Name: Microglia como una biosensor sustituto para determinar la neurotoxicidad de nanopartículas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprende a usar microglía como biosensor sustituto para evaluar la neurotoxicidad de nanopartículas en un modelo in vitro. Este método permite determinar factores neurotóxicos sin estudios prolongados en roedores.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue financiado por el Departamento de Asuntos de Veteranos de EE. UU. BLR&D IK2 BX001686 (a TAB), y subvenciones de la Universidad de Minnesota Healthy Foods, Healthy Lives Institute (a CMD, JPN y TAB) y la Fundación de Investigación y Educación Médica de Veteranos de Minnesota (a TAB). Agradecemos a los Dres. Philippe Marambaud (Instituto Feinstein de Investigación Médica, Manhasset, NY) y Weihua Zhao (Hospital Metodista, Houston, TX) por proporcionar la línea celular BV2.

1. Microglial Mantenimiento de Cultivos Celulares <ol><li> medio de cultivo celular caliente (medio Eagle modificado de Dulbecco; DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina / neomicina (PSN) a 37 ° C. </li><li> Obtener material congelado de las células microgliales BV2 en el paso 18 - 25 de almacenamiento a -80 ° C. Descongelar rápidamente las células en 37 ° C baño de agua. </li><li> Transferir suavemente las células a un matraz de ventilación 75 cm 2 que contiene medios de cultivo 10 ml de células. </li><li> Incubar frasco en 5% de CO 2 a 37 ° C. Aspirar los medios de comunicación después de 24 horas y reemplazar con medio fresco. Se cultivan las células hasta aproximadamente el 70 - 80% de confluencia. </li></ol> 2. Contar las células y que platean <ol><li> En un baño de agua a 37 ° C, DMEM caliente y una solución 1x-tripsina-EDTA. </li><li> Aspirar los medios de las células y añadir 500 l de tripsina. Se incuba a 37 ° C durante 2 - 5 min. </li><li> El uso de un raspador, eliminar las células del matraz y suspender en 5 mlde DMEM. Pasar las células a través de un filtro de 70 micras en un tubo de 50 ml tres veces. </li><li> Recuento de células utilizando un hemocitómetro y semilla de 8.000 células / pocillo en una placa de fondo negro amuralladas claro en un volumen final de 200 l DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de PSN. Incubar la placa en 5% de CO 2 a 37 ° C durante 24 horas. </li><li> Eliminar las viejas DMEM y reemplazar con 200 l de DMEM calentado suplementado con 1% de PSN a suero de hambre microglia. Incubar la placa en 5% de CO 2 a 37 ° C durante 24 horas. </li></ol> 3. Activación de microglía <ol><li> En tubos separados, diluir AGNPS (0,01, 0,05 o 0,1 mg / ml) y el vehículo / control neutro (citrato de sodio, 0,04 mM) en DMEM libre de suero suplementado con 1% de PSN a concentraciones de trabajo finales. </li><li> Eliminar 100 l de los medios de comunicación de cada pocillo y reemplazar con 100 l de compuesto de tratamiento apropiado. </li><li> Incubar la placa en 5% de CO 2 a 37 ° C durante 24 horas. </li></ol> 4. Filtrado medio condicionado <ol><li> Recoger 200 l de sobrenadante de medios de cada pocillo y transferir a un filtro (corte de peso molecular de 10 kDa) con el tubo de recogida (1,5 a 2 ml de capacidad). </li><li> Centrifugar a 14.000 xg a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Desechar el flujo continuo (sobrenadante con partículas) y colocar el filtro al revés en un nuevo tubo de recogida. </li><li> Centrifugar a 1000 xg a temperatura ambiente durante 2 min. NOTA: Los medios de comunicación filtrada resultante (que contiene citoquinas secretadas) se concentra por seis veces. </li><li> Llevar el volumen del concentrado a 400 l con DMEM fresco suplementado con 10% de FBS y 1% de PSN y almacenar en hielo. NOTA: Para garantizar AGNPS residuales se eliminan de los medios de comunicación filtradas, se genera una concentración AgNP basado en el pico característico en alrededor de 390 - 420 nm 10. Brevemente, se preparan alícuotas de AGNPS sin filtrar (0, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, y 0,2 g / ml como se describe en el paso 3.1) y se filtrócontrol de vehículo (citrato de sodio, 0,04 mM) en DMEM libre de suero. Alícuota de 50 l de muestras y patrones filtró en un negro amuralladas placa de fondo claro. El uso de un espectrofotómetro, medir la absorbancia a 390 - 410 nm y comparar las lecturas de la curva de concentración AgNP. Si muestras filtradas tienen el mismo valor de la absorbancia como la muestra de control del vehículo, se puede suponer AGNPS residuales se eliminan. </li><li> Usar medio de los medios filtrados para determinar siguientes instrucciones de secreción de TNF-α a partir de un kit disponible en el mercado. </li></ol> 5. hipotalámico Mantenimiento de Cultivos Celulares <ol><li> medio de cultivo celular caliente DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de PSN a 37 ° C. </li><li> Obtener material congelado de células del hipotálamo en el paso 18 (mHypo-A1 / 2) - 25 almacenados a 80 ° C. Descongelar rápidamente las células en 37 ° C baño de agua. </li><li> Transferir suavemente las células a un matraz de ventilación 75 cm 2 que contiene medios de cultivo 10 ml de células. </li><li> Incubar matraz en 5% de CO 2 </sub&gt; a 37 ° C. Aspirar los medios de comunicación después de 24 horas y reemplazar con medio fresco. Se cultivan las células hasta que aproximadamente a 70 - 80% de confluencia. </li></ol> 6. Determinación de la toxicidad celular hipotalámica <ol><li> DMEM caliente y una solución 1x-tripsina-EDTA en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Aspirar los medios de comunicación a partir de células hipotalámicas y añadir 500 l de tripsina. Se incuba a 37 ° C durante 2 - 5 min. Extraer células del matraz utilizando un raspador como se describe anteriormente en el paso 2. </li><li> Recuento de células utilizando un hemocitómetro y la placa células hipotalámicas a 5.000 células / pocillo en un negro amuralladas placa de fondo claro en un volumen final de DMEM 200 l suplementado con 10% de FBS y 1% de PSN y se incuba durante la noche en 5% de CO2 a 37 ° C . </li><li> Eliminar 100 l de viejos medios utilizando un pipeteador multicanal y añadir 100 l de medio acondicionado concentrado se filtraron, a una concentración final de 1x. </li><li> Incubar la placa en 5% de CO 2 a 37 ° C durante 24 horas. </li><li> Añadir 221; l de reactivo de resazurina y se incuba la placa durante 20 minutos en 5% de CO 2 a 37 ° C. </li><li> El uso de un espectrofotómetro multimodo, ficha fluorescencia (560 nm EX / EM 590 nm) para medir la viabilidad celular. Informar de los resultados como unidades de fluorescencia relativa (RFU). </li></ol>

