Caracterizar el transporte de electrones a través de Biofilms de vida

El objetivo general de este procedimiento experimental es determinar la cantidad de corriente que puede ser conducida a través de un material vivo in situ, así como el mecanismo empleado por el material vivo para transportar la corriente. Este método podría ayudar a responder preguntas clave en el campo de la electroquímica microbiana, tales como: ¿Cómo pueden ciertas biopelículas mover electrones a lo largo de cientos de micras para apoyar el metabolismo celular? La principal ventaja de esta técnica es que los electrodos interdigitados proporcionan una relación señal-ruido muy alta y se pueden escalar para adaptarse a muchas configuraciones de reactores diferentes.

Esos métodos pueden proporcionar información sobre el transporte de electrones extracelulares de longitud múltiple en biopelículas. También se puede aplicar a otros sistemas, como películas de polímeros conductores de electricidad. Los investigadores nuevos en este método tendrán dificultades porque requiere un bipotenciostato para establecer los potenciales de ambos electrodos por separado y medir la corriente en cada electrodo por separado.

Para empezar, obtenga electrodos IDA disponibles en el mercado modelados en un sustrato no conductor o sintetícelos utilizando métodos litográficos estándar. Prepare el epoxi de plata conductora de acuerdo con las instrucciones del fabricante con una varilla mezcladora o una punta de pipeta. Luego, coloque un cable en cada almohadilla dorada y asegúrelas en su lugar con cinta de laboratorio.

Cubra el alambre y la almohadilla con epoxi de plata con una varilla mezcladora o una punta de pipeta. Mueva con cuidado el aparato a un horno a 80 grados centígrados durante una hora para que se seque. Después de que el epoxi se cure, use un multímetro para garantizar la conductividad eléctrica entre el extremo del cable y las almohadillas.

La resistencia entre el cable y las almohadillas debe ser inferior a cinco ohmios. Además, use el multímetro para verificar que no haya epoxi conductor conectando múltiples almohadillas de electrodos, ya que esto puede cortocircuitar la matriz. Si el epoxi conductor está conectando varios cables, use el trazador para aislar los cables.

A continuación, retire la punta de un tubo de centrífuga cónico de 15 mililitros para usarlo como molde para el material aislante. Usa una aguja de calibre 21 para hacer dos pequeños agujeros en la parte inferior del molde para que sobresalgan los alambres. Inserte el IDA en el molde e inserte los cables a través de los orificios en la parte inferior del molde.

A continuación, prepare un material aislante térmico, eléctrico e impermeable. Las resinas de poliuretano ignífugas suelen ser adecuadas. Pipetea el aislante en el molde para que el epoxi de plata quede completamente cubierto y permita que el aislante se seque de acuerdo con las especificaciones del fabricante.

Para configurar la celda electroquímica, inserte el IDA, el contraelectrodo y el electrodo de referencia en la celda electroquímica. Llene la celda electroquímica con un medio estéril adecuado para el crecimiento de la biopelícula. Para Geobacter sulfurreducens, utilice un medio de agua dulce que excluya el fumarato.

A continuación, conecte los electrodos a un bipotenciostato. Conecte un electrodo IDA al cable de trabajo uno, el otro electrodo IDA al cable de trabajo dos, el electrodo de referencia al cable de referencia y el contraelectrodo al cable de contra. Realice un experimento de control realizando voltamperometría cíclica en el electrodo uno y sosteniendo el electrodo dos en circuito abierto para asegurarse de que los electrodos no estén conectados.

Para cultivar la biopelícula electroactiva correspondiente, inocule el reactor electroquímico a partir de un cultivo madre o enriquezca los microorganismos electroquímicamente activos deseados utilizando técnicas microbiológicas asépticas estándar. Para las pruebas estándar, inocule en una proporción de 1 a 20 entre el inóculo y el volumen del reactor. Ajuste la agitación en el reactor al nivel deseado y ajuste la incubadora o el baño de agua a la temperatura deseada en función de las condiciones de crecimiento de la biopelícula de interés.

Incubar el sistema en función de los requisitos específicos del microorganismo de interés hasta que la biopelícula cierre el espacio que separa los dos electrodos. Para la biopelícula estacionaria de Geobacter sulfurreducens, incubar durante siete a diez días a 30 grados centígrados. Comience la configuración de los parámetros experimentales que se utilizarán para determinar la dependencia potencial actual para las mediciones de compuerta como se describe en el protocolo de texto.

Configure el software bipotenciostato para realizar las mediciones de compuerta en el rango seleccionado a la tensión de drenaje de la fuente seleccionada y a la velocidad de escaneo deseada. Además, realice una medición de línea de base como se describe en el protocolo de texto. Realice mediciones de compuerta utilizando las mismas condiciones de rotación con donante o aceptor de electrones solubles presente en condiciones de no rotación sin donante o aceptor de electrones solubles.

Obtenga un reactor de control para garantizar que el punto de ajuste y la temperatura real del medio sean los mismos. Coloque un termómetro o un termopar en un reactor de control donde estaría el IDA. A continuación, realice mediciones de la corriente de deformación de la fuente en el rango de temperaturas seleccionado en condiciones de rotación y sin rotación utilizando el bipotenciostato.

Para hacerlo, configure y mantenga el IDA en el potencial de puerta que produce la corriente conducida máxima utilizando el bipotenciostato. Registre la corriente conducida máxima utilizando el bipotenciostato mientras la temperatura se cicla entre el rango de temperaturas seleccionado mediante los controles integrados del baño de agua o la incubadora. Cicle la temperatura de un punto de ajuste a otro y viceversa utilizando los controles integrados de la incubadora o el baño de agua.

Esto determina la reversibilidad de la reacción para garantizar que el ciclo de temperatura no dañe la biopelícula. Finalmente, restablezca la temperatura a la temperatura de crecimiento normal y permita que el sistema se estabilice. Aquí se muestran los resultados representativos de una IDA que funciona correctamente en un medio de agua dulce.

Frente a uno en el que los electrodos se han cortocircuitado. Las mediciones representativas de compuerta electroquímica realizadas en una biopelícula de Geobacter sulfurreducens en condiciones de no rotación con un voltaje de deformación de la fuente de 10 milivoltios exhiben la curva de corriente conducida en forma de pico frente a la curva de potencial de puerta característica de la conductividad redox. Aquí, los datos brutos representativos muestran la dependencia de la corriente conducida con la temperatura del medio del reactor.

La disminución de la corriente conducida con la disminución de la temperatura es otra característica de los conductores redox. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente dos días si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe asegurarse de que las bandas IDA no estén en cortocircuito antes de inocular el reactor.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia cuando se aplica para estudiar cómo interrumpir el metabolismo celular de los patógenos formadores de biopelículas. Este procedimiento se puede aplicar a cualquier material vivo capaz de transportar electrones con el fin de abordar cuestiones adicionales, como la correlación entre la refología de la biopelícula y la conductividad.