Eliminación de Drosophila Tejido muscular de larvas Filetes para el análisis de inmunofluorescencia de las neuronas sensoriales y las células epidérmicas

El objetivo general de este procedimiento es eliminar el tejido muscular de una larva de Drosophila en preparación para el análisis de inmunofluorescencia de la arborización dendrítica de las larvas o de las neuronas da y el tejido epidérmico. Hoy vamos a demostrar un método que mejora la visualización de los factores neuronales y extraneuronales implicados en la morfogénesis de las dendritas. La principal ventaja de esta técnica es que permite la obtención de imágenes de inmunofluorescencia de proteínas, que de otro modo estarían oscurecidas por el tejido muscular, mejora la relación señal-ruido y permite el uso de microscopía de súper resolución.

Para comenzar, agregue suficiente solución salina fría a un plato de elastómero de silicona para cubrir la superficie inferior. Agregue la larva en cuestión al plato y colóquela bajo el microscopio estereoscópico. Asegurar la correcta colocación de la luz.

Coloque la larva con el lado ventral hacia arriba, que se puede identificar por los cinturones dentículos abdominales. Estire la larva en la dirección anteroposterior y, con alfileres para insectos, sujete la cabeza y la cola al fondo del plato. Con un par de tijeras finas de disección, corte a lo largo de la línea media ventral de la larva de un extremo al otro.

Extienda la larva y sujete el tejido de la cutícula con alfileres en las cuatro esquinas para que quede plana. Con fórceps, extirpe los órganos internos, incluidos el SNC, el intestino y la tráquea. Ajuste los alfileres de insectos para que el filete se enseñe pero no se estire al máximo.

Ubique la línea media dorsal de la larva, donde el tejido muscular está ausente, y luego coloque una punta de pinza en el interior de este límite. Deslice la punta entre el músculo y la epidermis, teniendo cuidado de minimizar el contacto con la epidermis Para minimizar el daño a la epidermis, diseccione con las puntas más planas posibles e intente diseccionar en solución salina que contenga calcio. Eso podría ayudar a crear espacio entre el músculo y la epidermis.

A continuación, tire de las pinzas hacia arriba para romper la unión del músculo a la pared del cuerpo en un punto de anclaje. Repita este proceso para los segmentos musculares restantes de interés. Vuelva a ajustar los alfileres de insectos para estirar al máximo los filetes de larva en todas las direcciones.

Para fijar el filete, primero retire la solución salina y luego agregue formaldehído frío recién preparado al 4% en PBS, para cubrir el fondo del plato. Incubar a temperatura ambiente durante 25 minutos. Enjuague el filete cinco veces en PBS para eliminar el exceso de formaldehído.

A continuación, utilice pinzas para retirar con cuidado el tejido muscular de los puntos de anclaje restantes. De nuevo, minimizando el contacto con la epidermis. Finalmente, desenganche el filete y retírelo de la placa de disección.

Colóquelo en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mililitros. Se deben realizar más lavados, bloqueos e inmunotinciones en este tubo. Para montar el filete para la obtención de imágenes, retire la muestra del tubo de microcentrífuga y oriente su superficie interna hacia abajo sobre un cubreobjetos en una gota de PBS.

Corta la cabeza y la cola. Y luego retire el PBS absorbiéndolo con una toallita de laboratorio. Añade una gota de Antifade Mountant.

Coloque un portaobjetos de microscopio en el cubreobjetos y, a continuación, presione suavemente con una toallita de laboratorio para dispersar el medio de montaje. Dale la vuelta al lado y aplica esmalte de uñas transparente en cada borde para sellar el cubreobjetos. Estas imágenes confocales muestran experimentos de inmunofluorescencia para visualizar la proteína de unión septada, Coracle o Cora, y las neuronas da.

Aquí, se tomaron imágenes de músculo extraído y tejido muscular intacto en las mismas condiciones de potencia láser. En el tejido muscular intacto, la potencia del láser se incrementó para compensar la interferencia muscular y producir una imagen comparable. En las imágenes obtenidas de los filetes extraídos de músculo, se pudo detectar claramente la cora en los límites de las células epidérmicas en pistas intermitentes a lo largo de las dendritas de neuronas de clase cuatro.

Y delineando la neurona, el soma. Por el contrario, la localización de cora en estos dominios fue apenas detectable en el músculo de las muestras. Aquí, la cora se visualizó en gran medida en el músculo, la tráquea y las uniones neuromusculares, y la fluorescencia de estos tejidos oscureció la mayor parte de la cora epidérmica.

También se tomaron imágenes de las muestras mediante microscopía de iluminación estructurada en 3D para determinar si la eliminación de músculo mejoraba la visualización a mayor resolución. Una vez más, las muestras de músculo intacto necesitaban una visualización con mayor potencia y tiempo de exposición para compensar la interferencia muscular. La resolución de la imagen pareció más nítida en las muestras de músculo, se observaron menos artefactos y la tinción de cora de las huellas de dendritas se resolvió más fácilmente.

Las membranas de dendritas también se podían medir a 114 nanómetros en la condición de músculo apagado. Mientras que parecen tener 272 nanómetros de ancho en músculo en filetes. Al realizar este procedimiento, es importante limitar el número de larvas disecadas antes de la fijación, de modo que el tiempo transcurrido no supere los 25 minutos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo eliminar el tejido muscular de una larva de Drosophila. Este protocolo ayudará con el análisis de inmunofluorescencia de las neuronas sensoriales de las larvas y las células epidérmicas que innovan. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.