Name: Administración sostenida de mitógenos de células β de los islotes intactos mouse Ex Vivo Uso Biodegradable poli (ácido láctico-co-glicólico) Microesferas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprende a administrar microesferas PLGA biodegradables a islotes pancreáticos de ratón ex vivo para estudiar la proliferación de células beta. Este método permite la liberación sostenida de compuestos con aplicaciones terapéuticas en diabetes.

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Los autores desean agradecer a Bethany Carboneau (Universidad de Vanderbilt) por la lectura crítica de este manuscrito. También agradecemos a Anastasia Coldren (Centro de Análisis y Adquisición de Islotes del Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt) por los aislamientos de islotes, y al Dr. Alvin C. Powers (Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt) y al Dr. David Jacobson (Universidad de Vanderbilt) por el uso de sus instalaciones de centrífuga y cultivo de tejidos. Esta investigación implicó el uso del Núcleo de Adquisición y Análisis de Islotes del Centro de Investigación y Capacitación en Diabetes de Vanderbilt, respaldado por el DK20593 de subvenciones de los NIH. Este trabajo fue apoyado por una beca postdoctoral de la American Heart Association (14POST20380262) a R.C.P., y subvenciones de la Fundación para la Investigación de la Diabetes Juvenil (1-2011-592) y el Departamento de Asuntos de Veteranos (1BX00090-01A1) a M.A.G.