<ol><li>Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution%3A+mechanisms+of+neuroinflammation+and+CNS+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease.</a> Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).</li>
<li>Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+daily+inhalation+rates+for+health+risk+assessment+in+overweight%2Fobese+children%2C+adults%2C+and+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22Risk+Anal%22%5BJournal%5D)">Physiological daily inhalation rates for health risk assessment in overweight/obese children, adults, and elderly.</a> Risk Anal. 34, 567-582 (2014).</li>
<li>Jerrett, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic-related+air+pollution+and+obesity+formation+in+children%3A+a+longitudinal%2C+multilevel+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health%22%5BJournal%5D)">Traffic-related air pollution and obesity formation in children: a longitudinal, multilevel analysis.</a> Environ Health. 13, 49(2014).</li>
<li>Kraft, A. D., Harry, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+microglia+and+neuroinflammation+relevant+to+environmental+exposure+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Environ+Res+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity.</a> Int J Environ Res Public Health. 8, 2980-3018 (2011).</li>
<li>Duffy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+orexin+A+signaling+in+dietary+palmitic+acid-activated+microglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Role of orexin A signaling in dietary palmitic acid-activated microglial cells.</a> Neurosci Lett. 606, 140-144 (2015).</li>
<li>Butterick, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+caspase+multiplexing+assay+to+determine+apoptosis+in+a+hypothalamic+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+cell+viability+and+proliferation+in+hydrogel-encapsulated+system+by+resazurin+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay.</a> Appl Biochem Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).</li>
<li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf%2Fv-myc+carrying+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus.</a> J Neuroimmunol. 27, 229-237 (1990).</li>
<li>Belsham, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor+recruitment+of+glucagon-like+peptide-1+mediates+neurogenesis%2C+allowing+immortalization+of+adult+murine+hypothalamic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor recruitment of glucagon-like peptide-1 mediates neurogenesis, allowing immortalization of adult murine hypothalamic neurons.</a> FASEB J. 23, 4256-4265 (2009).</li>
<li>Paramelle, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+to+estimate+the+concentration+of+citrate+capped+silver+nanoparticles+from+UV-visible+light+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A rapid method to estimate the concentration of citrate capped silver nanoparticles from UV-visible light spectra.</a> Analyst. 139, 4855-4861 (2014).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+exposure+to+air+pollution+particles+increases+the+risk+of+obesity+and+metabolic+syndrome%3A+findings+from+a+natural+experiment+in+Beijing%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Chronic exposure to air pollution particles increases the risk of obesity and metabolic syndrome: findings from a natural experiment in Beijing.</a> FASEB J. , (2016).</li>
<li>Levesque, S., Surace, M. J., McDonald, J., Block, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution+%26+the+brain%3A+Subchronic+diesel+exhaust+exposure+causes+neuroinflammation+and+elevates+early+markers+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Air pollution & the brain: Subchronic diesel exhaust exposure causes neuroinflammation and elevates early markers of neurodegenerative disease.</a> J Neuroinflammation. 8, 105(2011).</li>
<li>Block, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outdoor+air+pollution+and+brain+health+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">The outdoor air pollution and brain health workshop.</a> Neurotoxicology. 33, 972-984 (2012).</li>
<li>Carson, M. J., Crane, J., Xie, A. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+CNS+microglia%3A+the+quest+to+identify+predictive+models%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Dis+Models%22%5BJournal%5D)">Modeling CNS microglia: the quest to identify predictive models.</a> Drug Discov Today Dis Models. 5, 19-25 (2008).</li>
<li>Valdearcos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+dictate+the+impact+of+saturated+fat+consumption+on+hypothalamic+inflammation+and+neuronal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Microglia dictate the impact of saturated fat consumption on hypothalamic inflammation and neuronal function.</a> Cell Rep. 9, 2124-2138 (2014).</li>
