizar, y haga clic en Reconstruir para generar la imagen de reconstrucción 3D.

Haga clic en Herramientas y Animación 3D. Luego, en la ventana de Animación 3D, seleccione Girar en sentido antihorario sobre el eje Y. Haga clic en Grabar y Guardar para guardar el archivo en un archivo con formato mov.

Para realizar la imagenología fluorescente ex vivo, después de extraer y disecar hígados de ratones según el protocolo descrito, mida las intensidades fluorescentes de cada colonia tumoral utilizando el IVIS. Seleccione Fluorescencia, un Tiempo de Exposición de cuatro segundos, Binning Medio, 2 para F/Stop, 535 para el filtro de excitación y 580 para el filtro de emisión. Haga clic en el botón Adquirir para comenzar la imagenología.

Después de adquirir la imagen, localice la ventana de imagen en la paleta de herramientas. Haga clic en Herramientas de ROI y seleccione 1 en el icono de círculo. Para definir las ROI, marque con un círculo el área de señal de colonias tumorales individuales en la imagen.

Adquiera un círculo adicional de ROI del fondo, y luego haga clic en Mediciones del ROI como una unidad arbitraria de radiancia. Adquiera un círculo adicional de ROI del fondo. Finalmente, realice los cálculos según el protocolo descrito en el texto.

Como se muestra aquí mediante bioluminiscencia, tres semanas después de la inyección en el bazo, los clones P1 y P2 de HCT116 L2T presentaron una mayor carga tumoral en comparación con los clones O1 y O2. Estos datos indicaron que los clones O1 y O2 pueden imitar una enfermedad oligometastásica, mientras que P1 y P2 representan una colonización metastásica agresiva y diseminada en el hígado. La cuantificación de la fluorescencia ex vivo del hígado, a las cuatro semanas posteriores a la inyección en el bazo, confirmó que los hígados de P1 y P2 tenían intensidades fluorescentes más altas en comparación con los de O1 y O2. La marcación fluorescente de los clones tumorales permitió identificar el número y tamaños de las colonias metastásicas individuales en el hígado.

En general, las imágenes fluorescentes ex vivo fueron coherentes con los hallazgos macroscópicos, pero se detectaron mejor mediante imágenes fluorescentes las pequeñas colonias ocultas bajo la superficie. Como se muestra aquí, se contaron y midieron los números y tamaños de las colonias metastásicas en cada hígado, y se realizó una imagen fluorescente ex vivo en cada colonia metastásica para cada monoclonal. Como se observa en estas gráficas, el número total de metástasis en P1 fue mayor en comparación con P2, O1 y O2, mientras que el tamaño promedio de las colonias individuales fue mayor en P2 que en P1, O1 y O2. Nuestro modelo proporciona un enfoque para identificar nuevos genes de persuasión asociados con la heterogeneidad molecular de la metástasis.

Estos genes pueden utilizarse como dianas para nuevos enfoques en el tratamiento de la metástasis. Nuestro modelo también puede emplearse para la validación de diferentes genes que codifican proteínas y genes no codificantes que surgen de las actuales bases de datos clínicas extensas, pero que aún no están definidos funcionalmente en el contexto de enfermedades metastásicas. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la delicadeza de la cirugía animal.

Sin embargo, con práctica, es posible obtener buenos resultados en poco tiempo. Al realizar este procedimiento, es importante recordar seguir las directrices para cirugía en animales, controlar cuidadosamente la hemorragia y prevenir la fuga de la suspensión de células tumorales.