Todos los procedimientos fueron aprobados y realizados de acuerdo con el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional Vanderbilt. 1. El etiquetado con fluoróforo COI (Opcional) <ol><li> Elija un colorante fluorescente que reaccionará con una amina primaria libre (por ejemplo, en una proteína), tales como ésteres de succinimidilo o derivados de fluoresceína, para visualizar la carga de las microesferas. Disolver exceso molar 8x (con relación a moles de COI) de fluoróforo en 200 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO). </li><li> Resuspender 50 mg de COI hasta un volumen final de 800 l en una solución de vehículo (concentración final de 62,5 ng / l). La solución de vehículo variará dependiendo de la fuente de la COI. NOTA: El vehículo típico soluciones incluyen solución salina tamponada con fosfato (PBS) o DMSO. </li><li> Añadir toda la solución de fluoróforo / DMSO del paso 1.1 y resuspender el COI. Vortex durante la noche a 4 ° C. Alternativamente, vórtice la mezcla de reacción a temperatura ambiente(RT) durante 4 h. </li><li> Después de la reacción de marcaje, eliminar el exceso de fluoróforo utilizando una columna de desalado. <ol><li> Escurrir tampón de almacenamiento de la columna de desalación y enjuague con 16 ml de agua desionizada. Desechar todo el flujo a través. </li><li> Añadir el COI marcado con fluorescencia a la columna de desalado. Eluir con 1,2 ml de agua desionizada y se recoge el flujo a través. </li><li> etapa de elución repetir un adicional de cuatro veces, cada vez añadiendo 1,2 ml de agua desionizada y recoger el flujo a través de como una muestra separada. </li><li> Congelar todo el flujo de recogida a través de las muestras a -80 ° C y liofilizar según las instrucciones del fabricante para las 24 horas. </li></ol></li></ol> 2. COI-cargada de microesferas Preparación través del agua de agua-en-aceite-en-Emulsión disolvente de evaporación Método <ol><li> Añadir 1 COI mg de marcado con fluorescencia a 100 l de agua desionizada para formar la primera fase de agua (W1). </li><li> Disolver 65 mg de poli (aci láctico-co-glicólicod) (50:50 lactida: glicolida, peso molecular 54.000 - 69.000) en 750 l de diclorometano en un tubo de microcentrífuga. Ultrasonicate de 10 a 30 seg (a 160 W) para disolver completamente el PLGA. Esto forma la fase de aceite (O). </li><li> Añadir toda la fase W1 generado en la etapa 2.1 a la fase O de una manera gota a gota. Emulsionar usando un homogeneizador de mano a 20.000 rpm durante 30 segundos para formar la fase W1 / O. </li><li> Añadir toda la fase de E / S W1 de una manera gota a gota a 15 ml de una 1% (peso / volumen) de poli acuoso (alcohol de vinilo) de solución (PVA) y emulsionar utilizando un homogeneizador de mano a 20.000 rpm durante 30 sec . </li><li> Transferir todo de la emulsión generada en la etapa 2.4 a un 200 ml matraz de fondo redondo y sujeto a un 635 mm Hg de vacío usando un evaporador rotatorio durante 1 hora para eliminar el disolvente y generar la fase acuosa. </li><li> Alícuota de 1 ml de la fase acuosa generado en la etapa 2.5 a catorce tubos de microcentrífuga. Centrifugación de la solución acuosa en los tubos de microcentrífuga a 7500g durante 8 min. NOTA: En este paso, las microesferas están presentes en la solución acuosa remanente y se concentran a la parte inferior del tubo de microcentrífuga. </li><li> Retire cuidadosamente 900 l de solución acuosa a partir de los tubos de microcentrífuga con una micropipeta, de pipeteado con el fin de no molestar a las microesferas en el fondo del tubo de microcentrífuga. <ol><li> Se lavan las microesferas de exceso de PVA por adición de 1 ml de agua desionizada a cada tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 7500 xg durante 8 min, y de nuevo retirar con cuidado 900 l de solución acuosa a partir de los tubos de microcentrífuga con una micropipeta, de pipeteado con el fin de no molestar a las microesferas en el fondo del tubo de microcentrífuga. NOTA: La solución acuosa de 100 l restante contiene las microesferas generados. </li></ol></li><li> Congelar la solución acuosa de microesferas generada en el paso 2.7 a -80 ° C. </li><li> microesferas liofilizar utilizando un liofilizador de acuerdo con el fabricante delinstrucciones y almacenar a -20 ° C. NOTA: medir la eficiencia de carga de la COI disolviendo completamente microesferas de PLGA y la determinación de la concentración de proteína en relación con una curva estándar de la proteína libre 7. </li><li> Como control negativo, generar un lote de microesferas &quot;en blanco&quot; (en lo sucesivo, microesferas de control). NOTA: La generación de microesferas de control es idéntica a la generación de microesferas cargadas-COI hidrófilos, sin adición COI a 800 l de la solución de vehículo en el paso 1.2. partículas de control de ajuste de la concentración de masa de PLGA en relación con microesferas de PLGA cargadas-COI para el ensayo de mitógeno de las células β. </li></ol> 3. Preparación de los islotes Medios de cultivo y medios de comunicación pre-ensayo <ol><li> Preparar 200 ml de medio para el cultivo de islotes de ratón intactas: RPMI 1640 suplementado con glucosa 11 mM, 10% de suero de caballo, 100 U / ml de penicilina G y 100 mg / ml de estreptomicina (en lo sucesivo, esdejar que los medios de cultivo). NOTA 1: A diferencia de suero fetal bovino (FBS), suero de caballo carece de lactógeno placentario, un inductor de la proliferación de células β, que confunde análisis en el ensayo de proliferación. NOTA 2: Como las microesferas de PLGA no se esterilizan antes de su uso, la adición de antibióticos al medio de cultivo es crucial para evitar la contaminación microbiológica. </li><li> Retire 25 ml de medio de cultivo de islotes con una pipeta electrónica y colocar en un tubo cónico de 50 ml. Suplemento los 25 ml de medios de cultivo de los islotes en el tubo cónico de 50 ml con una concentración final de EGTA 0,2 mM para generar los medios de pre-ensayo. NOTA: La adición de EGTA afloja ligeramente contactos célula-célula en los islotes sin alterar la arquitectura de los islotes. Esto ayuda a asegurar la COI puede llegar a las células internas del islote y ayuda a prevenir la necrosis de la isleta central. </li></ol> 4. El cultivo de islotes intactos mouse <ol><li> Aislar islotes intactos de una cepa pre-seleccionado, sexo, age, y el genotipo de los ratones después de una digestión con colagenasa de rutina del 8,9 páncreas. Piscina islotes juntos desde como muestras. </li><li> Alícuota de 40 islotes en un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos en 200 l de medio de cultivo de los islotes. islotes de tamaño de los partidos visualmente por pocillo (una evaluación precisa de la equivalencia de los islotes (IEQ) entre las muestras no es necesario). Llenar los pozos vacíos inmediatamente adyacentes a los pozos con islotes con 200 l de agua estéril para amortiguar los problemas de evaporación. Cultura islotes en los medios de comunicación durante la noche a 37 ° C bajo una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO 2. </li></ol> 5. Re-suspensión de microesferas de control de PLGA cargadas con los países de origen y <ol><li> Después de la recuperación de los islotes durante la noche, las microesferas de volver a suspender mediante la adición de medios de pre-ensayo a una alícuota de liofilizados microesferas de PLGA cargadas con COI de tal manera que la concentración final de COI en el tubo de microcentrífuga es 10 ng / l (la cantidad de COI presente en una cantidad dada de los micros generadosFeres se determinó en el paso 2.9). Sonicar las microesferas cargadas-COI volvió a suspender en un baño de agua con hielo durante 10 minutos a 160 W con pulsos largos de 10 segundos a 4 ° C. </li><li> Resuspender de control de PLGA microesferas añadiendo el mismo volumen de medio pre-ensayo a una masa igual de control liofilizado microesferas de PLGA. Sonicar las microesferas resuspendidas control de PLGA en un baño de agua