<li>Perry, V. H., Holmes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+priming+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Microglial priming in neurodegenerative disease.</a> Nat Rev Neurol. 10, 217-224 (2014).</li>
<li>Block, M. L., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+microglial+activation+and+progressive+dopaminergic+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity.</a> Biochem Soc Trans. 35, 1127-1132 (2007).</li>
<li>Vincenti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Microglia+Response+during+the+Time+Course+of+Chronic+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Defining the Microglia Response during the Time Course of Chronic Neurodegeneration.</a> J Virol. 90, 3003-3017 (2015).</li>
<li>Grabert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+brain+region-dependent+diversity+and+selective+regional+sensitivities+to+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging.</a> Nat Neurosci. 19, 504-516 (2016).</li>
<li>Lull, M. E., Block, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+and+chronic+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Microglial activation and chronic neurodegeneration.</a> Neurotherapeutics. 7, 354-365 (2010).</li>
<li>Oeckinghaus, A., Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+in+NF-kappaB+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Crosstalk in NF-kappaB signaling pathways.</a> Nat Immunol. 12, 695-708 (2011).</li>
<li>Gifford, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-modified+gold+nanoparticles+for+the+inhibition+of+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Thiol-modified gold nanoparticles for the inhibition of Mycobacterium smegmatis.</a> Chem Commun (Camb). 50, 15860-15863 (2014).</li>
<li>Colella, M., Lobasso, S., Babudri, F., Corcelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid+is+associated+with+halorhodopsin+as+a+free+fatty+acid.+Radiolabeling+of+halorhodopsin+with+3H-palmitic+acid+and+chemical+analysis+of+the+reaction+products+of+purified+halorhodopsin+with+thiols+and+NaBH4%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid is associated with halorhodopsin as a free fatty acid. Radiolabeling of halorhodopsin with 3H-palmitic acid and chemical analysis of the reaction products of purified halorhodopsin with thiols and NaBH4.</a> Biochim Biophys Acta. 1370, 273-279 (1998).</li>
<li>Sherry, B., Jue, D. M., Zentella, A., Cerami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+high+molecular+weight+glycosylated+forms+of+murine+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Characterization of high molecular weight glycosylated forms of murine tumor necrosis factor.</a> Biochem Biophys Res Commun. 173, 1072-1078 (1990).</li>
<li>PubChem Compound Database. , National Center for Biotechnology Information. 
 <a target="_blank" href="https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755">https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755</a> (2004).</li>
<li>Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+induced+by+fibrillar+beta-amyloid+and+IgGs+are+differentially+regulated+by+proinflammatory+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines.</a> J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).</li>
<li>McCarthy, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+adult+murine+immortalized+microglial+cell+line+and+its+activation+by+amyloid-beta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel adult murine immortalized microglial cell line and its activation by amyloid-beta.</a> J Neuroinflammation. 13, (2016).</li>
<li>Schauer, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+apportionment+of+airborne+particulate+matter+using+organic+compounds+as+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos+Environ%22%5BJournal%5D)">Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers.</a> Atmos Environ. 30, 3837-3855 (1996).</li>
<li>Kleeman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+apportionment+of+fine+%28PM1.8%29+and+ultrafine+%28PM0.1%29+airborne+particulate+matter+during+a+severe+winter+pollution+episode%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Source apportionment of fine (PM1.8) and ultrafine (PM0.1) airborne particulate matter during a severe winter pollution episode.</a> Environ Sci Technol. 43, 272-279 (2009).</li>
<li>Borm, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+risks+of+nanomaterials%3A+a+review+carried+out+for+ECETOC%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC.</a> Part Fibre Toxicol. 3, (2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos que revelar.

