Name: Técnicas de Imagen y Prometafase metafase de la meiosis I en fijo Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprende a preparar oocitos de Drosophila para examinar el ensamblaje del huso y la orientación cromosómica durante la meiosis I mediante inmunofluorescencia. Este protocolo permite visualizar la dinámica cromosómica in vivo.

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Agradecemos a Christian Lehner por proporcionar el anticuerpo CENP-C y a Eric Joyce por sus recomendaciones sobre FISH. El trabajo en el laboratorio de McKim fue financiado por una subvención de los NIH (GM101955).

Nota: Los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. incubadoras de temperatura controlada se utilizan para mantener las temperaturas para la cría de mosca y cruces a menos que se indique lo contrario. 1. Preparativos <ol><li> Preparar moscas. <ol><li> Prometafase enriquecido con colecciones de ovocitos. <ol><li> Claro moscas adultas jóvenes a partir de valores o transversales cultivos sanos,. botellas de edad para los dos días a 25 ° C. NOTA: Por lo general dos botellas sanas serán suficientes, aunque más pueden ser necesarios para algunas culturas cruzadas. </li><li> Después de dos días, recoger ~ 100 a 300 mujeres (que son de 0 a 2 días de edad en este punto) de las botellas. Las hembras no tienen que ser vírgenes. Añadir una pequeña cantidad de pasta de levadura a un lado de un vial y colocar 30 hembras y 10 machos y 15 cada uno en los viales yeasted. viales de edad para los dos días a 25 ° C. </li></ol></li><li> Metafase-enriquecido ovocitos Colecciones. <ol><li> Recoger ~ 100 a 300 hembras de valores o cruz culturES. Añadir una pequeña cantidad de pasta de levadura a un lado de un vial y colocar cada 30 hembras (sin machos añadidos) en los viales yeasted. viales de edad para los tres a cinco días a 25 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Preparar soluciones. Nota: Las soluciones se pueden almacenar indefinidamente a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario. <ol><li> Prepárese Modificado Buffer de Robb (5x): mM HEPES 500, sacarosa 500 mM, acetato de sodio 275 mM, acetato de potasio 200 mM, glucosa 50 mM, cloruro de magnesio 6 mM, y cloruro de calcio 5 mM. Utilice 10 N 11: 8 de hidróxido de sodio: hidróxido de potasio para llevar el pH a 7,4. Esterilizar por filtración; No esterilizar en autoclave. Almacenar a -20 ° C. Descongelar según sea necesario para preparar ~ 200 ml de 1x de Robb por oocito de preparación. </li><li> Soluciones de fijación. <ol><li> Opción # 1: Preparar la fijación de formaldehído / heptano. Preparar Fijación Buffer: solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) más sacarosa 150 mM. Para utilizar, hacer fresco con 687,5 l Fijación de amortiguamiento y 312,5 l 16% de formaldehídopor la preparación de los ovocitos. PRECAUCIÓN: Use guantes durante el uso de soluciones de formaldehído en una campana de humos. Eliminar los residuos de acuerdo con las directrices institucionales. </li><li> Opción # 2: Preparar la fijación de formaldehído / cacodilato. Preparar la mezcla Fix: sacarosa 250 mM, 100 mM de acetato de potasio (pH 7,5), acetato de sodio 25 mM (pH 7,0), y EGTA 25 mM (pH 8,0). Para utilizar, hacen fresco con 400 l Fix Mix, 100 l de cacodilato de potasio (1 M, pH 7,2), y 500 l 16% de formaldehído por la preparación de los ovocitos. PRECAUCIÓN: cacodilato de potasio contiene arsénico. </li></ol></li><li> Preparar PBS / Triton X-100: 1x PBS más 1% o 0,05% de Triton X-100. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Preparar PBS-Tween 20-albúmina de suero bovino (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w / v), y 0,1% de Tween-20. Puede ser almacenado a 4 ° C durante una semana. </li><li> La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) Soluciones. <ol><li> Preparar cloruro de sodio-20X citrato de sodio (SSC): cloruro de sodio 3 M y citrato de sodio 0,3 M. </li><li> Preparar 2x SSC-Tween-20 (SSCT): 2x SSC más 0,1% de Tween-20. Hacer frescas, ~ 20 ml por la preparación de los ovocitos. </li><li> Preparar soluciones de formamida: 2x SSC, 0,1% de Tween-20, además de formamida. Hacer fresca, 1 ml 20% de formamida, 0,5 ml 40% de formamida, y 2 ml 50% de formamida por prep ovocito. PRECAUCIÓN: Use guantes durante el uso de soluciones de formamida en una campana de humos. Eliminar los residuos de acuerdo con las directrices institucionales. </li><li> Preparar la solución de hibridación: 2 x SSC, formamida al 50%, y 10% de sulfato de dextrano (w / v). Almacenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Las sondas FISH. <ol><li> Oligonucleótidos orden (véase la Tabla 1 para las secuencias) con la purificación por HPLC y la deseada 5 &#39;modificación fluorescente (por ejemplo, Cy3 o Cy5). Resuspender en tampón Tris-EDTA (TE) a 50 ng / l. NOTA: Proteja oligos de exposición a la luz en todo momento. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Recolección de etapa tardía de Drosophila ovocitos <ol><li> Como <em&gt; ovocitos Drosophila con membranas intactas se pegue a plástico y vidrio, pre-recubrir el interior de un tubo de 5 ml y una pipeta Pasteur por prep ovocito con PTB. </li><li> Anestesiar a todos ~ 100 a 300 moscas yeasted con dióxido de carbono y añadir a un mezclador que contenía ~ 100 ml 1x Buffer de Robb. Pulso tres veces (~ 1 seg cada uno). Mantener en ovocitos de Robb para &lt;20 min para evitar la activación. NOTA: Como alternativa, los ovocitos pueden ser a mano disecados de las hembras. La ventaja de este método es que requiere menos hembras. Sin embargo, se debe tener cuidado para limitar la exposición a dióxido de carbono a unos pocos minutos para evitar artefactos asociados con la hipoxia 7. </li><li> Se filtra a través de malla grande (~ 1.500 m) en 250 ml vaso de precipitados para eliminar grandes partes del cuerpo. Si muchos abdómenes intactos permanecen en material de malla, re-molienda usando tampón adicional de Robb, y el filtro de nuevo. Dejar reposar ~ 2 min, luego aspirar fuera de la capa superior, la eliminación de la mayor cantidad de grandes partes del cuerpo como sea posible. </li><li> Fifiltro a través de malla pequeña (~ 300 micras) en un vaso de precipitados de 250 ml. Enjuague ovocitos restantes de cada primer vaso de precipitados utilizando adicional de Robb y recubiertos pipeta Pasteur. Dejar reposar ~ 3 min; ovocitos se asentarán. Aspirar todos, pero ~ 10 ml. </li><li> Verter la mayor cantidad de 10 ml como se ajusta a revestida tubo de 5 ml. Dejar reposar, remover el líquido, y repetir con residuo. Enjuague oocitos restantes de vaso de precipitados utilizando adicional pipeta Pasteur de Robb y revestido. Deje asentarse en 5 ml tubo por unos 3-5 minutos. </li></ol> 3. Tratamientos farmacológicos (Opcional) <ol><li> Escudo un segundo tubo de 5 ml con PTB para cada preparación de los ovocitos. Añadir disolvente apropiado (control) o el medicamento a 1 ml de Robb cada uno para cada preparación de ovocitos (Tabla 2). </li><li> ovocitos divididos en un segundo tubo recubierto de 5 ml. Dejar reposar, eliminar el líquido, y añadir 1 ml de Robb más disolvente en un tubo y 1 ml de Robb más fármaco en segundo tubo. Inclinar la cabeza para la cantidad de tiempo apropiado para el tratamiento de drogas (Tabla 2). Let asiente. </li></ol> 4. Fijación <ol><li> Aspirar todo el líquido e inmediatamente añadir 1 ml Fix. </li><li> Opción # 1: El formaldehído / heptano fijación (fijación de búfer más el 5% de formaldehído). <ol><li> Fijar durante 2,5 minutos en un nutator. Añadir 1 ml de heptano y agitar 1 min. Dejar reposar ~ 1 min. </li><li> Eliminar todo el líquido, y luego agregar 1 ml de PBS 1x. Vortex 30 seg. Dejar reposar ~ 1 min. </li><li> Eliminar todo el líquido, y luego llenar el tubo con PBS 1x. NOTA: Los ovocitos se pueden utilizar inmediatamente o mantenerse en el nutator durante varias horas a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Opción # 2: la fijación de formaldehído / cacodilato (Fix Mix Plus 8% de formaldehído y cacodilato 100 mM). <ol><li> Fijar durante 6 minutos en un nutator. Dejar reposar 2 min. Retire el líquido, y luego llenar el tubo con PBS 1x. NOTA: Los ovocitos se pueden utilizar inmediatamente o mantenerse en el nutator durante varias horas a temperatura ambiente. </li></ol></li></ol> 5. Extracción de Membranas ( &quot;Rolling&quot;) <ol><li> Usando recubierto pipeta Pasteur, añadir ~ 500 a 1000 ovocitos a la parte esmerilado (chorro de arena) de un portaobjetos de vidrio. Retirar todas las partes del cuerpo y materiales extraños con unas pinzas. No deje que se sequen los ovocitos; añadir 1x PBS como sea necesario. </li><li> Colocar un cubreobjetos en la