con hielo durante 10 minutos a 160 W con pulsos largos de 10 segundos a 4 ° C. </li><li> confirmar visualmente microesferas se dispersan con la pipeta 2 l de microesferas resuspendidas entre dos portaobjetos de vidrio. Visualizar microesferas utilizando un objetivo 40X en un microscopio de epifluorescencia o campo claro. </li><li> Si la agregación significativa de las microesferas es aún visible, se somete a ultrasonidos en un baño de agua con hielo durante otros 10 min a 160 W con pulsos largos de 10 segundos a 4 ° C y repita la visualización de microesferas resuspendidas. </li></ol> 6. Tratamiento de los islotes con control de PLGA microesferas cargadas con los países de origen o &lt;/ P&gt; <ol><li> Para cada pocillo para ser tratados con microesferas cargadas-COI, preparar medio de ensayo diluyendo el 10 ng / l de las microesferas resuspendidas COI con los medios de pre-ensayo para un volumen final de 100 l y una concentración final predeterminado. NOTA: La concentración final óptima de la proteína variará para cada COI utilizado para este ensayo. Idealmente, una gama de concentraciones finales se prueban. </li><li> Para cada pocillo para ser usado como control, preparar los medios de ensayo de control mediante la dilución de los de control resuspendidos microesferas de PLGA generados en la etapa 5.2 con el mismo volumen de dilución usado para diluir las microesferas cargadas con COI en el paso 6.1. NOTA: Los islotes tratados con medio de ensayo de control servirán como control negativo para permitir la detección de cualquier efecto de las microesferas en blanco pueden tener sobre los resultados experimentales. </li><li> Retire cuidadosamente 100 l de medio de cultivo de los islotes de cada pocillo con una micropipeta de tal manera que no hay islotes se desprenden de los pozos. añadir con cuidado 100 μl de medio de ensayo o 100 l de medio de ensayo de control a cada pocillo. </li><li> Incubar islotes a 37 ° C bajo una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO 2 durante tres días. </li></ol> 7. La dispersión de los islotes intactos Onto portas de microscopio <ol><li> Después de tres días, utilizar una micropipeta para retirar cuidadosamente y deseche medio de ensayo de todos los pozos de modo que no se desprenda islotes. añadir con cuidado 200 l de PBS a los islotes de lavarlas del medio de ensayo. Con cuidado, retirar y desechar PBS con una micropipeta y lavar suavemente islotes de nuevo con un 200 l de PBS adicional. </li><li> Retire y deseche PBS con una micropipeta y añadir 100 l de 0,025% de tripsina, la solución 2 mM de EDTA. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Pipet islotes en la solución de tripsina-EDTA arriba y hacia abajo cada 2 min hasta islotes se confirman visualmente a ser dispersados ​​en células individuales (tenga en cuenta que algunos pequeños grupos de células pueden todavía estar presente) utilizando un microscopio de luz. Transferir la totalidad del volumen de cada pozo individualLy en tubos de microcentrífuga labeled-. </li><li> Añadir 400 l de medio de cultivo de los islotes a cada tubo de microcentrífuga para detener la disociación celular de tripsina mediada. </li><li> Centrifugar las muestras durante 5 minutos a 100 xg a 4 ° C para sedimentar las células de los islotes a la parte inferior de los tubos de microcentrífuga. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante con micropipeta, y el sedimento se vuelve a suspender en 200 medios de cultivo de islotes l fresco. </li><li> Usando una cito-centrífuga, centrífuga disociado islotes a 140 xg durante 3 min en portaobjetos de microscopio cargados. </li><li> Air secar los portaobjetos a TA durante 10 minutos, a continuación, dibuje un cuadro alrededor de los islotes disociadas con un rotulador hidrófobo. </li><li> Fijar las células con 75 l 4% de paraformaldehído (PFA) a TA durante 10 min. Retire el 4% PFA y lavar suavemente las células en 75 l de PBS dos veces. Después del lavado, permeabilizar las células con 75 l 0,2% de Triton X-100 en PBS durante 10 min. A continuación, lavar las células con 75 l de PBS. Precaución: PFA se sabe que es alergénica cancerígenos y tóxicos. </li></ol&gt; 8. La inmunofluorescencia etiquetado de los islotes disociada de la insulina y el marcador de proliferación celular, Ki67 <ol><li> Preparar una cámara húmeda mediante la colocación de dos toallas de papel húmedo en el fondo de una caja portaobjetos de microscopio capacidad 100 de diapositivas. </li><li> Lugar se desliza hacia abajo planas (células hacia arriba) en la cámara húmeda. Preparar las muestras para el etiquetado mediante la aspiración de la PBS de la etapa de lavado anterior utilizando una micropipeta y la adición de 75 l de solución de bloqueo (5% normal burro suero (NDS) en PBS) a cada diapositiva para bloquear la unión no específica de anticuerpos a las muestras. Incubar los portaobjetos en solución de bloqueo durante 1 hora a RT. </li><li> Suavemente aspirado de solución de bloqueo utilizando una micropipeta y añadir 75 l de solución de anticuerpo primario que contiene de cobaya anti-insulina y anticuerpos de conejo anti-Ki67, se diluyó 1 mg / ml en 5% NDS en PBS. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hr. NOTA: Los marcadores alternativos de proliferación celular incluyen la proliferación de núcleos de células antígeno (PCNA) y phosphohistone H3 (PH3), </li><li> Se aspira suavemente la solución de anticuerpo primario utilizando una micropipeta y enjuagar las células con 75 l de PBS. Aspirar PBS utilizando una micropipeta y enjuagar las células dos veces más, cada vez con 75 l de PBS. Incubar cada muestra con 75 l anti-conejillo de indias Cy5 y anticuerpo secundario anti-conejo Cy3 anticuerpo secundario diluido a 2 g / ml en solución de bloqueo durante 1 hora a RT. NOTA: No utilizar anticuerpos secundarios marcados con el mismo o superposición espectral fluoróforo que ya se utiliza para etiquetar las microesferas. </li><li> solución de anticuerpo secundario Aspirar utilizando una micropipeta y se incuban en 75 l de 300 nM DAPI en PBS durante 3 min a TA. Aspirar DAPI utilizando una micropipeta y enjuague en agua desionizada durante 5 min. </li><li> Se aspira suavemente el agua de las muestras utilizando una micropipeta. Detectar una gota (aproximadamente 100 l) de la solución de montaje de secado rápido que contiene antifade reactivo sobre un cubreobjetos de vidrio. Invertir el lado microscopio muestra de deslizarse hacia abajo, ore a la solución de montaje. Presione suavemente el cubreobjetos contra el portaobjetos con una punta de pipeta para eliminar las burbujas y limpie el exceso de líquido con un tejido suave de limpieza. Permitir cubreobjetos de secar durante la noche a TA. </li></ol> 9. Adquisición de imágenes y análisis <ol><li> Utilizar un microscopio de epifluorescencia con una cámara adjunta para la adquisición de imágenes. Para cada fluoróforo, determinar el tiempo óptimo de exposición (normalmente 20 ms para DAPI, 40 - 80 mseg para la insulina, y 250 ms para Ki67). Asegúrese de parámetros de adquisición de imágenes son iguales para todas las muestras. </li><li> Para cada muestra, contar manualmente 3.000 células positivas para insulina y de los que contar cuántas son también Ki67 positivo. Sólo contar las células positivas para insulina que tienen un núcleo bien definido y claramente visible. Calcular el porcentaje de la proliferación de las células ß para cada muestra dividiendo el número de las células Ki67 positivas / positivas para insulina por el número total de células positivas para insulina y multiplicando por 100. </li><li> después dara determinar el porcentaje de la proliferación de las células ß para cada muestra, determinar si existe una diferencia estadísticamente significativa en la proliferación de células β entre el control y las muestras experimentales mediante el análisis de los resultados con un ANOVA de una vía utilizando el software estadístico comercialmente disponible. </li></ol>