Estudios recientes respaldan que la exposición ambiental contribuye a la obesidad y otras enfermedades neurodegenerativas 11,12. Sin embargo, las técnicas utilizadas en estudios anteriores consumen mucho tiempo y son costosas. Las consideraciones económicas, los sistemas de administración fisiológicamente relevantes, los problemas éticos con el uso extensivo de modelos animales in vivo y la dificultad para traducir los hallazgos en avisos de salud significativos son algunos de los principales desafíos...

Contaminaciones ambientales, específicamente los de la gama de nanopartículas (NP) (1 - 20 nm de diámetro), se han relacionado con la obesidad y otras enfermedades neurodegenerativas debido a la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica 1-3. Una elevada exposición a la contaminación puede inducir inflamación en el sistema nervioso central, incluyendo el hipotálamo 1. Un mecanismo potencial en la que esto ocurre podría ser a través de nanopartículas inducida por la activación de la microglía (células inmunes del cerebro) 4. Estudios anteriores han utilizado en modelos in vivo para estudiar los efectos de los PN en la salud del cerebro, que consumen mucho tiempo, es caro, y no responder directamente a la pregunta de cómo influyen los PN microglia. La microglía jugar un papel de múltiples facetas en el sistema nervioso central, incluyendo el mantenimiento del microambiente del cerebro y la comunicación con neuronas circundantes a través de la liberación de factores secretados y citoquinas. Dependiendo de los estímulos, microglia se puede activar para un pr M1o-inflamatoria o un estado anti-inflamatoria M2. Por ejemplo, M1 activa microglia liberan citocinas pro-inflamatorias tales como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), mientras que M2 activa citocinas antiinflamatorias de liberación microglia incluyendo la interleucina-4 (IL-4). Para validar nuestro sustituto en biosensor vitro para determinar la neurotoxicidad de los contaminantes del aire, que mide la respuesta microglial a 20 nm (nanopartículas de plata AGNPS). El objetivo de este artículo es describir cómo una línea de células de la microglia in vitro puede ser utilizado como un marcador sustituto biosensor para probar la respuesta de la microglia murino de PN y cómo la activación microglial afecta a las células del hipotálamo. El largo plazo destinado aplicación de este modelo validado es poner a prueba los efectos de los contaminantes del mundo real sobre la salud del cerebro y las enfermedades neurodegenerativas. Proporcionamos una descripción detallada de un ensayo de formato in vitro de 96 pocillos para medir la activación microglial y la supervivencia celular hipotalámica siguiente a la exposición de mic<html> roglial medios condicionados. la activación microglial se determinó después de la exposición AgNP utilizando una enzima TNF-α ensayo inmunoenzimático (ELISA). Para determinar el efecto de la microglia activada en las células del hipotálamo, los AGNPS fueron retirados de sobrenadante microglial (medio acondicionado) usando un dispositivo de filtración. El dispositivo de filtración retiene las citoquinas, excluyendo los AGNPS en función del tamaño. Brevemente, se recogió el sobrenadante de microglia tratados con o sin AGNPS, se añadió a los filtros, y se centrifugó a 14.000 xg durante 15 min. Estábamos entonces capaz de determinar la influencia de las citocinas secretadas microgliales sobre la viabilidad celular hipotalámica. Se determinó la toxicidad de la célula después de la exposición a medio acondicionado (que contienen citoquinas) por medio de un ensayo basado en la resazurina como se describió previamente 5,6. Las células metabólicamente activas reducen la resazurina y producen una señal fluorescente proporcional al número de células viables 7. nt &quot;&gt; Hay varias ventajas de la utilización de esta técnica sobre los demás (como co-cultivo, las configuraciones trans pocillos, o en experimentos in vivo). Nuestro modelo ofrece la posibilidad de activar directamente la microglía y determinar si los factores secretados son tóxicos para las neuronas 8 . El protocolo actual utiliza inmortalizado microglia BV2 estimulado con nanopartículas de 20 nm de diámetro, e inmortalizó células hipotalámicas murinos (designado mHypo-A1 / 2) 9 para la determinación de la respuesta posterior. Si bien este protocolo ha sido optimizado para estas condiciones específicas, los métodos puede ser modificadas para ser utilizadas en otros modelos de muerte celular microglial inducida, o con otros tipos de células incluyendo microglia primaria y las neuronas.