parte superior de los ovocitos y suavemente ovocitos &quot;rollo&quot; hasta que todas las membranas se retiran (arrastrando el borde del cubreobjetos a través de los ovocitos que funciona mejor.) Controlar periódicamente el progreso bajo el microscopio, la adición de más 1x PBS como sea necesario. Tenga cuidado puesto que demasiada presión va a destruir los ovocitos. NOTA: Por inmunofluorescencia solamente, continúe con el paso 6. Para los peces (con o sin inmunofluorescencia), continúe con el paso 7. </li></ol> 6. Anticuerpo La tinción de Drosophila ovocitos <ol><li> Extracción y bloqueo <ol><li> Enjuague ovocitos enrollado en un tubo cónico de 15 ml que contiene 15 ~ ml de PBS / 1% de Triton X-100. ovocitos inclinar la cabeza en esta solución durante no menos de 1,5 horas y no más de 2 horas.Este paso permite la penetración de anticuerpos. </li><li> Deje que los ovocitos se asientan ~ 2 min. Retire el líquido junto con el mayor número de membranas como sea posible, a continuación, añadir PBS / 0,05% de Triton X-100. NOTA: Las membranas se asentarán más lento que los ovocitos laminados. </li><li> Deje que los ovocitos se asientan ~ 2 minutos, luego retire todos menos ~ 1 ml de líquido. ovocitos de transferencia a graduaron tubo de 1,5 ml y eliminar el líquido residual. Añadir 1 ml PTB para el bloqueo y inclinar la cabeza durante 1 hora. </li></ol></li><li> La tinción de anticuerpos <ol><li> Pre-absorción de anticuerpos secundarios contra embriones. NOTA: Este paso elimina la tinción de fondo de las interacciones de anticuerpos no específicos con proteínas de Drosophila. <ol><li> Recoger y fijar embriones de Drosophila (~ 25 l) por procedimiento típico 8. Almacenar en metanol a -20 ° C. </li><li> Eliminar el metanol a partir de embriones, añadir 800 l de metanol más 200 l de 1x PBS, y inclinar la cabeza durante 15 minutos. Retire 500 l de sobrenadante y reemplazar con 500 l de PBS 1x. Luego inclinar la cabeza durante 15 minutos. Repetir dos veces (para un total de ~ 1 hr de lavados), y luego terminar en el PTB. NOTA: Los embriones se puede usar inmediatamente o mantenerse en el nutator para varias horas a temperatura ambiente. </li><li> Retire el líquido, se llenan de PTB a 200 l por la preparación de los ovocitos, y añadir anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia a las diluciones apropiadas (teniendo en cuenta que el volumen final será de 300 l;. Véase el paso 7.4) titubear a 4 ° C durante la noche (preferible) o a temperatura ambiente durante 3-4 h. NOTA: Los anticuerpos pre-absorción se utilizó en el paso 6.2.4. NOTA: Mantener las muestras en la oscuridad tanto como sea posible una vez que los anticuerpos fluorescentes se han añadido. </li></ol></li><li> Retire el líquido a partir de ovocitos, se llenan de PTB a 300 l, y añadir anticuerpos primarios en diluciones adecuadas. Inclinar la cabeza a 4 ° C durante la noche (preferible) o a temperatura ambiente durante 3-4 h. </li><li> Lavar los ovocitos cuatro veces durante 15 minutos cada uno con 1 ml PTB. </li><li> retirarlíquido de ovocitos, añadir 200 l de sobrenadante a partir de embriones (pre-absorción anticuerpos secundarios). Luego llene con PTB para 300 l. Inclinar la cabeza a temperatura ambiente durante 3-4 h (preferible) o a 4 ° C durante la noche. </li><li> Lavar los ovocitos de una vez por 15 min con 1 ml PTB, eliminar el líquido. A continuación, añadir 0,5 l Hoechst 33342 y 500 l PTB y inclinar la cabeza durante 7 minutos. </li><li> Lavar los ovocitos dos veces durante 15 minutos cada uno con 1 ml PTB. NOTA: Los ovocitos se pueden montar en un portaobjetos inmediatamente o se pueden almacenar en PTB a 4 ° C hasta el momento de formación de imágenes. </li></ol></li></ol> 7. FISH (Continúe desde el paso 5 anterior) <ol><li> Enjuague ovocitos enrollados en un tubo cónico de 15 ml que contiene 15 ml ~ 2x ECSS. Deje que los ovocitos se asientan ~ 2 min. Deje únicamente ~ 0,5 ml de líquido junto con el mayor número posible de las membranas. NOTA: Las membranas se asentarán más lento que los ovocitos laminados. </li><li> Transferencia de ovocitos a 0,5 ml tubo y remover el líquido remanente. Sucesivamente añadir y eliminar 500 l20%, 40%, y 50% de formamida soluciones, nutación para 10 min en cada solución. NOTA: Los ovocitos se asentarán más lento con porcentajes más altos de formamida. </li><li> Retire