Name: Técnicas de Imagen y Prometafase metafase de la meiosis I en fijo Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprende a preparar oocitos de Drosophila para examinar el ensamblaje del huso y la orientación cromosómica durante la meiosis I mediante inmunofluorescencia. Este protocolo permite visualizar la dinámica cromosómica in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Christian Lehner por proporcionar el anticuerpo CENP-C y a Eric Joyce por sus recomendaciones sobre FISH. El trabajo en el laboratorio de McKim fue financiado por una subvención de los NIH (GM101955).

Nota: Los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. incubadoras de temperatura controlada se utilizan para mantener las temperaturas para la cría de mosca y cruces a menos que se indique lo contrario. 1. Preparativos <ol><li> Preparar moscas. <ol><li> Prometafase enriquecido con colecciones de ovocitos. <ol><li> Claro moscas adultas jóvenes a partir de valores o transversales cultivos sanos,. botellas de edad para los dos días a 25 ° C. NOTA: Por lo general dos botellas sanas serán suficientes, aunque más pueden ser necesarios para algunas culturas cruzadas. </li><li> Después de dos días, recoger ~ 100 a 300 mujeres (que son de 0 a 2 días de edad en este punto) de las botellas. Las hembras no tienen que ser vírgenes. Añadir una pequeña cantidad de pasta de levadura a un lado de un vial y colocar 30 hembras y 10 machos y 15 cada uno en los viales yeasted. viales de edad para los dos días a 25 ° C. </li></ol></li><li> Metafase-enriquecido ovocitos Colecciones. <ol><li> Recoger ~ 100 a 300 hembras de valores o cruz culturES. Añadir una pequeña cantidad de pasta de levadura a un lado de un vial y colocar cada 30 hembras (sin machos añadidos) en los viales yeasted. viales de edad para los tres a cinco días a 25 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Preparar soluciones. Nota: Las soluciones se pueden almacenar indefinidamente a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario. <ol><li> Prepárese Modificado Buffer de Robb (5x): mM HEPES 500, sacarosa 500 mM, acetato de sodio 275 mM, acetato de potasio 200 mM, glucosa 50 mM, cloruro de magnesio 6 mM, y cloruro de calcio 5 mM. Utilice 10 N 11: 8 de hidróxido de sodio: hidróxido de potasio para llevar el pH a 7,4. Esterilizar por filtración; No esterilizar en autoclave. Almacenar a -20 ° C. Descongelar según sea necesario para preparar ~ 200 ml de 1x de Robb por oocito de preparación. </li><li> Soluciones de fijación. <ol><li> Opción # 1: Preparar la fijación de formaldehído / heptano. Preparar Fijación Buffer: solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) más sacarosa 150 mM. Para utilizar, hacer fresco con 687,5 l Fijación de amortiguamiento y 312,5 l 16% de formaldehídopor la preparación de los ovocitos. PRECAUCIÓN: Use guantes durante el uso de soluciones de formaldehído en una campana de humos. Eliminar los residuos de acuerdo con las directrices institucionales. </li><li> Opción # 2: Preparar la fijación de formaldehído / cacodilato. Preparar la mezcla Fix: sacarosa 250 mM, 100 mM de acetato de potasio (pH 7,5), acetato de sodio 25 mM (pH 7,0), y EGTA 25 mM (pH 8,0). Para utilizar, hacen fresco con 400 l Fix Mix, 100 l de cacodilato de potasio (1 M, pH 7,2), y 500 l 16% de formaldehído por la preparación de los ovocitos. PRECAUCIÓN: cacodilato de potasio contiene arsénico. </li></ol></li><li> Preparar PBS / Triton X-100: 1x PBS más 1% o 0,05% de Triton X-100. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Preparar PBS-Tween 20-albúmina de suero bovino (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w / v), y 0,1% de Tween-20. Puede ser almacenado a 4 ° C durante una semana. </li><li> La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) Soluciones. <ol><li> Preparar cloruro de sodio-20X citrato de sodio (SSC): cloruro de sodio 3 M y citrato de sodio 0,3 M. </li><li> Preparar 2x SSC-Tween-20 (SSCT): 2x SSC más 0,1% de Tween-20. Hacer frescas, ~ 20 ml por la preparación de los ovocitos. </li><li> Preparar soluciones de formamida: 2x SSC, 0,1% de Tween-20, además de formamida. Hacer fresca, 1 ml 20% de formamida, 0,5 ml 40% de formamida, y 2 ml 50% de formamida por prep ovocito. PRECAUCIÓN: Use guantes durante el uso de soluciones de formamida en una campana de humos. Eliminar los residuos de acuerdo con las directrices institucionales. </li><li> Preparar la solución de hibridación: 2 x SSC, formamida al 50%, y 10% de sulfato de dextrano (w / v). Almacenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Las sondas FISH. <ol><li> Oligonucleótidos orden (véase la Tabla 1 para las secuencias) con la purificación por HPLC y la deseada 5 &#39;modificación fluorescente (por ejemplo, Cy3 o Cy5). Resuspender en tampón Tris-EDTA (TE) a 50 ng / l. NOTA: Proteja oligos de exposición a la luz en todo momento. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Recolección de etapa tardía de Drosophila ovocitos <ol><li> Como <em&gt; ovocitos Drosophila con membranas intactas se pegue a plástico y vidrio, pre-recubrir el interior de un tubo de 5 ml y una pipeta Pasteur por prep ovocito con PTB. </li><li> Anestesiar a todos ~ 100 a 300 moscas yeasted con dióxido de carbono y añadir a un mezclador que contenía ~ 100 ml 1x Buffer de Robb. Pulso tres veces (~ 1 seg cada uno). Mantener en ovocitos de Robb para &lt;20 min para evitar la activación. NOTA: Como alternativa, los ovocitos pueden ser a mano disecados de las hembras. La ventaja de este método es que requiere menos hembras. Sin embargo, se debe tener cuidado para limitar la exposición a dióxido de carbono a unos pocos minutos para evitar artefactos asociados con la hipoxia 7. </li><li> Se filtra a través de malla grande (~ 1.500 m) en 250 ml vaso de precipitados para eliminar grandes partes del cuerpo. Si muchos abdómenes intactos permanecen en material de malla, re-molienda usando tampón adicional de Robb, y el filtro de nuevo. Dejar reposar ~ 2 min, luego aspirar fuera de la capa superior, la eliminación de la mayor cantidad de grandes partes del cuerpo como sea posible. </li><li> Fifiltro a través de malla pequeña (~ 300 micras) en un vaso de precipitados de 250 ml. Enjuague ovocitos restantes de cada primer vaso de precipitados utilizando adicional de Robb y recubiertos pipeta Pasteur. Dejar reposar ~ 3 min; ovocitos se asentarán. Aspirar todos, pero ~ 10 ml. </li><li> Verter la mayor cantidad de 10 ml como se ajusta a revestida tubo de 5 ml. Dejar reposar, remover el líquido, y repetir con residuo. Enjuague oocitos restantes de vaso de precipitados utilizando adicional pipeta Pasteur de Robb y revestido. Deje asentarse en 5 ml tubo por unos 3-5 minutos. </li></ol> 3. Tratamientos farmacológicos (Opcional) <ol><li> Escudo un segundo tubo de 5 ml con PTB para cada preparación de los ovocitos. Añadir disolvente apropiado (control) o el medicamento a 1 ml de Robb cada uno para cada preparación de ovocitos (Tabla 2). </li><li> ovocitos divididos en un segundo tubo recubierto de 5 ml. Dejar reposar, eliminar el líquido, y añadir 1 ml de Robb más disolvente en un tubo y 1 ml de Robb más fármaco en segundo tubo. Inclinar la cabeza para la cantidad de tiempo apropiado para el tratamiento de drogas (Tabla 2). Let asiente. </li></ol> 4. Fijación <ol><li> Aspirar todo el líquido e inmediatamente añadir 1 ml Fix. </li><li> Opción # 1: El formaldehído / heptano fijación (fijación de búfer más el 5% de formaldehído). <ol><li> Fijar durante 2,5 minutos en un nutator. Añadir 1 ml de heptano y agitar 1 min. Dejar reposar ~ 1 min. </li><li> Eliminar todo el líquido, y luego agregar 1 ml de PBS 1x. Vortex 30 seg. Dejar reposar ~ 1 min. </li><li> Eliminar todo el líquido, y luego llenar el tubo con PBS 1x. NOTA: Los ovocitos se pueden utilizar inmediatamente o mantenerse en el nutator durante varias horas a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Opción # 2: la fijación de formaldehído / cacodilato (Fix Mix Plus 8% de formaldehído y cacodilato 100 mM). <ol><li> Fijar durante 6 minutos en un nutator. Dejar reposar 2 min. Retire el líquido, y luego llenar el tubo con PBS 1x. NOTA: Los ovocitos se pueden utilizar inmediatamente o mantenerse en el nutator durante varias horas a temperatura ambiente. </li></ol></li></ol> 5. Extracción de Membranas ( &quot;Rolling&quot;) <ol><li> Usando recubierto pipeta Pasteur, añadir ~ 500 a 1000 ovocitos a la parte esmerilado (chorro de arena) de un portaobjetos de vidrio. Retirar todas las partes del cuerpo y materiales extraños con unas pinzas. No deje que se sequen los ovocitos; añadir 1x PBS como sea necesario. </li><li> Colocar un cubreobjetos en la parte superior de los ovocitos y suavemente ovocitos &quot;rollo&quot; hasta que todas las membranas se retiran (arrastrando el borde del cubreobjetos a través de los ovocitos que funciona mejor.) Controlar periódicamente el progreso bajo el microscopio, la adición de más 1x PBS como sea necesario. Tenga cuidado puesto que demasiada presión va a destruir los ovocitos. NOTA: Por inmunofluorescencia solamente, continúe con el paso 6. Para los peces (con o sin inmunofluorescencia), continúe con el paso 7. </li></ol> 6. Anticuerpo La tinción de Drosophila ovocitos <ol><li> Extracción y bloqueo <ol><li> Enjuague ovocitos enrollado en un tubo cónico de 15 ml que contiene 15 ~ ml de PBS / 1% de Triton X-100. ovocitos inclinar la cabeza en esta solución durante no menos de 1,5 horas y no más de 2 horas.Este paso permite la penetración de anticuerpos. </li><li> Deje que los ovocitos se asientan ~ 2 min. Retire el líquido junto con el mayor número de membranas como sea posible, a continuación, añadir PBS / 0,05% de Triton X-100. NOTA: Las membranas se asentarán más lento que los ovocitos laminados. </li><li> Deje que los ovocitos se asientan ~ 2 minutos, luego retire todos menos ~ 1 ml de líquido. ovocitos de transferencia a graduaron tubo de 1,5 ml y eliminar el líquido residual. Añadir 1 ml PTB para el bloqueo y inclinar la cabeza durante 1 hora. </li></ol></li><li> La tinción de anticuerpos <ol><li> Pre-absorción de anticuerpos secundarios contra embriones. NOTA: Este paso elimina la tinción de fondo de las interacciones de anticuerpos no específicos con proteínas de Drosophila. <ol><li> Recoger y fijar embriones de Drosophila (~ 25 l) por procedimiento típico 8. Almacenar en metanol a -20 ° C. </li><li> Eliminar el metanol a partir de embriones, añadir 800 l de metanol más 200 l de 1x PBS, y inclinar la cabeza durante 15 minutos. Retire 500 l de sobrenadante y reemplazar con 500 l de PBS 1x. Luego inclinar la cabeza durante 15 minutos. Repetir dos veces (para un total de ~ 1 hr de lavados), y luego terminar en el PTB. NOTA: Los embriones se puede usar inmediatamente o mantenerse en el nutator para varias horas a temperatura ambiente. </li><li> Retire el líquido, se llenan de PTB a 200 l por la preparación de los ovocitos, y añadir anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia a las diluciones apropiadas (teniendo en cuenta que el volumen final será de 300 l;. Véase el paso 7.4) titubear a 4 ° C durante la noche (preferible) o a temperatura ambiente durante 3-4 h. NOTA: Los anticuerpos pre-absorción se utilizó