<table><tbody><tr><td><Células fuertes> / Reactivos< / Línea celular >microglial de</td> ratón fuerte (BV2)Colección de líneas celulares entre laboratorios (Génova, Italia)ATL03001 Línea celular de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> hipotálamo de ratón adulto mHypoA-1/2&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>Cellutions Biosystems Inc.</td><td>CLU172</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila Modificada' s Medium</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino&nbsp;</td><td>PAA Labs</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina/Neomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15640-055</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Nanopartículas de plata (20 nm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>730793</td><td></td></tr><tr><td> PrestoBlue Reactivo de viabilidad celular</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td></td></tr><tr><td>Ratón TNF- y alfa; ELISA Max Delux</td><td>Biolegend</td><td>430904</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacárido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 W Placa inferior óptica, poliestireno negro, tratamiento con cultivo celular, con tapa, estéril</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 Unidad de filtro centrífugo con membrana Ultracel-10</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC501008</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5 Microplaca multimodo</td><td>Molecular Devices</td> Centrífuga cónica <td>M5</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Tubos</td><td>Corning, Inc</td><td> 14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Coladores de células de halcón 70 &mu; m</td><td>Corning, Inc</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa 5430</td><td>Eppendorf</td><td>22620560</td><td></td></tr></tbody></table>

microglia como una biosensor sustituto para determinar la neurotoxicidad de nanopartículas

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Las nanopartículas que se encuentran en los contaminantes del aire pueden alterar los perfiles de los neurotransmisores, aumentar la neuroinflamación y alterar la función cerebral. Por lo tanto, el ensayo descrito aquí ayudará a dilucidar el papel de la microglía en la neuroinflamación y las enfermedades neurodegenerativas. El uso de la microglía, células inmunitarias residentes del cerebro, como biosensor sustituto proporciona una nueva visión de cómo las respuestas inflamatorias median las agresiones neuronales. Aquí, utilizamos una línea celular microglial murina inmortalizada, designada BV2, y describimos un método para la exposición a nanopartículas utilizando nanopartículas de plata (AgNPs) como estándar. Describimos cómo exponer la microglía a las nanopartículas, cómo eliminar las nanopartículas del sobrenadante y cómo usar el sobrenadante de la microglía activada para determinar la toxicidad, utilizando la supervivencia de las células hipotalámicas como medida. Tras la exposición a AgNP, la activación de la microglía BV2 se validó mediante un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α). El sobrenadante se filtró para eliminar el AgNP y permitir que las citocinas y otros factores secretados permanecieran en el medio condicionado. A continuación, las células hipotalámicas se expusieron al sobrenadante de la microglía activada por AgNP y se determinó la supervivencia de las neuronas mediante un ensayo fluorescente basado en resazurina. Esta técnica es útil para utilizar la microglía como biomarcador sustituto de la neuroinflamación y determinar el efecto de la neuroinflamación en otros tipos de células.