el líquido, a continuación, añadir la solución de formamida 500 l 50%, y de inclinar la cabeza a 37 ° C durante 1 a 5 horas. NOTA: El aumento de las incubaciones dan como resultado una mejor penetración de la sonda. </li><li> Retire el líquido, dejando tras de no más de ~ 100 ovocitos mu l, y añadir 36 l solución de hibridación más 2 l de sonda (50 ng / l) y 2 l de agua o 2 l de una sonda de 2 nd (Tabla 1). </li><li> Incubar a 91 ° C durante 3 min (FISH solamente) o 80 ° C durante 20 min (FISH además de inmunofluorescencia), seguido de incubación en un baño de agua a 37 ° durante la noche. NOTA: Estos pasos pueden llevarse a cabo en un termociclador. </li><li> No eliminar el líquido. Añadir 500 l 50% de solución de formamida y inclinar la cabeza a 37 ° C durante 1 hr. </li><li> Dejar reposar, eliminar el líquido, añadir solución de formamida 500 l 50%, unad inclinar la cabeza a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Dejar reposar, eliminar el líquido, añadir solución de formamida 500 l 20%, y de inclinar la cabeza a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Realizar tres lavados rápidos en 500 l 2x ECSS (dejar reposar, desenchufar y añadir líquido, invertir varias veces, repetir.) Dejar reposar, eliminar el líquido, a continuación, añadir 500 l PTB y inclinar la cabeza durante 4 horas. </li></ol> 8. tinción de anticuerpos después de FISH <ol><li> Retire el líquido a partir de ovocitos, se llenan de PTB a 300 l, y añadir 10 l de anticuerpo anti-α-tubulina conjugado con FITC. Alternativamente, otros anticuerpos se pueden utilizar, siguiendo el protocolo anteriormente. Inclinar la cabeza a temperatura ambiente durante la noche. </li><li> Lavar los ovocitos una vez durante 15 minutos con 500 l PTB, eliminar el líquido, a continuación, añadir 0,5 l Hoechst 33342 y 500 l PTB y inclinar la cabeza durante 7 minutos. </li><li> Lavar los ovocitos dos veces durante 15 minutos cada uno con 500 l PTB. NOTA: Los ovocitos se pueden montar en un portaobjetos inmediatamente o se pueden almacenar en PTB a 4 ° C hasta el momento deformación de imágenes. Mantenga ovocitos en la oscuridad tanto como sea posible una vez que los anticuerpos fluorescentes se han añadido. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Repetir Nombre </td><td fo:width="1in"> Cromosoma </td><td> Oligo Secuencia * </td></tr><tr><td> 359 </td><td> x </td><td> GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC </td></tr><tr><td> AACAC </td><td> 2 </td><td> AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC </td></tr><tr><td> dodecaedro </td><td> 3 </td><td> CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT </td></tr><tr><td> 1,686 </td><td> 2 + 3 </td><td> AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG </td></tr><tr><td> AATAT </td><td> 4 (+ Y) </td><td> AATATAATATAATATAATATAATATAATAT </td></tr><tr><td colspan="3"> * 359 secuencia de Eric Joyce, comunicación personal, otras secuencias de Sullivan et al. 8 </td&gt; </tr></tbody></table> Tabla 1: sondas FISH para repeticiones centroméricas Drosophila. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Droga </td><td> Solvente </td><td> de la concentración </td><td> La concentración final </td><td> Tiempo de tratamiento </td><td> Efecto </td></tr><tr><td> colchicina </td><td> etanol </td><td> 125 mM </td><td> 150 M </td><td> 10 min o 30 min </td><td> desestabilizar no cinetocoro (10 min) 9 o todos los microtúbulos (30 min) </td></tr><tr><td> paclitaxel </td><td> DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 10 micras </td><td> 10 minutos </td><td> estabilizar micrófonorotubules </td></tr><tr><td> Binucleine 2 </td><td> DMSO </td><td> 25 mM </td><td> 25 M </td><td> 20 minutos </td><td> inhibir la quinasa Aurora B 10 </td></tr></tbody></table> Tabla 2: El tratamiento con medicamentos.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Puesta en escena de Drosophila ovocitos Aunque un cariosoma alargado se ve a menudo en los ovocitos prometaphase, utilizando cariosoma forma de distinguir a partir de ovocitos en metafase prometaphase puede ser problemático. Durante prometaphase, el cariosoma comienza como una forma redonda, se alarga, y se retira a una forma redonda como el ovocito se aproxima a la detención en metafase. Esto significa que muchos ovocitos prometaphase no tienen un cariosoma alargad...