en el paso 6.2.4. NOTA: Mantener las muestras en la oscuridad tanto como sea posible una vez que los anticuerpos fluorescentes se han añadido. </li></ol></li><li> Retire el líquido a partir de ovocitos, se llenan de PTB a 300 l, y añadir anticuerpos primarios en diluciones adecuadas. Inclinar la cabeza a 4 ° C durante la noche (preferible) o a temperatura ambiente durante 3-4 h. </li><li> Lavar los ovocitos cuatro veces durante 15 minutos cada uno con 1 ml PTB. </li><li> retirarlíquido de ovocitos, añadir 200 l de sobrenadante a partir de embriones (pre-absorción anticuerpos secundarios). Luego llene con PTB para 300 l. Inclinar la cabeza a temperatura ambiente durante 3-4 h (preferible) o a 4 ° C durante la noche. </li><li> Lavar los ovocitos de una vez por 15 min con 1 ml PTB, eliminar el líquido. A continuación, añadir 0,5 l Hoechst 33342 y 500 l PTB y inclinar la cabeza durante 7 minutos. </li><li> Lavar los ovocitos dos veces durante 15 minutos cada uno con 1 ml PTB. NOTA: Los ovocitos se pueden montar en un portaobjetos inmediatamente o se pueden almacenar en PTB a 4 ° C hasta el momento de formación de imágenes. </li></ol></li></ol> 7. FISH (Continúe desde el paso 5 anterior) <ol><li> Enjuague ovocitos enrollados en un tubo cónico de 15 ml que contiene 15 ml ~ 2x ECSS. Deje que los ovocitos se asientan ~ 2 min. Deje únicamente ~ 0,5 ml de líquido junto con el mayor número posible de las membranas. NOTA: Las membranas se asentarán más lento que los ovocitos laminados. </li><li> Transferencia de ovocitos a 0,5 ml tubo y remover el líquido remanente. Sucesivamente añadir y eliminar 500 l20%, 40%, y 50% de formamida soluciones, nutación para 10 min en cada solución. NOTA: Los ovocitos se asentarán más lento con porcentajes más altos de formamida. </li><li> Retire el líquido, a continuación, añadir la solución de formamida 500 l 50%, y de inclinar la cabeza a 37 ° C durante 1 a 5 horas. NOTA: El aumento de las incubaciones dan como resultado una mejor penetración de la sonda. </li><li> Retire el líquido, dejando tras de no más de ~ 100 ovocitos mu l, y añadir 36 l solución de hibridación más 2 l de sonda (50 ng / l) y 2 l de agua o 2 l de una sonda de 2 nd (Tabla 1). </li><li> Incubar a 91 ° C durante 3 min (FISH solamente) o 80 ° C durante 20 min (FISH además de inmunofluorescencia), seguido de incubación en un baño de agua a 37 ° durante la noche. NOTA: Estos pasos pueden llevarse a cabo en un termociclador. </li><li> No eliminar el líquido. Añadir 500 l 50% de solución de formamida y inclinar la cabeza a 37 ° C durante 1 hr. </li><li> Dejar reposar, eliminar el líquido, añadir solución de formamida 500 l 50%, unad inclinar la cabeza a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Dejar reposar, eliminar el líquido, añadir solución de formamida 500 l 20%, y de inclinar la cabeza a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Realizar tres lavados rápidos en 500 l 2x ECSS (dejar reposar, desenchufar y añadir líquido, invertir varias veces, repetir.) Dejar reposar, eliminar el líquido, a continuación, añadir 500 l PTB y inclinar la cabeza durante 4 horas. </li></ol> 8. tinción de anticuerpos después de FISH <ol><li> Retire el líquido a partir de ovocitos, se llenan de PTB a 300 l, y añadir 10 l de anticuerpo anti-α-tubulina conjugado con FITC. Alternativamente, otros anticuerpos se pueden utilizar, siguiendo el protocolo anteriormente. Inclinar la cabeza a temperatura ambiente durante la noche. </li><li> Lavar los ovocitos una vez durante 15 minutos con 500 l PTB, eliminar el líquido, a continuación, añadir 0,5 l Hoechst 33342 y 500 l PTB y inclinar la cabeza durante 7 minutos. </li><li> Lavar los ovocitos dos veces durante 15 minutos cada uno con 500 l PTB. NOTA: Los ovocitos se pueden montar en un portaobjetos inmediatamente o se pueden almacenar en PTB a 4 ° C hasta el momento deformación de imágenes. Mantenga ovocitos en la oscuridad tanto como sea posible una vez que los anticuerpos fluorescentes se han añadido. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Repetir Nombre </td><td fo:width="1in"> Cromosoma </td><td> Oligo Secuencia * </td></tr><tr><td> 359 </td><td> x </td><td> GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC </td></tr><tr><td> AACAC </td><td> 2 </td><td> AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC </td></tr><tr><td> dodecaedro </td><td> 3 </td><td> CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT </td></tr><tr><td> 1,686 </td><td> 2 + 3 </td><td> AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG </td></tr><tr><td> AATAT </td><td> 4 (+ Y) </td><td> AATATAATATAATATAATATAATATAATAT </td></tr><tr><td colspan="3"> * 359 secuencia de Eric Joyce, comunicación personal, otras secuencias de Sullivan et al. 8 </td&gt; </tr></tbody></table> Tabla 1: sondas FISH para repeticiones centroméricas Drosophila. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Droga </td><td> Solvente </td><td> de la concentración </td><td> La concentración final </td><td> Tiempo de tratamiento </td><td> Efecto </td></tr><tr><td> colchicina </td><td> etanol </td><td> 125 mM </td><td> 150 M </td><td> 10 min o 30 min </td><td> desestabilizar no cinetocoro (10 min) 9 o todos los microtúbulos (30 min) </td></tr><tr><td> paclitaxel </td><td> DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 10 micras </td><td> 10 minutos </td><td> estabilizar micrófonorotubules </td></tr><tr><td> Binucleine 2 </td><td> DMSO </td><td> 25 mM </td><td> 25 M </td><td> 20 minutos </td><td> inhibir la quinasa Aurora B 10 </td></tr></tbody></table> Tabla 2: El tratamiento con medicamentos.