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<li>Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+pH-+and+temperature-responsive+microparticles+for+protein+delivery+to+ischemic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues.</a> Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).</li>
<li>Poole, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS-responsive+microspheres+for+on+demand+antioxidant+therapy+in+a+model+of+diabetic+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease.</a> Biomaterials. 41, 166-175 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El estudio de la proliferación de células β en cultivo típicamente se ve obstaculizada por varias dificultades. En primer lugar, las líneas de células inmortalizadas β se caracterizan por grados más altos de proliferación de lo que se encuentra en las células beta en los islotes endógenos en vivo. Además, estas líneas celulares inmortalizadas carecen de la arquitectura normal crítico para la función de las células β normal. Estos dos hechos hacen que sea difícil determinar si los resultados obtenidos usando líneas de cé...

células ß pancreáticas son las únicas células productoras de insulina en el cuerpo y son críticos para mantener la homeostasis de glucosa en sangre. Mientras que los individuos sanos tienen suficiente masa de células β y la función de regular adecuadamente la glucosa en sangre, las personas con diabetes se caracteriza por la masa de células β insuficiente y / o función 1,2. Se ha propuesto que la inducción de la proliferación de células β última instancia, puede aumentar la masa de células β y restaurar la homeostasis de la glucosa en individuos con diabetes 3. Sin embargo, la evaluación y validación de los posibles compuestos de proliferación de células β en los islotes intactos es necesario antes de terapias eficaces se pueden desarrollar. El trasplante de islotes de cadáveres humanos en los individuos con diabetes restaura la homeostasis de la glucosa en sangre durante un tiempo, pero la disponibilidad y el éxito de este procedimiento experimental se ve obstaculizada por la escasez de islotes humanos disponibles para el trasplante y la muerte de las células beta en los islotes de popatrasplante er 4. Incluso con el descubrimiento de los factores que inducen la multiplicación de las células productoras de insulina, un reto importante todavía existe en la entrega de estos factores a sitios relevantes in vivo. Una estrategia para la entrega local sostenida de compuestos de proliferación de células β es el poli (láctico-co-glicólico) (PLGA). PLGA tiene una historia de uso en productos aprobados por la FDA de administración de fármacos debido a su alta seguridad, biodegradabilidad, y la cinética de liberación prolongada 5. Específicamente, PLGA es un copolímero de lactida y glicolida que se degrada por hidrólisis con agua, ya sea in vivo o en cultivo en ácido láctico y ácido glicólico, que son metabolitos de origen natural en el cuerpo. El compuesto fármaco encapsulado puede ser liberado en el medio ambiente circundante tanto por difusión y / o mecanismos de liberación de degradación controlada. La encapsulación de COI proporciona protección contra la degradación enzimática, mejorar la biodisponibilidad del reactivo en comparación con unencapsulaTed COI 5. Sugerimos que microesferas de PLGA se pueden utilizar para administrar compuestos candidatos a islotes intactos en cultivo, y en última instancia en vivo. Prueba de la eficacia de PLGA para administrar los mitógenos de las células β de los islotes ex vivo es crítico antes se exploran los protocolos de trasplante. Actualmente, no existe una técnica para medir la proliferación de células β de animales vivos. Los experimentos para evaluar la eficacia de los compuestos potenciales de proliferación in vivo, por tanto, requiere la administración de estos compuestos a los animales vivos, con la disección posterior y el procesamiento de los páncreas de inmunomarcación. Tales protocolos son caros y laboriosos y requieren que el compuesto se administra por vía sistémica, sin ninguna garantía de que van a llegar a los islotes. Por el contrario, varias líneas de células inmortalizadas β están disponibles para el estudio de las células productoras de insulina en la cultura, pero estas líneas celulares carecen de la arquitectura de los islotes y ambient encuentra en los organismos que viven 6. Líneas de células inmortalizadas β también se caracterizan por tener un grado mucho más alto de replicación de las células beta endógenas in vivo, por lo tanto el análisis de compuestos que inducen la proliferación de complicación. En este estudio, se describe un protocolo que utiliza islotes intactos aisladas de ratones adultos. A diferencia de las líneas de células β, islotes intactos conservan la arquitectura normal de los islotes. Asimismo, en contraste con los experimentos llevados a cabo in vivo, la administración de compuestos proliferativos directamente a islotes intactos cultivadas reduce significativamente la cantidad de reactivos que es necesario medir con precisión la proliferación de células β. El estudio actual utiliza PLGA para administrar un COI, en este ejemplo, el factor recombinante humano de crecimiento de tejido (rhCTGF). El método descrito aquí confiere una ventaja significativa sobre la administración del compuesto en bruto a los islotes cultivadas ya que permite una liberación continua del compuesto en THmedios electrónicos. En particular, este ensayo puede ser modificado para administrar una amplia variedad de proteínas y anticuerpos de interés a los islotes intactos. Efectos en otros tipos de células endocrinas, incluyendo las células alfa, también pueden analizarse.