El estudio de la meiosis a veces se describe como la "genética de la genética". Esto se debe a que las propiedades fundamentales de la herencia cromosómica y la selección independiente se llevan a cabo a través de la segregación de cromosomas durante la producción de gametos. Una demostración importante de la teoría cromosómica de la herencia llegó en 1916 a partir del trabajo de Calvin Bridges en Drosophila melanogaster1. Este y otros estudios de genética clásica en Drosophila contribuyeron en gran medida a nuestra comprensión de la genética. Sin embargo, el examen citológico de los cromosomas meióticos en ovocitos de Drosophila ha sido un desafío. Esto se debe principalmente a que la inmunofluorescencia de los ovocitos de Drosophila en etapa tardía, cuando el huso se ensambla y los cromosomas se orientan para la segregación, se ve obstaculizada por la presencia de membranas que hacen que el ovocito sea impenetrable para los anticuerpos.
A pesar de este desafío, los ovocitos de Drosophila siguen siendo un modelo atractivo para el estudio del comportamiento cromosómico y el ensamblaje del huso. Esto se debe a las poderosas herramientas genéticas disponibles en Drosophila, pero también porque los ovocitos se detienen en la metafase I, cuando los cromosomas están orientados y el huso está completamente formado. Esto facilita la recolección y el examen de un gran número de ovocitos en esta importante etapa de la división celular. Además, un organismo modelo simple que sea susceptible de manipulación genética para el estudio de la segregación de los cromosomas de los ovocitos puede proporcionar una contribución importante a nuestra comprensión de la salud reproductiva humana. Los errores en el número de cromosomas son la principal causa genética de aborto espontáneo y defectos congénitosen los seres humanos. La mayoría de estos errores se pueden rastrear hasta el ovocito y se correlacionan con el aumento de la edad materna. La edad promedio de las madres en los EE. UU. ha ido en aumento, lo que la convierte en un importante problema de salud pública.
Describimos aquí métodos para el examen citológico de ovocitos de Drosophila, incluyendo una demostración de cómo eliminar las membranas de los ovocitos. Estos métodos son modificaciones de los protocolos descritos por primera vez por Theurkauf y Hawley3, Zou et al.4, y Dernburg et al.5. También incluimos métodos para el enriquecimiento de diferentes estadios de los ovocitos, basados en un protocolo descrito por primera vez por Gilliland et al.6. Por último, añadimos instrucciones para el tratamiento farmacológico de los ovocitos de Drosophila. Juntos, estos métodos permiten la investigación citológica de la segregación cromosómica de los ovocitos y el ensamblaje del huso en Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Tubos cónicos de 15 ml</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% de formaldehído</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>18505</td><td>PELIGROSO; una vez abierto, deséchelo después de un mes</td></tr><tr><td>Vasos de precipitados de 250 ml</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubos de 5 ml</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>levadura seca activa</td><td>Varios</td><td></td><td>mezclar con agua para hacer una pasta la consistencia de la mantequilla de maní</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-&alfa;-tubulina conjugado con FITC</td><td>Sigma</td><td>F2168</td><td>clon DM1A</td></tr><tr><td>Binucleina 2</td><td>Sigma</td><td>B1186</td><td>HAZARDOUS</td></tr><tr><td>mezclador</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>albúmina de suero bovino</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de calcio</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>colchicina</td><td>Sigma</td><td>C-9754</td><td>HAZARDOUS</td></tr><tr><td>cubreobjetos</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>N° 1 1/2</td></tr><tr><td>sulfato de dextrano</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pinzas</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>5622</td><td>Pinzas Dumont de alta precisión estilo 5</td></tr><tr><td>formamida</td><td>Sigma</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de vidrio</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>glucosa</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubos graduados de 1,5 ml</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>EM-5330</td><td>disponibles en varios proveedores</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cloruro de magnesio</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mallas grandes (~ 1,500 y micro; m)</td> <td>VWR</td><td>AA43657-NK</td><td>variedad de formatos y otros proveedores, malla pequeña de 12 o 14 mallas</td></tr><tr><td>(~300 y micro; m)</td><td>Laboratorios de espectro</td><td>146 424</td><td>variedad de formatos, p. ej., 146 422 o 146 486</td></tr><tr><td>nutator</td><td>Varias</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipetas Pasteur</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>acetato de potasio</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido cacodílico</td><td>Sigma</td><td>C0125</td><td>PELIGROSO; Alternativamente, se puede sustituir el cacodilato de sodio</td></tr> por <tr><td>potasio hidróxido</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>acetato de sodio</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cloruro de sodio</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sacarosa</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>taxol (paclitaxel)</td><td>Sigma</td><td>T1912</td><td>PELIGROSO</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>PI-28314</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>PI-28320</td><td></td></tr><tr><td>vórtice</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

