Administración sostenida de mitógenos de células β de los islotes intactos mouse

El objetivo general de este protocolo es utilizar microesferas de ácido poli(láctico-co-glicólico) o PLGA para entregar compuestos de interés a islotes pancreáticos intactos en cultivo, con el fin de estudiar los efectos de compuestos individuales sobre la proliferación de células beta pancreáticas adultas. Este método puede utilizarse para probar una variedad de compuestos entregados localmente de manera sostenida a islotes intactos. La principal ventaja de este método es que puede adaptarse fácilmente a biomateriales alternativos de entrega, compuestos de interés y ensayos de punto final.

Este método también tiene el potencial de administrar compuestos de interés junto con la transferencia adoptiva de islotes in vivo. Taylor Kavanaugh, el estudiante de posgrado en mi laboratorio, demostrará cómo se preparan las microesferas de PLGA. Comience añadiendo un miligramo del compuesto de interés marcado con fluorescencia a 100 microlitros de agua desionizada para formar la primera fase acuosa.

A continuación, disuelva 65 miligramos de PLGA en 750 microlitros de diclorometano en un vial de centelleo y sonicar la mezcla durante 10 a 30 segundos a 160 vatios para disolver completamente el PLGA. Esto forma la fase oleosa. Añada toda la primera fase acuosa a la fase oleosa gota a gota.

Luego, utilice un homogenizador portátil para emulsionar la solución a 20.000 rpm durante 30 segundos, formando la primera fase agua-aceite. A continuación, agregue toda la primera fase agua-aceite gota a gota en 15 mililitros de una solución al 1% de PVA y emulsione tal como se acaba de demostrar. A continuación, transfiera todo el volumen de la emulsión a un matraz redondo de fondo redondo de 200 mililitros y utilice un evaporador rotatorio para eliminar el disolvente y generar la fase acuosa, bajo vacío de 635 milímetros de mercurio durante una hora.

Aliquotar un mililitro de la fase acuosa en cada uno de 14 tubos de microcentrifugado y pelotizar las microesferas mediante centrifugación. Al final de la centrifugación, usar una micropipeta para eliminar 900 microlitros de la solución acuosa de cada tubo, teniendo cuidado de no perturbar los pellets. Lavar las microesferas con un mililitro de agua desionizada, seguido de la eliminación cuidadosa de 900 microlitros del sobrenadante.

Luego, agregue 900 microlitros de agua desionizada a los 100 microlitros restantes de los sobrenadantes. A continuación, mezcle brevemente por vórtex y someta a sonicación para resuspender los precipitados. Después de aislar los islotes de los animales experimentales de interés, siembre 40 islotes con tamaño visualmente comparable en un pocillo de una placa de cultivo tisular de 96 pocillos con 200 microlitros de medio de cultivo para islotes.

A la mañana siguiente, re suspenda un alícuota de microesferas en medio previo al ensayo, de modo que la concentración final del compuesto de interés en el tubo sea de 10 nanogramos por microlitro, y someta las microesferas a sonicación en un baño de hielo y agua durante 10 minutos a 160 vatios con pulsos de 10 segundos a cuatro grados Celsius. A continuación, retire cuidadosamente 100 microlitros de medio de cultivo de islotes de cada pocillo sin desalojar los islotes, e incube los cultivos con 100 microlitros del medio de ensayo que contiene microesferas. Después de tres días, deseche cuidadosamente el medio de ensayo de todos los pocillos sin perturbar los islotes, y lave suavemente los islotes dos veces con 200 microlitros de PBS.

Los islotes solo se adhieren débilmente a una placa de 96 pocillos. Por lo tanto, es fundamental retirar cuidadosamente el medio y el PBS de cada pocillo para no desalojar ni desechar accidentalmente los islotes. Después del segundo lavado, sumerja suavemente los islotes en 100 microlitros de solución de tripsina-EDTA durante tres minutos a temperatura ambiente, realizando pipeteo suave después de dos minutos.

Transfiera todo el volumen de cada pocillo a tubos individuales de microcentrífuga y agregue 400 microlitros de medio de cultivo de islotes a cada tubo para detener la disociación. Después de recolectar los islotes tratados con microesferas mediante centrifugación, use una micropipeta para retirar suavemente los sobrenadantes y resuspender los sedimentos en 200 microlitros de medio fresco de cultivo de islotes. Luego, centrifugue los islotes disociados sobre portaobjetos cargados en un citocentrífugo.

Tras secar al aire, dibuje un recuadro alrededor de los islotes con un rotulador hidrófobo y fije las células en 75 µL de paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 10 minutos, seguido de dos lavados con 75 µL de PBS. Tras el segundo lavado, permeabilice las células con 75 µL de Tritón X-100 al 0,2% en PBS durante 10 minutos, seguido de un lavado final con 75 µL de PBS solo. Para inmunomarcar los islotes, comience colocando las laminillas con el lado de las células hacia arriba en una cámara húmeda y retire el PBS.

A continuación, bloquee la unión no específica con 75 microlitros de suero de asno normal a temperatura ambiente. Después de una hora, sustituya el suero por 75 microlitros del anticuerpo primario de interés durante otra hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, aspire cuidadosamente la solución del anticuerpo primario y lave las muestras con lavados de 375 microlitros de PBS.

Luego, incubar los islotes con 75 microlitros del anticuerpo secundario marcado con inmunofluorescencia apropiado durante una hora a temperatura ambiente protegidos de la luz. Al final de la incubación, reemplazar la solución de anticuerpo secundario con 75 microlitros de Dappy durante tres minutos, seguido de un enjuague de cinco minutos con agua desionizada. Al final del lavado, colocar una gota de 100 microlitros de solución de montaje de secado rápido que contiene reactivo anti-desvanecimiento sobre un portaobjetos de vidrio e invertir un portaobjetos, con la muestra hacia abajo, sobre la solución de montaje.

La fracción más grande de microesferas estará entre 1 y 10 micrones de diámetro, aunque algunas microesferas pueden ser más grandes. Tras la dispersión de los islotes tratados con microesferas de PLGA intactas y su posterior inmunomarcado, es común observar regiones de la muestra sin ningún marcado entre las células, causadas por microesferas intactas que no se han eliminado completamente durante los pasos de lavado. Después del análisis de imágenes, el porcentaje de células positivas para insulina y Ki67 puede cuantificarse mediante análisis de imágenes por software o mediante el conteo manual del número total de células marcadas.

Tratar los islotes intactos con microesferas de PLGA de factor de crecimiento del tejido conectivo humano recombinante durante tres días, tal como se acaba de demostrar, resulta en un aumento de la proliferación de células beta, lo que demuestra que la proteína no pierde funcionalidad durante la generación de microesferas. Una vez dominada, esta técnica puede producir resultados en menos de una semana si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el impacto sobre la proliferación de células beta en su experimento variará según el compuesto de interés y la cinética exacta de liberación de las microesferas generadas.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la coimplantación de microesferas cargadas con compuestos junto con islotes pancreáticos intactos, para abordar otras preguntas, tales como si el compuesto de interés puede inducir la proliferación de células beta in vivo. El PLGA tiene un historial de uso en dispositivos y sistemas de administración de fármacos que han sido aprobados por la FDA, por lo que representa una buena opción para investigadores y clínicos que buscan entregar cargas terapéuticas a tejidos definidos durante un período prolongado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar microesferas de PLGA cargadas con compuestos y administrarlas a islotes intactos en cultivo.

No olvide que trabajar con paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como usar el equipo de protección personal adecuado, al realizar este procedimiento.