<table><tbody><tr><td>Verde Oregón 488 Ácido carboxílico, éster succinimidílico, 6 isómeros</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6149</td><td>Para el etiquetado de COI con fluoróforo</td></tr><tr><td>DMSO Dimethyl Sulfóxido Fisher</td><td>BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>Para disolver fluoróforo en el paso 1</td></tr><tr><td>Columnas de desalinización PD-10 desechables GE</td><td>Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>Columna de desalinización utilizada en el paso 1</td></tr><tr><td>Resomer RG 505, Poli(D,L-lactida-co-glicólido), terminado en éster, peso molecular 54.000 - 69.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>739960</td><td>Utilizado en la generación de microesferas en el paso 2</td></tr><tr><td>Peso molecular de poli(alcohol vinílico) 89.000 - 98.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>341584 Utilizado en la generación de microesferas en el paso 2</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Scientific</td><td>11879-020</td><td>Para el cultivo de islotes</td></tr><tr><td>Dextrosa Anhidra</td><td>Fisher BioReagents</td><td>200-075-1</td><td>Suplemento para medios de islotes</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>Antibióticos para medios de islotes</td></tr><tr><td>Suero normal de caballo</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>008-000-121</td><td>Suplemento para medios de islotes</td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Para el cultivo de islotes</td></tr><tr><td>Etileno glico-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>Suplemento para medios de islotes previos al ensayo</td></tr><tr><td>Cytospin 4 Citocentrífuga</td><td>Thermo Scientific A78300003</td><td></td><td>Para hacer girar células en portaobjetos de microscopio</td></tr><tr><td>EZ Single Cytofunnel</td><td>Thermo Scientific A78710020</td><td></td><td>Para hacer girar células en portaobjetos de microscopio</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP118-500</td><td>Utilizado en la disociación de islotes</td></tr><tr><td>paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Para la fijación de células</td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151</td><td>Para permeabilizar células</td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Reactivos bloqueantes para inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Ki67</td><td>ABCAM</td><td>AB15580</td><td>Para inmunofluorescencia Ki67</td></tr><tr><td>Conejillo de indias policlonal Anti-Insulina</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>Para inmunofluorescencia de insulina</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Burro Anti-Conejo</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>Para Ki67 inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td>Para inmunofluorescencia de insulina</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Para la visualización de núcleos en inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Aqua-Mount</td><td>Lerner Laboratories</td><td>13800</td><td>Medios de montaje de secado rápido</td></tr><tr><td>FreeZone -105 &deg; C 4.5 Litros Cascade Standtop Liofilizar Sistema de liofilización</td><td>Labconco</td><td>7382020</td><td>Para la liofilización de microesferas</td></tr></tbody></table>

administración sostenida de mitógenos de células β de los islotes intactos mouse<em&gt; ex vivo</em&gt; uso biodegradable poli (ácido láctico-co-glicólico) microesferas