técnicas de imagen y prometafase metafase de la meiosis i en fijo<em&gt; drosophila</emlos ovocitos&gt;

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

La segregación cromosómica en los ovocitos humanos es propensa a errores, lo que resulta en aneuploidía, que es la principal causa genética de abortos espontáneos y defectos congénitos. El estudio del comportamiento cromosómico en ovocitos a partir de organismos modelo es muy prometedor para descubrir las bases moleculares de la susceptibilidad de los ovocitos humanos a la aneuploidía. Drosophila melanogaster es susceptible a la manipulación genética, con más de 100 años de investigación, comunidad y desarrollo de técnicas. Sin embargo, la visualización del comportamiento cromosómico y el ensamblaje del huso en los ovocitos de Drosophila presenta desafíos particulares, debido principalmente a la presencia de membranas que rodean el ovocito que son impenetrables para los anticuerpos. Describimos aquí los protocolos para la recolección, preparación e imagen del ensamblaje del huso de la meiosis I y el comportamiento cromosómico en ovocitos de Drosophila, que permiten la disección molecular de la segregación cromosómica en este importante organismo modelo.

Los métodos que hemos descrito aquí, dará lugar a la colección de la última etapa de ovocitos Drosophila representan tres etapas de la meiosis (Figura 1). Los ovocitos en profase se distinguen por la presencia de la envoltura nuclear, que es visible por la falta de señal de la tubulina en la región que rodea el cariosoma (Figura 1A). Prometafase es el período posterior rotura de la envuelta nuclear durante el cual los ensambles de cabezal. Duran...

Presentamos protocolos para la recolección, preparación e imagen de ovocitos maduros de Drosophila. Estos métodos permiten la visualización del comportamiento de los cromosomas y el ensamblaje y la función del huso durante la meiosis.