Se demuestra que la función de microglia como un biosensor sustituto de la respuesta del cerebro a las nanopartículas utilizando el protocolo anterior. Nuestros resultados incluyen la medición de los efectos tóxicos de la activación microglial en la muerte celular neuronal aguas abajo. La Figura 1 muestra un flujo de trabajo del protocolo para activar microglia y determinar si las citoquinas secretadas reducen la viabilidad de las neuronas hipotalámicas. La secreción de ...

Microglia (células inmunitarias del cerebro), se utilizan como biosensor sustituto para determinar cómo influyen las nanopartículas en la neurotoxicidad. Describimos una serie de experimentos diseñados para analizar la respuesta de la microglía a las nanopartículas y la exposición de las neuronas hipotalámicas al sobrenadante de la microglía activada para determinar la neurotoxicidad.

Microglia como una biosensor sustituto para determinar la neurotoxicidad de nanopartículas

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

El objetivo general de este protocolo es describir un biosensor in vitro de reemplazo para evaluar la respuesta de los microglías a las nanopartículas. A continuación, determinaremos la neurotoxicidad tras la exposición a medios enriquecidos procedentes de microglías estimuladas con nanopartículas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como la forma en que se analizan activamente las nanopartículas en cuanto a su neurotoxicidad.La principal ventaja de esta técnica es que nuestro modelo permite activar directamente las microglías y determinar si los factores secretados son neurotoxinas, sin necesidad de estudios prolongados y costosos en roedores. Aunque este método puede proporcionar información sobre la muerte celular inducida por microglía tras la exposición a micropartículas, también puede aplicarse a otros modelos de enfermedades neurodegenerativas en el contexto de evaluar posibles contaminantes ambientales con efectos neurotóxicos.Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con el paso de filtración del medio condicionado. Debido a que la eficiencia de filtración puede variar según el tamaño, la forma y la concentración de las nanopartículas. Como preparación, caliente el DMEM suplementado con 10 %FBS y 1 %PSN a 37 grados Celsius.Luego, tome células microgliales BV2 congeladas obtenidas de los pasajes 18 a 25 y descongélelas rápidamente a 37 grados Celsius. A continuación, transfiera suavemente las células descongeladas a un frasco ventilado de 75 centímetros cuadrados que contenga 10 mililitros de medio y coloque el frasco en incubación. Después de 24 horas, reemplace el medio y continúe cultivando las células hasta que alcancen una confluencia del 70-80 %. En este punto, aspire el medio y agregue 500 microlitros de solución tibia de tripsina-EDTA 1X.Después de permitir que el matraz incube durante unos minutos más, use un raspador para recoger las células en 5 mililitros de DMEM tibio. Luego, filtre las células del matraz utilizando un tamiz de 70 micrones. Repita esta filtración tres veces usando el mismo tamiz y recoja las células en un tubo de 50 mililitros.Una vez filtradas, cuente las células y luego siembre una placa con fondo transparente y paredes negras con 8000 células por pocillo en 200 microlitros de DMEM suplementado. Después de 24 horas de incubación, reemplace el medio en los pocillos con DMEM sin suero para privar de nutrientes a las microglías. Después de 24 horas adicionales de incubación, proceda a activar las microglías.Para ello, primero diluya las nanopartículas de plata en DMEM sin suero hasta la concentración de trabajo deseada. Luego, reemplace 100 microlitros del medio con el compuesto de tratamiento. Asegúrese de incluir un control negativo con la solución diluida del vehículo sin las nanopartículas.Ahora continúe la incubación durante 24 horas y proceda con el análisis. Para comenzar, recolecte 200 microlitros de medio sobrenadante de cada pocillo de la placa y colóquelos sobre un filtro que eliminará las nanopartículas, colocado encima de un tubo de microcentrífuga. Es importante recordar que, al filtrar las nanopartículas, su tamaño, forma y concentración son factores que influyen en la eficiencia de fusión.Por lo tanto, es recomendable probar la filtración previamente. Ahora, centrifugue los tubos a 14000g a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego, deseche