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

El desarrollo de biomateriales ha aumentado significativamente el potencial para la entrega dirigida de fármacos a una variedad de tipos de células y tejidos, incluyendo las células ß pancreáticas. Además, las partículas de biomateriales, hidrogeles, andamios y también proporcionan una oportunidad única para administrar sostenida, la administración de fármacos controlable para ß-células en cultivo y en modelos de tejidos trasplantados. Estas tecnologías permiten el estudio de los factores de proliferación de células β candidato utilizando islotes intactos, así como un sistema de traslación correspondiente. Por otra parte, la determinación de la eficacia y la viabilidad de los factores de candidatos para estimular la proliferación de las células β en un sistema de cultivo es fundamental antes de seguir adelante con los modelos in vivo. Aquí se describe un método para co-cultivo de islotes de ratón intactas con el compuesto biodegradable de interés (CDI) poli RESORTE (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) con el fin de evaluar los efectos de la liberación sostenida in situ ofactores mitogénicos f sobre la proliferación de las células β. Esta técnica se describe en detalle cómo generar microesferas de PLGA que contienen una carga deseada usando reactivos disponibles comercialmente. Mientras que la técnica descrita utiliza el factor recombinante humano de crecimiento de tejido (rhCTGF) como un ejemplo, fácilmente se podría utilizar una amplia variedad de COI. Además, este método utiliza placas de 96 pocillos para reducir al mínimo la cantidad de reactivos necesarios para evaluar la proliferación de células β. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para utilizar biomateriales alternativos y otras características de las células endocrinas, tales como la supervivencia celular y el estado de diferenciación.

La Figura 1 es una representación visual de las microesferas generadas utilizando el protocolo anterior. El protocolo descrito aquí produce microesferas cargadas con rhCTGF de varios tamaños. La mayor fracción de microesferas estará entre 1 y 10 micras de diámetro, aunque algunas microesferas pueden ser más grandes (Figura 2). Si se desea, el tamaño de las microesferas se puede ajustar y optimizado sobre la base de parámetros de fabricac...

Aquí, presentamos una metodología para generar y administrar microesferas de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) cargadas de interés a islotes de ratón intactos en cultivo con el posterior análisis de inmunofluorescencia de la proliferación de células β. Este método es adecuado para determinar la eficacia de los mitógenos candidatos a β células.

Administración sostenida de mitógenos de células β de los islotes intactos mouse<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Uso Biodegradable poli (ácido láctico-co-glicólico) Microesferas