<ol><li>Bridges, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-disjunction+as+proof+of+the+chromosome+theory+of+heredity%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity.</a> Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+err+%28meiotically%29+is+human%3A+the+genesis+of+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li>
<li>Theurkauf, W. E., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+spindle+assembly+in+Drosophila+females%3A+behavior+of+nonexchange+chromosomes+and+the+effects+of+mutations+in+the+nod+kinesin-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Meiotic spindle assembly in Drosophila females: behavior of nonexchange chromosomes and the effects of mutations in the nod kinesin-like protein.</a> J Cell Biol. 116 (5), 1167-1180 (1992).</li>
<li>Zou, J., Hallen, M. A., Yankel, C. D., Endow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microtubule-destabilizing+kinesin+motor+regulates+spindle+length+and+anchoring+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A microtubule-destabilizing kinesin motor regulates spindle length and anchoring in oocytes.</a> J Cell Biol. 180 (3), 459-466 (2008).</li>
<li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+a+role+for+heterochromatin+in+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation.</a> Cell. 86 (1), 135-146 (1996).</li>
<li>Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congression+of+achiasmate+chromosomes+to+the+metaphase+plate+in+Drosophila+melanogaster+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes.</a> Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).</li>
<li>Gilliland, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+transiently+sequesters+mps1+and+polo+to+collagenase-sensitive+filaments+in+Drosophila+prometaphase+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hypoxia transiently sequesters mps1 and polo to collagenase-sensitive filaments in Drosophila prometaphase oocytes.</a> PLoS One. 4 (10), e7544(2009).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Radford, S. J., Hoang, T. L., Głuszek, A. A., Ohkura, H., McKim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+and+End-On+Kinetochore+Attachments+Are+Coordinated+to+Achieve+Bi-orientation+in+Drosophila+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Lateral and End-On Kinetochore Attachments Are Coordinated to Achieve Bi-orientation in Drosophila Oocytes.</a> PLoS Genet. 11 (10), e1005605(2015).</li>
<li>Smurnyy, Y., Toms, A. V., Hickson, G. R., Eck, M. J., Eggert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binucleine+2%2C+an+isoform-specific+inhibitor+of+Drosophila+Aurora+B+kinase%2C+provides+insights+into+the+mechanism+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Binucleine 2, an isoform-specific inhibitor of Drosophila Aurora B kinase, provides insights into the mechanism of cytokinesis.</a> ACS Chem Biol. 5 (11), 1015-1020 (2010).</li>
<li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li>
<li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li>
<li>Tavosanis, G., Llamazares, S., Goulielmos, G., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+gamma-tubulin+in+the+acentriolar+female+meiotic+spindle+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Essential role for gamma-tubulin in the acentriolar female meiotic spindle of Drosophila.</a> EMBO J. 16 (8), 1809-1819 (1997).</li>
<li>Endow, S. A., Komma, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+dynamics+during+meiosis+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spindle dynamics during meiosis in Drosophila oocytes.</a> J Cell Biol. 137 (6), 1321-1336 (1997).</li>
<li>Matthies, H. J., Clarkson, M., Saint, R. B., Namba, R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatthies%2C+HJ+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 67-85 (2000).</li>
<li>Colombié, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+of+Incenp+crucial+to+the+assembly+of+the+acentrosomal+metaphase+spindle+in+female+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dual roles of Incenp crucial to the assembly of the acentrosomal metaphase spindle in female meiosis.</a> Development. 135 (19), 3239-3246 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Puesta en escena de Drosophila ovocitos Aunque un cariosoma alargado se ve a menudo en los ovocitos prometaphase, utilizando cariosoma forma de distinguir a partir de ovocitos en metafase prometaphase puede ser problemático. Durante prometaphase, el cariosoma comienza como una forma redonda, se alarga, y se retira a una forma redonda como el ovocito se aproxima a la detención en metafase. Esto significa que muchos ovocitos prometaphase no tienen un cariosoma alargad...

