Microglia como una biosensor sustituto para determinar la neurotoxicidad de nanopartículas

El objetivo general de este protocolo es describir un biosensor sustituto in vitro para probar la respuesta de la microglía a las nanopartículas. A continuación, determinaremos la neurotoxicidad tras la exposición a medios acondicionados de microglía estimulados con nanopartículas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como la forma en que las nanopartículas se analizan activamente para detectar la neurotoxicidad.

La principal ventaja de esta técnica es que nuestro modelo proporciona la capacidad de activar directamente la microglía y determinar si los factores secretos son neurotoxinas sin el uso de costosos estudios a largo plazo con roedores. Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre la muerte celular inducida por la microglía después de la exposición a micropartículas. También se puede aplicar a otros modelos de enfermedades neurodegenerativas en el contexto de la prueba de potenciales contaminantes ambientales neurotóxicos.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con el paso de filtración de medios de condición. Porque la eficiencia de filtración puede diferir según el tamaño, la forma y la concentración de las nanopartículas. En la preparación, caliente el DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de PSN a 37 grados centígrados.

A continuación, tome las células microgliales BV2 congeladas obtenidas de los conductos 18 a 25 y descongélelas rápidamente a 37 grados centígrados. A continuación, transfiera suavemente las células descongeladas a un matraz ventilado de 75 centímetros cuadrados que contenga 10 mililitros de medio e incube el matraz. Después de 24 horas, reemplace el medio y continúe cultivando las células hasta que alcancen una confluencia de 70-80%En este punto, aspire el medio y agregue 500 microlitros de solución tibia de EDTA 1 ex tripsina.

Después de dejar que el matraz se incube durante unos minutos más, use un raspador para recoger las células en 5 mililitros de DMEM tibio. A continuación, filtre las células del matraz con un colador de 70 micras. Repita esta filtración tres veces usando el mismo colador y recoja las células en un tubo de 50 mililitros.

Una vez filtrado, cuente las células y luego siembre una placa inferior transparente de paredes negras con 8000 células por pocillo en 200 microlitros de DMEM suplementado. Después de 24 horas de incubación, reemplace el medio en los pocillos con DMEM sin suero para matar de hambre a la microglía. Después de 24 horas más de incubación, proceda a activar la microglía.

Para ello, primero diluya las nanopartículas de plata en DMEM sin suero hasta la concentración de trabajo deseada. A continuación, sustituya 100 microlitros de medio por el compuesto de tratamiento. Asegúrese de incluir un control negativo de la solución vehicular diluida sin las nanopartículas.

Ahora continúe la incubación durante 24 horas y proceda con el análisis. Para empezar, recoja 200 microlitros de medio sobrenadante de cada pocillo de placa y cárguelo en un filtro que eliminará las nanopartículas colocadas sobre un tubo de microcentrífuga. Es importante recordar que al filtrar las nanopartículas, su tamaño, forma y concentración son un factor para la eficiencia de la fusión.

Por lo tanto, es recomendable probar la filtración de antemano. Ahora gire los tubos a 14000 g a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, deseche el flujo que contiene las nanopartículas y coloque los filtros boca abajo en nuevos tubos de recolección.

Gire los filtros boca abajo a 1000 g durante dos minutos para recolectar medio acondicionado concentrado que contenga citoquinas. A continuación, aumente el volumen de la colección a 400 microlitros con DMEM suplementario recién hecho y almacene los tubos en hielo. Para garantizar que las nanopartículas de azufre residuales se eliminen de los medios filtrados, prepare patrones de nanopartículas sin filtrar en un rango de concentración desde un blanco hasta 0,2 microgramos por mililitro en DMEM sin suero.

A continuación, alícuota 50 mililitros de las muestras filtradas y de cada patrón en una placa inferior transparente de paredes negras y mida la absorbancia de 390 a 410 nanómetros. Para medir la concentración de TNF-alfa en las muestras, utilice la mitad de su volumen restante en un kit disponible en el mercado. Para este ensayo, establezca células hipotalámicas a partir de existencias congeladas.

Utilizando los mismos métodos descritos para establecer cultivos microgliales. En última instancia, utilícelos para sembrar placas de fondo transparente de paredes negras con 5000 células por pocillo en 200 microlitros de DMEM suplementado. Después de 24 horas de cultivo, retire 100 microlitros de medio y reemplácelo con 100 microlitros de medio filtrado y concentrado recolectado de los cultivos celulares microgliales activados, luego incube la placa durante 24 horas en condiciones estándar.

Al día siguiente, agregue 22 microlitros de reactivo de resazurina a cada pocillo y continúe la incubación durante 20 minutos. Luego, con un espectrofotómetro de modo múltiple, tome una medida de fluorescencia para estimar la viabilidad de las células en términos de unidades de fluorescencia relativas. Con el protocolo descrito, la función de la microglía se puede utilizar como un biosensor sustituto para la respuesta del cerebro a las nanopartículas.

La secreción de TNF-alfa por la microglía aumentó significativamente después de la exposición a nanopartículas de astilla. Cuando las neuronas hipotalámicas se expusieron al medio condicionado de la microglía activada por nanopartículas de plata, la viabilidad de las neuronas se redujo significativamente. En principio, la exposición a las nanopartículas de plata activó la microglía a un estado proinflamatorio M1.

Luego, las citocinas proinflamatorias liberadas contribuyen a la muerte celular circundante. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar la microglía como un biosensor sustituto para probar la respuesta a las nanopartículas y si esta respuesta es neurotóxica. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres o cuatro días si se realiza correctamente.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el perfil de otras citocinas secretadas después de la activación microglial para fenotipar los estados de activación microglial.