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

El objetivo general de este protocolo es utilizar microesferas de ácido poli(láctico-co-glicólico) o PLGA para entregar compuestos de interés a islotes pancreáticos intactos en cultivo, con el fin de estudiar los efectos de compuestos individuales sobre la proliferación de células beta pancreáticas adultas. Este método puede utilizarse para probar una variedad de compuestos entregados localmente de manera sostenida a islotes intactos. La principal ventaja de este método es que puede adaptarse fácilmente a biomateriales alternativos de entrega, compuestos de interés y ensayos de punto final.Este método también tiene el potencial de administrar compuestos de interés junto con la transferencia adoptiva de islotes in vivo. Taylor Kavanaugh, el estudiante de posgrado en mi laboratorio, demostrará cómo se preparan las microesferas de PLGA. Comience añadiendo un miligramo del compuesto de interés marcado con fluorescencia a 100 microlitros de agua desionizada para formar la primera fase acuosa.A continuación, disuelva 65 miligramos de PLGA en 750 microlitros de diclorometano en un vial de centelleo y sonicar la mezcla durante 10 a 30 segundos a 160 vatios para disolver completamente el PLGA. Esto forma la fase oleosa. Añada toda la primera fase acuosa a la fase oleosa gota a gota.Luego, utilice un homogenizador portátil para emulsionar la solución a 20.000 rpm durante 30 segundos, formando la primera fase agua-aceite. A continuación, agregue toda la primera fase agua-aceite gota a gota en 15 mililitros de una solución al 1% de PVA y emulsione tal como se acaba de demostrar. A continuación, transfiera todo el volumen de la emulsión a un matraz redondo de fondo redondo de 200 mililitros y utilice un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente y generar la fase acuosa, bajo vacío de 635 milímetros de mercurio durante una hora.Aliquotar un mililitro de la fase acuosa en cada uno de 14 tubos de microcentrifugado y pelotizar las microesferas mediante centrifugación. Al final de la centrifugación, usar una micropipeta para eliminar 900 microlitros de la solución acuosa de cada tubo, teniendo cuidado de no perturbar los pellets. Lavar las microesferas con un mililitro de agua desionizada, seguido de la eliminación cuidadosa de 900 microlitros del sobrenadante.Luego, agregue 900 microlitros de agua desionizada a los 100 microlitros restantes de los sobrenadantes. A continuación, mezcle brevemente por vórtex y someta a sonicación para resuspender los precipitados. Después de aislar los islotes de los animales experimentales de interés, siembre 40 islotes con tamaño visualmente comparable en un pocillo de una placa de cultivo tisular de 96 pocillos con 200 microlitros de medio de cultivo para islotes.A la mañana siguiente, re suspenda un alícuota de microesferas en medio previo al ensayo, de modo que la concentración final del compuesto de interés en el tubo sea de 10 nanogramos por microlitro, y someta las microesferas a sonicación en un baño de hielo y agua durante 10 minutos a 160 vatios con pulsos de 10 segundos a cuatro grados Celsius. A continuación, retire cuidadosamente 100 microlitros de medio de cultivo de islotes de cada pocillo sin desalojar los islotes, e incube los cultivos con 100 microlitros del medio de ensayo que contiene microesferas. Después de tres días, deseche cuidadosamente el medio de ensayo de todos los pocillos sin perturbar los islotes, y lave suavemente los islotes dos veces con 200 microlitros de PBS.Los islotes solo se adhieren débilmente a una placa de 96 pocillos. Por lo tanto, es fundamental retirar cuidadosamente el medio y el PBS de cada pocillo para no desalojar ni desechar accidentalmente los islotes. Después del segundo lavado, sumerja suavemente los islotes en 100 microlitros de solución de tripsina-EDTA durante tres minutos a temperatura ambiente, realizando pipeteo suave después de dos minutos.Transfiera todo el volumen de cada pocillo a tubos individuales de microcentrífuga y agregue 400 microlitros de medio de cultivo de islotes a cada tubo para detener la disociación. Después de recolectar los islotes tratados con microesferas mediante centrifugación, use una micropipeta para retirar suavemente los sobrenadantes y resuspender los sedimentos en 200 microlitros de medio fresco de cultivo de islotes. Luego, centrifugue los islotes disociados sobre portaobjetos cargados en un citocentrífugo.Tras secar al aire, dibuje un recuadro alrededor de los islotes con un rotulador hidrófobo y fije las células en 75 µL de paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 10 minutos, seguido de dos lavados con 75 µL de PBS. Tras el segundo lavado, permeabilice las células con 75 µL de Tritón X-100 al 0,2% en PBS durante 10 minutos, seguido de un lavado final con 75 µL de PBS solo. Para inmunomarcar los islotes, comience colocando las laminillas con el lado de las células hacia arriba en una cámara húmeda y retire el PBS.A continuación, bloquee la unión no específica con 75 microlitros de suero de asno normal a temperatura ambiente. Después de una hora, sustituya el suero por 75 microlitros del anticuerpo primario de interés durante otra hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, aspire cuidadosamente la solución del anticuerpo primario y lave las muestras con lavados de 375 microlitros de PBS.Luego, incubar los islotes con 75 microlitros del anticuerpo secundario marcado con inmunofluorescencia apropiado durante una hora a temperatura ambiente protegidos de la luz. Al final de la incubación, reemplazar la solución de anticuerpo secundario con 75 microlitros de Dappy durante tres minutos, seguido de un enjuague de cinco minutos con agua desionizada. Al final del lavado, colocar una gota de 100 microlitros de solución de montaje de secado rápido que contiene reactivo anti-desvanecimiento sobre un portaobjetos de vidrio e invertir un portaobjetos, con la muestra hacia abajo, sobre la solución de montaje.La fracción más grande de microesferas estará entre 1 y 10 micrones de diámetro, aunque algunas microesferas pueden ser más grandes. Tras la dispersión de los islotes tratados con microesferas de PLGA intactas y su posterior inmunomarcado, es común observar regiones de la muestra sin ningún marcado entre las células, causadas por microesferas intactas que no se han eliminado completamente durante los pasos de lavado. Después del análisis de imágenes, el porcentaje de células positivas para insulina y Ki67 puede cuantificarse mediante análisis de imágenes por software o mediante el conteo manual del número total de células marcadas.Tratar los islotes intactos con microesferas de PLGA de factor de crecimiento del tejido conectivo humano recombinante durante tres días, tal como se acaba de demostrar, resulta en un aumento de la proliferación de células beta, lo que demuestra que la proteína no pierde funcionalidad durante la generación de microesferas. Una vez dominada, esta técnica puede producir resultados en menos de una semana si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el impacto sobre la proliferación de células beta en su experimento variará según el compuesto de interés y la cinética exacta de liberación de las microesferas generadas.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la coimplantación de microesferas cargadas con compuestos junto con islotes pancreáticos intactos, para abordar otras preguntas, tales como si el compuesto de interés puede inducir la proliferación de células beta in vivo. El PLGA tiene un historial de uso en dispositivos y sistemas de administración de fármacos que han sido aprobados por la FDA, por lo que representa una buena opción para investigadores y clínicos que buscan entregar cargas terapéuticas a tejidos definidos durante un período prolongado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar microesferas de PLGA cargadas con compuestos y administrarlas a islotes intactos en cultivo.No olvide que trabajar con paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como usar el equipo de protección personal adecuado, al realizar este procedimiento.