el flujo pasante que contiene las nanopartículas y coloque los filtros boca abajo en nuevos tubos de recolección.Gire los filtros boca abajo a 1000g durante dos minutos para recoger el medio condicionado concentrado que contiene citocinas. A continuación, aumente el volumen de la recolección a 400 microlitros con DMEM suplementario recién preparado y almacene los tubos en hielo. Para asegurar la eliminación de nanopartículas residuales de azufre del medio filtrado, prepare estándares de nanopartículas no filtradas en un rango de concentración desde un blanco hasta 0,2 microgramos por mililitro en DMEM sin suero.Luego, alícuote 50 mililitros de las muestras filtradas y de cada patrón en una placa transparente de fondo claro y paredes negras y mida la absorbancia desde 390 hasta 410 nanómetros. Para medir la concentración de TNF-alfa en las muestras, use la mitad del volumen restante en un kit disponible comercialmente. Para este ensayo, establezca células hipotalámicas a partir de stocks congelados.Utilizando los mismos métodos descritos para establecer cultivos de microglía. Finalmente, úselos para sembrar placas de fondo claro con paredes negras con 5000 células por pocillo en 200 microlitros de DMEM suplementado. Después de 24 horas de cultivo, retire 100 microlitros de medio y reemplácelos con 100 microlitros de medio filtrado y concentrado recolectado de los cultivos de células microgliales activadas, luego incube la placa durante 24 horas bajo condiciones estándar.Al día siguiente, añada 22 microlitros de reactivo de resazurina a cada pocillo y continúe la incubación durante 20 minutos. Luego, con un espectrofotómetro multimodal, realice una medición de fluorescencia para estimar la viabilidad celular en unidades de fluorescencia relativa. Con el protocolo descrito, la función de la microglía puede utilizarse como un biosensor sustituto de la respuesta cerebral a las nanopartículas.La secreción de TNF-alfa por microglía aumentó significativamente tras la exposición a nanopartículas de plata. Cuando se expusieron neuronas hipotalámicas al medio acondicionado procedente de microglía activada por nanopartículas de plata, la viabilidad de las neuronas se redujo significativamente. En principio, la exposición a las nanopartículas de plata activó la microglía hacia un estado M1 proinflamatorio.Luego, las citoquinas proinflamatorias liberadas contribuyen a la muerte celular circundante. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la microglía como biosensor sustituto para evaluar la respuesta a nanopartículas y si esta respuesta es neurotóxica. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres o cuatro días si se lleva a cabo correctamente.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el perfilado de otras citocinas secretadas tras la activación de microglía, con el fin de determinar los estados de activación de la microglía.

microglia-as-surrogate-biosensor-to-determine-nanoparticle

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Los métodos utilizados para evaluar Bioimagen biodistribución de células de las nanopartículas son aplicables para el seguimiento terapéutico y de diagnóstico de los compuestos nanoformulated. Los métodos descritos en este documento son sensibles y específicos cuando se evaluó por corregistro histológico. Las metodologías de proporcionar una vía de traslación de los roedores a aplicaciones humanas.

Bioimagen registradas de Nanomateriales para el Monitoreo de Diagnóstico y Terapéutica

La microglía se macrófagos residentes que proporcionan la primera línea de defensa y de vigilancia inmune del sistema nervioso central. Los microARN son moléculas reguladoras que juegan un papel importante en muchos procesos fisiológicos, incluida la activación y diferenciación de los macrófagos. En este artículo se describe el método para la medición de los microRNAs en la microglía.

La detección de microARNs en la microglía por PCR en tiempo real en el SNC normal y durante la neuroinflamación

Este video muestra un método para evaluar los efectos neurotóxicos de las nanopartículas utilizando microglía. Describe los pasos para activar la microglía con nanopartículas, filtrar los medios condicionados para aislar las citocinas proinflamatorias derivadas de la microglía y probar la toxicidad de las neuronas hipotalámicas con los medios condicionados.