Técnicas de Imagen y Prometafase metafase de la meiosis I en fijo<em&gt; Drosophila</emLos ovocitos&gt;

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar ovocitos de Drosophila para el examen citológico del ensamblaje del huso y la orientación de los cromosomas durante la meiosis I. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la meiosis, como cómo se establece la bipolaridad del huso y cómo los cromosomas adquieren una orientación bivalente en ausencia de centrómeros. La principal ventaja de esta técnica es que se eliminan eficazmente las membranas del ovocito que bloquean la penetración de los anticuerpos, lo que permite la inmunofluorescencia. Para comenzar, recubra el interior de un tubo de cinco milímetros y de una pipeta de pastoreo con PTB para evitar que los ovocitos se adhieran a las superficies.Añada 100 mililitros de tampón ROB a una licuadora y luego agregue de 100 a 300 moscas anestesiadas y pulse tres veces durante un segundo. Filtre la suspensión resultante en un vaso de precipitados de 250 mililitros a través de una malla grande con poros de aproximadamente 1.500 micrómetros. Deje reposar el filtrado durante unos dos minutos y luego aspire la capa superior, eliminando tantas partes grandes del cuerpo como sea posible.Filtre nuevamente la sus

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Investigación

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Biología

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Técnicas de microinyección para el estudio de la mitosis en el Drosophila melanogaster Embrión sincitial

Los ovocitos son propensos a la aneuploidía debido a errores en la segregación cromosómica durante la maduración meiótica. Huevos aneuploides puede causar infertilidad, abortos involuntarios o trastornos del desarrollo como el síndrome de Down. Aquí se describen los métodos para introducir los materiales de elección en los ovocitos y los métodos para estudiar la maduración meiótica y evaluar la ploidía.

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El cinetocoro es donde el SAC inicia su señal de control de la segregación mitótica de las cromátidas hermanas. Se describe un método para visualizar la contratación y la rotación de una de las kinetochore proteínas y su coordinación con el movimiento de los cromosomas...

El estudio de puesto de control mitótico, ilustrando comportamiento dinámico de proteínas cinetocoro y el movimiento de cromosomas en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones Sincitial

La inmunotinción de ovocitos en etapa tardía de Drosophila puede resultar desafiante debido a las membranas circundantes de los ovocitos. Este vídeo describe un método de alto rendimiento para la obtención de ovocitos, su fijación y la extracción de membranas para la inmunotinción. El protocolo presentado demuestra estas técnicas con ovocitos en etapa tardía utilizados para visualizar diferentes etapas de la meiosis.

Preparación de ovocitos fijos de Drosophila para inmunotinción: un método de alto rendimiento para fijar y eliminar la membrana externa

Los métodos para aislar y preparar muestras de Drosophila testículos (en directo y fijo) para obtener imágenes de contraste de fase y microscopía de fluorescencia se describen en este documento.

Análisis citológico de espermatogénesis: Los preparativos en directo y fijas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Testículos

Este manuscrito presenta un detallado método para la generación X-cromosoma brazo sondas y rendimiento en situ hibridación de la fluorescencia (pescado) para examinar el estado de la hermana cohesión de cromátidas hermanas en Prometafase y metafase detenido  Drosophila ovocitos. Este protocolo es adecuado para determinar si cohesión brazo meiótica es intacta o interrumpida en diferentes genotipos.

Con fluorescencia In Situ hibridación (pescado) para supervisar el estado de la cohesión de brazo en Prometafase y metafase I ovocitos de Drosophila

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Uso de ovocitos de ratón para evaluar la función humana del Gene durante la Meiosis I

Los errores meióticos en las sinapsis y la recombinación son comunes en los ovocitos de mamíferos. El análisis riguroso de las proteínas involucradas en estos procesos es esencial para comprender cómo y por qué la ovogénesis a menudo sale mal. Las técnicas aquí presentadas permiten un seguimiento exhaustivo de la recombinación y las sinapsis para evaluar la calidad de los ovocitos en ratones.

Preparación de distribuciones de cromosomas meióticos de ovocitos de ratón para la evaluación de la sinapsis y la recombinación

Mesoscópica fluorescencia tomografía opera más allá de los límites de penetración de los tejidos de seccionamiento microscopía de fluorescencia. La técnica se basa en la iluminación multi-proyección y una descripción del transporte de fotones. Se demuestra en vivo de todo el cuerpo visualización en 3D de la morfogénesis de las buenas prácticas agrarias-que expresa ala discos imaginales...

Mesoscópica fluorescencia Tomografía por En vivo Imágenes de desarrollo Drosophila</em

Aprende a preparar oocitos de Drosophila para examinar el ensamblaje del huso y la orientación cromosómica durante la meiosis I mediante inmunofluorescencia. Este protocolo permite visualizar la dinámica cromosómica in vivo.

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