Name: Un método para medir el ARN N 6 -methyladenosine Modificaciones en células y tejidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprende a medir modificaciones de N6-metiladenosina en ARN mediante northern blot modificado en tejido de ratón. Esta técnica permite detectar m6A en rARN, mARN y ARN pequeño para estudios de epigenética del ARN.

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C.Y.W. recibió apoyo del Instituto Nacional de Investigación en Salud (NHRI-EX101-9925SC), el Consejo Nacional de Ciencias (101-2314-B-182-100-MY3, 101-2314-B-182A-009) y el Hospital Chang Gung Memorial (CMRPG3B1643, CMRPG3D1002, CMRPG3D0581, CMRPG380091 y CMRPG3C1763).

NOTA: El ARN total m 6 A nivel incluye ARNr, ARNm, y otros ARN pequeños. Puesto que el ARN ribosomal tiene abundantes m 6 modificaciones A, la medición de los niveles A 6 m deberán tener en cuenta este hecho. 1. Aislamiento de ARN <ol><li> El uso de la solución de descontaminación ribonucleasa (pulveriza sobre toallas de papel), limpie las pipetas y las superficies de mesa de laboratorio. toallas de papel mojadas con agua libre de nucleasa y limpiar las pipetas y las superficies de mesa de laboratorio de nuevo. </li><li> La extracción de RNA <ol><li> Aislamiento de ARN total <ol><li> El uso de un agitador de cabeza, homogeneizar 50-100 mg de tejido o de 5-10 x 10 6 células en 1 ml de solución de aislamiento de ARN mantenidas a 4 ° C. NOTA: Más de tejido (100-150 mg) pueden ser necesarios para las muestras de tejido adiposo de ratones debido a las concentraciones de ARN más bajos en el mismo. Las muestras proceden de corazón de ratón, hígado, músculo esquelético, pulmón, cerebro, y los macrófagos se han empleado previamente 4. </li><li> EnCubate los homogeneizados de muestra durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 100 ml de 1-bromo-3-cloropropano (BCP) por 1 ml de homogeneizado de la muestra. Agitar los tubos vigorosamente durante 15 s y proceder a aislar RNA total de acuerdo con las instrucciones del fabricante 24. </li></ol></li><li> Poliadenilado de purificación de ARNm a partir de ARN total aislado <ol><li> Purificar el ARNm poliadenilado utilizando kits o protocolos disponibles. <ol><li> Agitar a fondo para volver a suspender cada una de las siguientes soluciones: solución de enlace, perlas de poliestireno oligo (dT), y solución de lavado de 2x. Asegúrese de que el oligo (dT) Cuentas de calentar a temperatura ambiente antes de su uso. </li><li> Transferir 120 l de solución de elución por la preparación en un tubo y se calienta a 70 ° C en un bloque de calentamiento. </li><li> Pipetear hasta 500 g de ARN total en un tubo de microcentrífuga. Con agua libre de nucleasa, ajustar el volumen a 250 mL. </li><li> Añadir 250 l de solución de enlace 2x con el ARN total, de modolución y vortex brevemente para mezclar el contenido. </li><li> Añadir 15 l de oligo (dT) perlas y mezclar bien para mezclar. </li><li> Incubar la mezcla a 70 ° C durante 3 min. </li><li> Sacar la muestra del bloque de calentamiento y se deja reposar a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Se centrifuga a 15.000 xg durante 2 min. </li><li> Retirar con cuidado el sobrenadante, dejando atrás aproximadamente 50 l. </li><li> Añadir 500 l de solución de lavado a una nueva suspensión del sedimento con la pipeta. </li><li> Pipetear la suspensión en un conjunto tubo de filtro giratorio / colección. </li><li> Se centrifuga a 15.000 xg durante 2 min. Retirar la columna del tubo de recogida y desechar el flujo a través. Retorno de la columna para el tubo de recogida. </li><li> Pipetear 500 l de solución de lavado sobre el filtro de centrifugado. </li><li> Centrifugar a 15.000 x g durante 2 min. </li><li> Transferir el filtro giratorio en un tubo de recogida fresca. </li><li> Pipetear 50 l de solución de elución calientaa 70 ° C en el centro del filtro de centrifugado. </li><li> Incubar durante 2-5 minutos a 70 ° C. Se centrifuga a 15.000 xg durante 1 min. </li><li> Pipetear un 50 l adicionales de solución de elución se calienta a 70 ° C en el centro del filtro de centrifugado. </li><li> Repita el paso 1.2.2.1.18. </li></ol></li><li> Añadir 100 g / ml de glucógeno, 0,1 volumen de tampón de sodio 3 M de acetato (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol absoluto. Precipitar durante la noche a -80 ° C. </li><li> Centrifugar a 15.000 xg durante 25 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante. </li><li> Lavar el sedimento con 1 ml de 75% de etanol. Centrifugar a 15.