Un método para medir el ARN
5 de diciembre de 2016
Se describe un método de transferencia de Northern modificado para la medición de N 6 -methyladenosine (m 6 A) las modificaciones en el ARN. El método actual puede detectar modificaciones en diversos ARN y controles en virtud de diversos diseños experimentales.
El objetivo general de la técnica modificada de northern blot es medir las modificaciones de N6-metiladenosina, n6A, en el ARN y detectar modificaciones en diversos tipos de ARN. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el papel de la epigenética del ARN, como las modificaciones de N6-metiladenosina. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una separación eficaz del ARN, una mejor estandarización para los diseños experimentales y una delimitación clara de la modificación n6A en los ARN.
Este método puede proporcionar información sobre las modificaciones n6A en el ARN y también puede aplicarse a otras modificaciones del ARN utilizando diferentes anticuerpos de detección. Para comenzar el experimento, rocíe la solución de descontaminación de ribonucleasa sobre toallas de papel y limpie las pipetas y las superficies del banco de laboratorio. Humedezca las toallas de papel con agua libre de nucleasas y vuelva a limpiar las pipetas y las superficies del banco de laboratorio.
Obtenga la solución para aislamiento de ARN mantenida a cuatro grados Celsius y añada un mililitro de la solución a aproximadamente 75 miligramos de tejido de ratón. Utilice un agitador magnético con barra para homogeneizar el tejido. A continuación, añada 100 microlitros de 1-bromo-3-cloropropano o BCP por cada mililitro de homogenado de la muestra.
Agite los tubos vigorosamente durante 15 segundos y continúe con el aislamiento de ARN total. Mediante un espectrofotómetro, determine la concentración de ARN anotando la absorbancia a 260 nanómetros y 280 nanómetros. Verifique la calidad de la muestra de ARN realizando una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 %.
Lave todo el equipo de electroforesis con agua diethylpirocarbonato o agua DEPC. Combine 2,5 gramos de agarosa y luego 215 mililitros de agua DEPC en un matraz Erlenmeyer y derrita completamente la mezcla en un microondas. Después de que la solución se haya fundido, agregue 12,5 mililitros de tampón MOPS 10X.
Y 22,5 mililitros de formaldehído al 37 % al matraz. Luego, vierta la solución en el aparato de electroforesis con un peine de 1,5 milímetros de espesor. Utilizando un peine limpio, empuje las burbujas hacia los bordes del gel.
Deje que el gel se solidifique a temperatura ambiente. A continuación, utilice tampón de electroforesis MOPS 1X previamente preparado para enjuagar los pocillos del gel y realizar la electroforesis previa. Cargue las muestras de ARN en los pocillos del gel y luego realice la electroforesis.
Al día siguiente, examine y fotografíe el gel bajo luz ultravioleta. Para preparar la transferencia, corte el gel y retire la porción no utilizada. Prepare 500 mililitros de tampón SSC 10X (salina de citrato de sodio).
Lave el gel dos veces con tampón SSC 10X. Corte una hoja de papel filtro lo suficientemente grande como para cubrir el gel. Corte cuatro trozos de papel filtro del mismo tamaño que el gel.
A continuación, corte una hoja de membrana de nailon con carga positiva al mismo tamaño que el gel. Haga una muesca en el gel y en la membrana como marcador para asegurar la orientación adecuada. Sumerja la membrana en tampón 2X SSC.
Vierta 500 mililitros de tampón SSC 10X en la bandeja de transferencia. Coloque la hoja grande de papel filtro sobre la placa de vidrio y humedezca el papel filtro con tampón de transferencia. Luego, use una pipeta para eliminar cualquier burbuja.
Empape dos trozos de papel filtro previamente cortados en tampón de transferencia y colóquelos en el centro del papel filtro. Elimine cualquier burbuja. Luego, coloque el gel con la cara superior hacia abajo sobre el papel filtro y coloque la membrana encima del gel, asegurándose de alinear las muescas del gel y la membrana.