El estudio de la meiosis a veces se describe como la "genética de la genética". Esto se debe a que las propiedades fundamentales de la herencia cromosómica y la selección independiente se llevan a cabo a través de la segregación de cromosomas durante la producción de gametos. Una demostración importante de la teoría cromosómica de la herencia llegó en 1916 a partir del trabajo de Calvin Bridges en Drosophila melanogaster1. Este y otros estudios de genética clásica en Drosophila contribuyeron en gran medida a nuestra comprensión de la genética. Sin embargo, el examen citológico de los cromosomas meióticos en ovocitos de Drosophila ha sido un desafío. Esto se debe principalmente a que la inmunofluorescencia de los ovocitos de Drosophila en etapa tardía, cuando el huso se ensambla y los cromosomas se orientan para la segregación, se ve obstaculizada por la presencia de membranas que hacen que el ovocito sea impenetrable para los anticuerpos.
A pesar de este desafío, los ovocitos de Drosophila siguen siendo un modelo atractivo para el estudio del comportamiento cromosómico y el ensamblaje del huso. Esto se debe a las poderosas herramientas genéticas disponibles en Drosophila, pero también porque los ovocitos se detienen en la metafase I, cuando los cromosomas están orientados y el huso está completamente formado. Esto facilita la recolección y el examen de un gran número de ovocitos en esta importante etapa de la división celular. Además, un organismo modelo simple que sea susceptible de manipulación genética para el estudio de la segregación de los cromosomas de los ovocitos puede proporcionar una contribución importante a nuestra comprensión de la salud reproductiva humana. Los errores en el número de cromosomas son la principal causa genética de aborto espontáneo y defectos congénitosen los seres humanos. La mayoría de estos errores se pueden rastrear hasta el ovocito y se correlacionan con el aumento de la edad materna. La edad promedio de las madres en los EE. UU. ha ido en aumento, lo que la convierte en un importante problema de salud pública.
Describimos aquí métodos para el examen citológico de ovocitos de Drosophila, incluyendo una demostración de cómo eliminar las membranas de los ovocitos. Estos métodos son modificaciones de los protocolos descritos por primera vez por Theurkauf y Hawley3, Zou et al.4, y Dernburg et al.5. También incluimos métodos para el enriquecimiento de diferentes estadios de los ovocitos, basados en un protocolo descrito por primera vez por Gilliland et al.6. Por último, añadimos instrucciones para el tratamiento farmacológico de los ovocitos de Drosophila. Juntos, estos métodos permiten la investigación citológica de la segregación cromosómica de los ovocitos y el ensamblaje del huso en Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Tubos cónicos de 15 ml</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% de formaldehído</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>18505</td><td>PELIGROSO; una vez abierto, deséchelo después de un mes</td></tr><tr><td>Vasos de precipitados de 250 ml</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubos de 5 ml</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>levadura seca activa</td><td>Varios</td><td></td><td>mezclar con agua para hacer una pasta la consistencia de la mantequilla de maní</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-&alfa;-tubulina conjugado con FITC</td><td>Sigma</td><td>F2168</td><td>clon DM1A</td></tr><tr><td>Binucleina 2</td><td>Sigma</td><td>B1186</td><td>HAZARDOUS</td></tr><tr><td>mezclador</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>albúmina de suero bovino</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de calcio</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>colchicina</td><td>Sigma</td><td>C-9754</td><td>HAZARDOUS</td></tr><tr><td>cubreobjetos</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>N° 1 1/2</td></tr><tr><td>sulfato de dextrano</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pinzas</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>5622</td><td>Pinzas Dumont de alta precisión estilo 5</td></tr><tr><td>formamida</td><td>Sigma</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de vidrio</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>glucosa</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubos graduados de 1,5 ml</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>EM-5330</td><td>disponibles en varios proveedores</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cloruro de magnesio</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mallas grandes (~ 1,500 y micro; m)</td> <td>VWR</td><td>AA43657-NK</td><td>variedad de formatos y otros proveedores, malla pequeña de 12 o 14 mallas</td></tr><tr><td>(~300 y micro; m)</td><td>Laboratorios de espectro</td><td>146 424</td><td>variedad de formatos, p. ej., 146 422 o 146 486</td></tr><tr><td>nutator</td><td>Varias</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipetas Pasteur</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>acetato de potasio</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido cacodílico</td><td>Sigma</td><td>C0125</td><td>PELIGROSO; Alternativamente, se puede sustituir el cacodilato de sodio</td></tr> por <tr><td>potasio hidróxido</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>acetato de sodio</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cloruro de sodio</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sacarosa</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>taxol (paclitaxel)</td><td>Sigma</td><td>T1912</td><td>PELIGROSO</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>PI-28314</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>PI-28320</td><td></td></tr><tr><td>vórtice</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