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Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

Presentamos aquí un protocolo para el aislamiento de islotes del modelo de ratón de diabetes tipo 2, Leprdb y detalles de un ensayo de células vivas para la medición de la secreción de insulina de islotes intactos que utiliza microscopía de 2 fotones.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modelo de ratón de la Diabetes Tipo 2: El aislamiento de los islotes pancreáticos y células en Vivo 2-Photon imágenes de islotes intactos

Este protocolo demuestra el aislamiento de los islotes murinos y la siembra en un andamio decelularizado. Los islotes soportados por el andamio fueron trasplantados en la almohadilla de grasa epididimal de ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina (STZ). Los islotes sobrevivieron en el sitio del trasplante e invirtieron la condición hiperglucémica.

Transplante de islotes en el cojín de grasa epididimal de ratones diabéticos

Este protocolo de aislamiento de islotes describió una novedosa vía de inyección de colagenasa para digerir el tejido exocrina y un procedimiento de gradiente simplificado para purificar los islotes de ratones. Implica digestión enzimática, separación/purificación de gradientes y selección manual de islos. El aislamiento exitoso puede producir entre 250 y 350 islotes de alta calidad y completamente funcionales por ratón.

Un protocolo simple de alta eficiencia para el aislamiento de islotes pancreáticos de ratones

Se introduce un método para el trasplante omental de islotes en un ratón. Los islotes aislados se mezclan con hidrogel y la mezcla se coloca en la bolsa omental de un ratón diabético. Luego, se controla la glucosa en la sangre, y se realiza el análisis inmuno-histoquímico.

Un método para el trasplante de islotes pancreáticos para el epiplón en ratón

Trasplante de islotes pancreáticos es una manera de lograr normoglycemia en diabetes tipo 1. Este artículo se centra en la técnica de trasplante vía intraportal para mantener niveles normales de glucosa en ratones diabéticos.

Intraportal trasplante de islotes pancreáticos en modelo murino

Aquí, presentamos un protocolo para la validación in vivo de terapia celular basada en hidrogel, ilustrada por el ejemplo del trasplante de islotes pancreáticos. Islote de matriz h-Omental (hOMING) implantación de relleno permite la implantación de una mezcla de células-hidrogel entre las capas omentales, cerca de los vasos sanguíneos, para maximizar el engraftment en un ambiente metabólico adecuado.

Trasplante de islotes intra-Omental utilizando relleno de islote de matriz h-Omental (hOMING)

En este protocolo, se describe un método de aislamiento de islotes murinos y trasplante en el tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal. Los islotes murinos sinémicos aislados se trasplantan en un receptor murino utilizando un hidrogel de membrana del sótano. Se controla el nivel de glucosa en sangre de los receptores y se realiza un análisis histológico de los injertos de islos.

Modelo de trasplante de tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal (ISWAT) de islotes murinos

Aquí presentamos procedimientos quirúrgicos refinados para realizar con éxito el trasplante intraportal de islotes, un procedimiento quirúrgico clínicamente relevante pero técnicamente desafiante, en ratones.

Minimizar el sangrado de la vena porta posterior a la infusión durante el trasplante intrahepático de islotes en ratones

Este estudio desarrolló un método simplificado para extraer eficientemente islotes primarios funcionales y células acinas del páncreas del ratón, ofreciendo una herramienta valiosa para estudiar la comunicación intercelular en la patogénesis de la Diabetes Inducida por Pancreatitis Aguda.

Un método sencillo y rápido para el aislamiento simultáneo de islotes primarios y células acinares pancreáticas primarias de ratones

Proporcionamos un protocolo mínimamente invasivo para el trasplante intramuscular de islotes de células madre pancreáticas derivadas de células madre humanas en ratones inmunodeficientes, para implantación in vivo y análisis posteriores.

Trasplante intramuscular de células endocrinas pancreáticas derivadas de células madre pluripotentes humanas en ratones

Aprende a administrar microesferas PLGA biodegradables a islotes pancreáticos de ratón ex vivo para estudiar la proliferación de células beta. Este método permite la liberación sostenida de compuestos con aplicaciones terapéuticas en diabetes.

Administración sostenida de mitógenos de células β de los islotes intactos mouse Ex Vivo Uso Biodegradable poli (ácido láctico-co-glicólico) Microesferas (Video) | JoVE Journal

Administración sostenida de mitógenos de células β de los islotes intactos mouse

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