Determinación de la toxicidad inducida por nanopartículas en neuronas utilizando la microglía como biosensor sustituto

Una clave para el éxito de la investigación de la biología microglial es la preservación de immunofunction microglial ex vivo durante el aislamiento del tejido del SNC. Aislar microglia mediante agitación rotatoria resultados en cultivos de células de alta pureza y inmunofuncional según la evaluación de imágenes fluorescentes, inmunocitoquímica y ELISA después de la activación microglia con el lipopolisacárido estímulos proinflamatorias (LPS) y Pam 3 CSK 4 (Pam).

Aislamiento de cortical Microglia con Inmunofenotipo Conservas y funcionalidad de murinos Neonatos

La microglía son las células inmunes residentes del sistema nervioso central (SNC) con una alta capacidad de fagocitar o material de envolver en su entorno extracelular. Aquí, se describe un ensayo ampliamente aplicable, fiable, y altamente cuantitativo para visualizar y medir la microglia mediada por inmersión de componentes sinápticas.

Un ensayo de Inmersión en: Un Protocolo para Evaluar Interacciones entre CNS fagocitos y neuronas

La activación de la microglia y microgliosis son respuestas clave a la neurodegeneración crónica. A continuación, presentamos los métodos para in vivo, visualización a largo plazo de la retina células microgliales CX3CR1-GFP + por oftalmoscopía confocal y de umbral y los análisis morfométricos para identificar y cuantificar su activación. Hacemos un seguimiento de los cambios microgliales durante las primeras etapas del glaucoma relacionada con la edad.

En Vivo Dinámica de Retina Microglial Activación Durante Neurodegeneración: Confocal oftalmoscópico Imaging y Morfometría celular en el ratón Glaucoma

fagocitosis microglial es crítica para el mantenimiento de la homeostasis del tejido e inadecuada función fagocítica se ha implicado en la patología. Sin embargo, la evaluación de la función de la microglia in vivo es un desafío técnico. Hemos desarrollado una técnica sencilla pero robusto para el seguimiento y cuantificar el potencial fagocítica de microglia en un entorno fisiológico con precisión.

La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de un ensayo basado en citometría de flujo

Aquí, se presenta un protocolo para aislar microglia de crías de ratón postnatal (día 1) para la experimentación in vitro. Este método improvisada de aislamiento genera tanto alto rendimiento y pureza, una ventaja significativa sobre métodos alternativos que permite amplia experimentación gama para los fines de elucidar la biología microglial.

El aislamiento magnético rápida y refinado CD11b de la microglia primaria con mayor pureza y versatilidad

Se presenta un protocolo para el aislamiento de primaria microglia del cerebro murino. Esta técnica ayuda a promover la comprensión actual de condiciones neurológicas. Centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética se combinan para producir suficiente rendimiento de una muestra muy pura. Además, describiremos los pasos para la caracterización de la microglia.

Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

Este artículo demuestra un método para visualizar y cuantificar la motilidad y el contacto de la microglía con puntos postsinápticos en la retina mediante microscopía confocal de disco giratorio.

Imágenes en vivo y caracterización de la dinámica de la microglía e interacciones con sinapsis en retina murina enferma

El Software de Parámetros Microgliales de Mapeo (MMPS) es una cadena de análisis fácil de usar que no requiere conocimientos de codificación y que semiautomatiza el análisis de morfología microglial de células individuales a partir de imágenes de inmunofluorescencia. Validado en un modelo de neuroinflamación inducido por lipopolisacáridos en roedores, MMPS detecta de forma reproducible los cambios morfológicos asociados a la activación y permite un fenotipado microglial estandarizado y...

Software de Mapeo de Parámetros Microgliales (MMPS): Una herramienta de código abierto y fácil de usar para el análisis cuantitativo de la morfología de la microglía

Aprende a usar microglía como biosensor sustituto para evaluar la neurotoxicidad de nanopartículas en un modelo in vitro. Este método permite determinar factores neurotóxicos sin estudios prolongados en roedores.

Microglia como una biosensor sustituto para determinar la neurotoxicidad de nanopartículas

Explorar más videos