técnicas de imagen y prometafase metafase de la meiosis i en fijo<em&gt; drosophila</emlos ovocitos&gt;

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

La segregación cromosómica en los ovocitos humanos es propensa a errores, lo que resulta en aneuploidía, que es la principal causa genética de abortos espontáneos y defectos congénitos. El estudio del comportamiento cromosómico en ovocitos a partir de organismos modelo es muy prometedor para descubrir las bases moleculares de la susceptibilidad de los ovocitos humanos a la aneuploidía. Drosophila melanogaster es susceptible a la manipulación genética, con más de 100 años de investigación, comunidad y desarrollo de técnicas. Sin embargo, la visualización del comportamiento cromosómico y el ensamblaje del huso en los ovocitos de Drosophila presenta desafíos particulares, debido principalmente a la presencia de membranas que rodean el ovocito que son impenetrables para los anticuerpos. Describimos aquí los protocolos para la recolección, preparación e imagen del ensamblaje del huso de la meiosis I y el comportamiento cromosómico en ovocitos de Drosophila, que permiten la disección molecular de la segregación cromosómica en este importante organismo modelo.

Los métodos que hemos descrito aquí, dará lugar a la colección de la última etapa de ovocitos Drosophila representan tres etapas de la meiosis (Figura 1). Los ovocitos en profase se distinguen por la presencia de la envoltura nuclear, que es visible por la falta de señal de la tubulina en la región que rodea el cariosoma (Figura 1A). Prometafase es el período posterior rotura de la envuelta nuclear durante el cual los ensambles de cabezal. Duran...

Presentamos protocolos para la recolección, preparación e imagen de ovocitos maduros de Drosophila. Estos métodos permiten la visualización del comportamiento de los cromosomas y el ensamblaje y la función del huso durante la meiosis.

Técnicas de Imagen y Prometafase metafase de la meiosis I en fijo<em&gt; Drosophila</emLos ovocitos&gt;