A continuación, coloque dos trozos de papel filtro previamente cortados encima de la membrana. Elimine cualquier burbuja entre las capas. Aplique una envoltura de plástico alrededor del gel para asegurar que las toallas solo absorban el tampón que pasa a través del gel y la membrana.
Luego, coloque toallas de papel encima del papel filtro. Coloque una placa de vidrio de tamaño grande encima de las toallas y coloque un peso encima del conjunto y deje que el ARN se transfiera desde el gel a la membrana durante la noche. Después de la transferencia, mantenga la membrana húmeda en tampón SSC 2X.
Sumerja dos hojas de papel de filtro con tampón SSC 10X, luego coloque las hojas en el enlazador UV. Asegúrese de que el lado donde se absorbió el ARN esté hacia arriba, luego coloque la membrana encima del papel de filtro. Seleccione el modo de enlace cruzado automático y presione el botón de inicio para comenzar la irradiación.
Examine la membrana y el gel con un capturador de imágenes de gel UV para confirmar la transferencia de ARN desde el gel hasta la membrana. Bloquee la membrana en tampón TBST con 5% de leche descremada durante una hora a temperatura ambiente. Incube la membrana durante la noche en solución de anticuerpo anti-m6A a cuatro grados Celsius.
Al día siguiente, lave la membrana tres veces con tampón TBST durante 15 minutos. A continuación, incube la membrana en la solución de anticuerpo secundario de burro anti-conejo conjugado con HRP durante una hora a temperatura ambiente. Después de una hora, lave la membrana tres veces con tampón TBST durante 15 minutos.
Aplique el sustrato de quimioluminiscencia mejorado. Capture la quimioluminiscencia mediante un sistema de imagen digital. Finalmente, continúe con la cuantificación de m6A y mida la intensidad quimioluminiscente relativa de m6A utilizando ImageJ. Se recolectaron ARN de hígado de ratón a intervalos de cuatro horas y se analizaron mediante la técnica de northern blot modificada.
Se detectó claramente la metilación de ARNr, ARNm y ARN pequeños. Se realizaron blotting de m6A representativos para ARN total y sin ARNr a partir de hígados de ratones de tipo silvestre. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cuatro días si se lleva a cabo adecuadamente.
Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la epigenética del ARN exploraran los impactos sobre la fisiología humana relacionados con el ritmo circadiano y la obesidad.
Descripción general
Este artículo describe un método modificado de hibridación noroeste para medir modificaciones de N6-metiladenosina (m6A) en ARN. La técnica permite la detección de modificaciones en diversas muestras de ARN y es aplicable bajo diversos diseños experimentales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- epigenética del ARN
- modificaciones m6A
- técnicas experimentales
Antecedentes
- La N6-metiladenosina es una modificación significativa del ARN.
- Comprender las modificaciones del ARN es fundamental para obtener conocimientos sobre la regulación génica.
- Los métodos actuales para detectar m6A son limitados.
- Esta técnica modificada tiene como objetivo mejorar la detección y el análisis.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para detectar modificaciones m6A en el ARN.
- Mejorar la comprensión de la epigenética del ARN.
- Proporcionar un enfoque estandarizado para diversos diseños experimentales.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de ARN a partir de tejido de ratón.
- Electroforesis para la evaluación de la calidad del ARN.
- Transferencia de ARN a una membrana de nailon.
- Detección mediante anticuerpos anti-m6A y quimioluminiscencia.
Resultados principales
- Detección exitosa de modificaciones m6A en ARNr, ARNm y ARN pequeños.
- Delimitación clara de modificaciones m6A en diversas muestras de ARN.
- La técnica puede realizarse eficientemente en cuatro días.
Conclusiones
- La técnica de blotting norteño modificada es eficaz para estudiar modificaciones del ARN.
- Este método abre nuevas vías para la investigación en epigenética del ARN.