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar ovocitos de Drosophila para el examen citológico del ensamblaje del huso y la orientación de los cromosomas durante la meiosis I. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la meiosis, como cómo se establece la bipolaridad del huso y cómo los cromosomas adquieren una orientación bivalente en ausencia de centrómeros. La principal ventaja de esta técnica es que se eliminan eficazmente las membranas del ovocito que bloquean la penetración de los anticuerpos, lo que permite la inmunofluorescencia. Para comenzar, recubra el interior de un tubo de cinco milímetros y de una pipeta de pastoreo con PTB para evitar que los ovocitos se adhieran a las superficies.Añada 100 mililitros de tampón ROB a una licuadora y luego agregue de 100 a 300 moscas anestesiadas y pulse tres veces durante un segundo. Filtre la suspensión resultante en un vaso de precipitados de 250 mililitros a través de una malla grande con poros de aproximadamente 1.500 micrómetros. Deje reposar el filtrado durante unos dos minutos y luego aspire la capa superior, eliminando tantas partes grandes del cuerpo como sea posible.Filtre nuevamente la suspensión en un vaso de precipitados de 250 mililitros, utilizando una malla más fina con un tamaño de poro de 300 micrómetros. Enjuague el primer vaso de precipitados usando tampón adicional en la pipeta recubierta para recolectar los ovocitos restantes. Deje que la suspensión sedimente durante tres minutos y luego aspire todo excepto los últimos 10 mililitros del fondo.Vierta la mayor cantidad posible de los 10 mililitros en el tubo recubierto de cinco mililitros. Deje reposar la suspensión durante aproximadamente dos minutos y luego retire cuidadosamente el líquido. Añada el resto de los 10 mililitros de suspensión y deje reposar la mezcla nuevamente antes de eliminar el líquido.Lave los ovocitos restantes fuera del vaso de precipitados utilizando tampón adicional en la pipeta recubierta. Deje que el lavado repose en el tubo de cinco mililitros durante tres a cinco minutos. Para fijar los ovarios, aspire primero todo el líquido de los tejidos y agregue inmediatamente un mililitro de la Mezcla de Fijación.Coloque los tejidos sobre un nutador durante 2 minutos y medio. A continuación, agregue un mililitro de heptano, vortexee el tubo durante un minuto y luego deje sedimentar los ovocitos durante un minuto adicional. Retire todo el líquido del tejido sedimentado y agregue un mililitro de PBS 1x.Agite el tubo en vórtex durante 30 segundos y luego deje que los ovocitos sedimenten durante un minuto. A continuación, retire todo el líquido del tubo y llénelo con cinco mililitros de PBS 1x. Utilizando la pipeta recubierta, agregue aproximadamente de 500 a 1.000 ovocitos a un portaobjetos de vidrio esmerilado.Elimine cualquier parte del cuerpo o material extraño utilizando pinzas. Coloque una lámina de cubierta encima del tejido y enrolle suavemente los ovocitos hasta que se eliminen todas las membranas. Arrastrar el borde de la lámina de cubierta sobre los ovocitos funciona bien.Revise periódicamente el progreso de la eliminación de la membrana bajo un microscopio. Una presión excesiva destruirá los ovocitos. La eliminación más efectiva de la membrana del ovocito se logra combinando la máxima cantidad de movimiento del ovocito con la mínima cantidad de presión.Utilice una presión ligera y movimientos rápidos para arrastrar el borde de la cubreobjetos sobre los ovocitos. Para iniciar la extracción y la bloqueo, agregue 15 mililitros de PBS 1% Triton X-100 a un tubo de 50 mililitros. Enjuague los ovocitos enrollados dentro de este tubo y agite suavemente durante una hora y media a dos horas.Después de permitir que los ovocitos sedimenten durante dos minutos, retire el líquido junto con tantas membranas como sea posible y agregue 50 mililitros de PBS con 0,05 % de Triton X-100. Deje que los ovocitos sedimenten otros dos minutos y luego retire todo el líquido excepto aproximadamente un mililitro. Transfiera los ovocitos a un tubo graduado de 1,5 mililitros y retire el líquido restante.Añada un mililitro de PTB para bloqueo y agite en nutator durante una hora. Retire el líquido de los ovocitos y luego añada 300 microlitros de PTB. A continuación, añada el anticuerpo primario de interés en la dilución adecuada, teniendo cuidado de proteger las muestras tratadas con anticuerpos fluorescentes de la luz.Incubar durante la noche a cuatro grados Celsius. Lavar los ovocitos con un mililitro de PTB cuatro veces durante 15 minutos cada vez. Eliminar el líquido y añadir 200 microlitros de sobrenadante de los embriones tratados con anticuerpo secundario.Filtre hasta la marca de 300 microlitros con PTB y luego nutate durante tres a cuatro horas a temperatura ambiente. Lave los ovocitos una vez durante 15 minutos con un mililitro de PTB. A continuación, retire el líquido y agregue 0,5 microlitros de Hoechst 33342 y 500 microlitros de PTB.Ajuste para que oscile durante siete minutos. Use un mililitro de PTB para lavar los ovocitos dos veces durante 15 minutos cada vez. Las muestras ya pueden montarse e imagenarse inmediatamente utilizando técnicas estándar de microscopía confocal, o almacenarse en PTB a cuatro grados Celsius hasta que sean necesarias.Se muestran aquí imágenes de ovocitos en estadio tardío generadas mediante la técnica demostrada, capturando tres estadios diferentes de la meiosis. Los ovocitos en profase se distinguen por la presencia del envoltorio nuclear, que es visible debido a la ausencia de señal de tubulina en las regiones que rodean el cariosoma. También se observó la elongación distintiva del cariosoma en la prometafase, y los cromosomas IV se observan separados del conjunto del cariosoma.Se capturó también la metafase y se observa que el cariosoma se retrae hacia una forma redondeada. Aquí, la inmunomarcación con diferentes anticuerpos resalta el huso, los centrómeros y el huso central en ovocitos fijados con formaldehído y heptano. Los ovocitos tratados con el fármaco colchicina mostraron fenotipos no estándar con la eliminación de la mayoría de los microtúbulos no cinéticos, lo que resultó en que todos los microtúbulos hicieran contacto con el ADN en el centrómero marcado como Phocyde.El tratamiento con paclitaxel resultó en ovocitos con microtúbulos excesivos en el citoplasma. Finalmente, los ovocitos tratados con binucleína 2 para inhibir la quinasa Aurora B mostraron pérdida completa de los microtúbulos del huso. Al intentar este procedimiento, es importante recordar no apresurarse durante la eliminación de la membrana del ovocito, ya que el éxito del protocolo depende de este paso.Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, porque la eliminación de las membranas requiere paciencia y práctica. Por lo tanto, esta técnica se aprende mejor observando a alguien que la realice con éxito. Una vez dominada, la manipulación de los ovocitos puede realizarse en cinco a diez minutos.Pero es posible tardar hasta 30 minutos sin afectar la calidad de los resultados. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar oocitos de Drosophila en etapa tardía para la visualización del ensamblaje del huso acromático, la organización del huso, los movimientos cromosómicos y la bi-orientación cromosómica. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

techniques-for-imaging-prometaphase-metaphase-meiosis-i-fixed

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo describe el uso de la microinyección y la imagen de alta resolución en...

Técnicas de microinyección para el estudio de la mitosis en el Drosophila melanogaster Embrión sincitial

Los ovocitos son propensos a la aneuploidía debido a errores en la segregación cromosómica durante la maduración meiótica. Huevos aneuploides puede causar infertilidad, abortos involuntarios o trastornos del desarrollo como el síndrome de Down. Aquí se describen los métodos para introducir los materiales de elección en los ovocitos y los métodos para estudiar la maduración meiótica y evaluar la ploidía.

La microinyección de ovocitos de ratón, Maduración y Evaluación de ploidía

El cinetocoro es donde el SAC inicia su señal de control de la segregación mitótica de las cromátidas hermanas. Se describe un método para visualizar la contratación y la rotación de una de las kinetochore proteínas y su coordinación con el movimiento de los cromosomas...

El estudio de puesto de control mitótico, ilustrando comportamiento dinámico de proteínas cinetocoro y el movimiento de cromosomas en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones Sincitial

La inmunotinción de ovocitos en etapa tardía de Drosophila puede resultar desafiante debido a las membranas circundantes de los ovocitos. Este vídeo describe un método de alto rendimiento para la obtención de ovocitos, su fijación y la extracción de membranas para la inmunotinción. El protocolo presentado demuestra estas técnicas con ovocitos en etapa tardía utilizados para visualizar diferentes etapas de la meiosis.

Preparación de ovocitos fijos de Drosophila para inmunotinción: un método de alto rendimiento para fijar y eliminar la membrana externa

Obtención de imágenes de las proteínas de Drosophila centrosomales durante la espermatogénesis es un método poderoso para identificar nuevas proteínas críticas para la biología del centrosoma, así como para dilucidar la función particular de los jugadores conocidos en este proceso.

Los centrosomas de imagen en Fly Testículos

Los métodos para aislar y preparar muestras de Drosophila testículos (en directo y fijo) para obtener imágenes de contraste de fase y microscopía de fluorescencia se describen en este documento.

Análisis citológico de espermatogénesis: Los preparativos en directo y fijas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Testículos

Este manuscrito presenta un detallado método para la generación X-cromosoma brazo sondas y rendimiento en situ hibridación de la fluorescencia (pescado) para examinar el estado de la hermana cohesión de cromátidas hermanas en Prometafase y metafase detenido  Drosophila ovocitos. Este protocolo es adecuado para determinar si cohesión brazo meiótica es intacta o interrumpida en diferentes genotipos.

Con fluorescencia In Situ hibridación (pescado) para supervisar el estado de la cohesión de brazo en Prometafase y metafase I ovocitos de Drosophila

Como las variantes genéticas asociadas con enfermedades humanas empiezan a ser descubierto, se está convirtiendo en cada vez más importante para el desarrollo de sistemas con los que evaluar rápidamente la importancia biológica de las variantes identificadas. Este protocolo describe los métodos para evaluar la función del gen humano durante la meiosis femenina utilizando ovocitos de ratón.

Uso de ovocitos de ratón para evaluar la función humana del Gene durante la Meiosis I

Los errores meióticos en las sinapsis y la recombinación son comunes en los ovocitos de mamíferos. El análisis riguroso de las proteínas involucradas en estos procesos es esencial para comprender cómo y por qué la ovogénesis a menudo sale mal. Las técnicas aquí presentadas permiten un seguimiento exhaustivo de la recombinación y las sinapsis para evaluar la calidad de los ovocitos en ratones.

Preparación de distribuciones de cromosomas meióticos de ovocitos de ratón para la evaluación de la sinapsis y la recombinación

Mesoscópica fluorescencia tomografía opera más allá de los límites de penetración de los tejidos de seccionamiento microscopía de fluorescencia. La técnica se basa en la iluminación multi-proyección y una descripción del transporte de fotones. Se demuestra en vivo de todo el cuerpo visualización en 3D de la morfogénesis de las buenas prácticas agrarias-que expresa ala discos imaginales...

Mesoscópica fluorescencia Tomografía por En vivo Imágenes de desarrollo Drosophila</em

Aprende a preparar oocitos de Drosophila para examinar el ensamblaje del huso y la orientación cromosómica durante la meiosis I mediante inmunofluorescencia. Este protocolo permite visualizar la dinámica cromosómica in vivo.

Técnicas de Imagen y Prometafase metafase de la meiosis I en fijo

Explorar más videos