- Las aplicaciones potenciales incluyen estudios sobre ritmos circadianos y obesidad.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La medición precisa de las modificaciones de N6-metiladenosina (m6A) en el ARN respalda la validación de dianas en la epigenética del ARN al permitir la evaluación cuantitativa de la regulación epitranscriptómica. Este método mejora la confianza predictiva en estudios mecanicistas que vinculan el m6A con procesos fisiológicos como los ritmos circadianos y el metabolismo. Proporciona una plataforma estandarizada y reproducible para reducir los riesgos en las hipótesis terapéuticas dentro de la biología del descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la estabilidad, traducción y empalme del ARN dependientes de m6A para aclarar los roles funcionales de los reguladores epigenéticos en las redes de expresión génica.
- Valor operativo: Proporciona una delimitación clara de m6A en especies de ARN, facilitando la identificación de dianas relevantes como biomarcadores en modelos de enfermedad.
- Valor predictivo: Facilita el análisis de respuesta a la dosis y de la evolución temporal de los niveles de m6A, mejorando la confianza en la interacción con la diana y la modulación de vías.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas quimioluminiscentes compatibles con imágenes de alta resolución para análisis comparativo entre condiciones experimentales.
- Valor operativo: Estandariza la transferencia y detección de ARN mediante membrana de nailon y sondas basadas en anticuerpos, reduciendo la variabilidad en el perfilado de modificaciones.
- Preparación del ensayo: Permite la comparación paralela de controles de ARN modificados y no modificados, facilitando la validación del ensayo para campañas de cribado epigenético.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Relaciona la dinámica de m6A en el ARN hepático con fenotipos metabólicos y circadianos, apoyando la exploración de biomarcadores traslacionales en modelos preclínicos.
- Valor operativo: Permite muestreos longitudinales (por ejemplo, intervalos de cuatro horas) para capturar patrones temporales de modificación relacionados con ritmos fisiológicos.
- Reducción de riesgos: Disminuye la ambigüedad en las mediciones de modificaciones del ARN, mejorando la reproducibilidad en los flujos de trabajo de validación de objetivos.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuidad de la biología de descubrimiento hasta la identificación de fármacos líderes, al proporcionar una validación de la capa epigenética que complementa los perfiles transcriptómicos y proteómicos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre escritores, borradores y lectores de m6A mediante la medición directa del estado de modificación en el ARN.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos estandarizados para evaluar los efectos de compuestos sobre marcas epitranscriptómicas en sistemas celulares o derivados de tejidos.
- Análisis: Permite la cuantificación basada en imágenes de la intensidad de la señal de m6A, facilitando la comparación estadística entre grupos de tratamiento o fondos genéticos.
- Investigación Traducional: Conecta los cambios epigenéticos en el ARN con resultados fisiológicos, apoyando la progresión preclínica alineada con biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Adaptable a diversos tipos de ARN y anticuerpos específicos de modificaciones, lo que permite su reutilización en múltiples dianas epigenéticas y áreas de enfermedad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reducción del riesgo mecanicista de dianas epigenéticas de ARN mediante la detección directa y específica de modificaciones.
- Valor operativo: Flujo de trabajo estandarizado con pasos definidos de transferencia, bloqueo y detección que garantizan la reproducibilidad entre laboratorios.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o abandono al aclarar la relevancia funcional de la m6A en vías relacionadas con enfermedades.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas epigenéticas basada en la cuantificación de la dinámica de modificaciones.
Consideraciones de Implementación
- Se requiere experiencia en el manejo de ARN, electroforesis y técnicas de inmunotransferencia.
- Los instrumentos incluyen un cruzador de UV, un sistema de imagen digital y un espectrofotómetro para la cuantificación de ARN.
- La estandarización entre equipos requiere el uso consistente de soluciones tratadas con DEPC y condiciones controladas de transferencia.
- La adaptación a otras modificaciones del ARN depende de la disponibilidad de anticuerpos específicos que reconozcan dichas modificaciones.
- Las limitaciones prácticas incluyen el riesgo de degradación del ARN y la necesidad de optimizar las condiciones de incubación y lavado con anticuerpos.