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Retirar con cuidado el etanol. </li><li> Secar al aire durante 3-5 min. </li><li> Añadir 10 l de agua libre de nucleasa a disolver el precipitado. </li><li> Almacenar a -70 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Calificación y Cuantificación de ARN <ol><li> El uso de un espectrofotómetro, determinar la concentración de ARN por NotIng de la absorbancia a 260 nm y 280 nm. La relación A 260 / A 280 debería ser 1/8 a 2/2. </li><li> Comprobar la calidad de las muestras de ARN mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% 25. NOTA: El ARN total eucariota intacta debería mostrar intensas bandas 28S y 18S rRNA. La relación de 28S frente a la intensidad de banda 18S rRNA para una buena preparación de ARN es ~ 2. </li></ol></li></ol> 2. Electroforesis en gel y transferencia NOTA: Los protocolos de preparación de tampón se dan en la Tabla 1. <ol><li> El formaldehído Preparación del gel (1%) <ol><li> Enjuague todo el equipo de electroforesis con agua diethylpyrocarbonate (DEPC). </li><li> Derretir 2,5 g de agarosa en 215 ml de agua DEPC completamente en un horno de microondas. </li><li> Añadir 12,5 ml de 10x 3- (N- morfolino) propanosulfónico (MOPS) tampón y 22,5 ml de formaldehído al 37%. </li><li> Se vierte en el aparato de electroforesis con un peine de espesor 1,5 mm. </li><li> Eliminar las burbujas o empujar tdobladillo a los bordes del gel con un peine limpia. </li><li> Permitir que el gel solidifique a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparación de la muestra <ol><li> Mezclar 1-10 g de ARN total y 11,3 l de tampón de muestra. </li><li> Mezclar 2 g del marcador de ARN (1 g / l) con 11,3 l de tampón de la muestra. </li><li> Añadir agua libre de nucleasa a las muestras de 2.2.1 y 2.2.2 a un volumen total de 16 mL. </li><li> Se calienta a 60 ° C durante 5 min, y luego se enfría en hielo. </li><li> Mezclar 16 l de la muestra a partir de 2.2.3 con 4 l de colorante de seguimiento, que contiene 0,1 g / l de bromuro de etidio en hielo. PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es teratogénico y posiblemente tóxicos si se inhalan. Leer bromuro de etidio hoja técnica de seguridad. </li></ol></li><li> electroforesis <ol><li> Añadir 200 ml de 10x MOPS buffer de 1.800 ml de ddH2O para hacer un tampón de desarrollo 1x MOPS. </li><li> Utilice el tampón de MOPS 1x para enjuagar los pocillos del gel. </li><li> Previa al funcionamiento de tél gel a 20 V durante 5 min. </li><li> Cargar las muestras de ARN en los pocillos del gel. </li><li> Cubrir con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Ejecutar a 35 V durante aproximadamente 17 h (durante la noche) </li><li> Examinar y fotografiar el gel bajo una luz ultravioleta. </li></ol></li><li> Transferir <ol><li> Cortar el gel para eliminar la parte no utilizada. </li><li> Preparar 500 ml de tampón 10x SSC (250 ml de 20x tampón SSC y 250 ml de agua DEPC). </li><li> Se lava el gel dos veces con 10x tampón SSC durante 20 min con agitación a 50 rpm. </li><li> Cortar la hoja de papel 1 de filtro suficientemente grande para servir como un documento de mecha, que absorbe tampón de transferencia de la bandeja de transferencia (Figura 1). </li><li> Cortar 4 trozos de papel de filtro para el mismo tamaño que el gel. </li><li> Cortar 1 hoja de membrana de nylon cargada positivamente con el mismo tamaño que el gel. </li><li> Marque una muesca en el gel y la membrana como un marcador para asegurar la orientación apropiada. </li><li> Remojar la membrana en tampón SSC 2x durante 15 minutos. </li><li> Verter 500 ml de Of 10x SSC tampón en la bandeja de transferencia. </li><li> Ponga la hoja de papel de filtro grande a través de la placa de vidrio y humedecer el papel de filtro con tampón de transferencia. </li><li> Estirar las burbujas con una pipeta. </li><li> Remojar 2 piezas de papel de filtro de pre-corte en tampón de transferencia y colocarlos en el centro del papel de filtro de paso 2.4.5. Eliminar las burbujas. </li><li> Coloque el lado superior del gel en el papel de filtro. </li><li> Colocar la membrana en la parte superior del gel. Alinear las muescas del gel y la membrana. </li><li> Colocar 2 piezas de papel de filtro de pre-corte en la parte superior de la membrana y humedecer el papel de filtro con tampón de transferencia. </li><li> Eliminar las burbujas entre las capas. </li><li> Aplicar una envoltura de plástico alrededor del gel para asegurar que las toallas solamente absorben tampón que pasa por el gel y la membrana. </li><li> Pila de las toallas de papel en la parte superior del papel de filtro. </li><li> Colocar una placa de vidrio de gran tamaño en la parte superior de las toallas. </li><li> Coloque un peso en la parte superior de la pila. </li><li>Mantener durante la noche para permitir que el ARN para transferir desde el gel a la membrana. </li></ol></li></ol> 3. Detección de N 6 -methyladenosine <ol><li> La reticulación de la membrana <ol><li> Mantener la membrana húmeda en tampón SSC 2x. </li><li> Coloque 2 hojas de papel de filtro sumergido con tampón 10x SSC en agente de reticulación UV. </li><li> Colocar la membrana en la parte superior del papel de filtro, con el lado de ARN adsorbido hacia arriba. </li><li> Seleccionar &quot;modo autocrosslink&quot; (120.000 mu J) y pulse el botón &quot;Inicio&quot; para iniciar la irradiación. </li><li> Examinar la membrana y el gel con una imagen gel receptor UV para confirmar la transferencia del ARN del gel a la membrana. </li></ol></li><li> inmunotransferencia <ol><li> Bloquear la membrana en la leche no grasa 5% en solución salina tamponada con Tris con 20 tampón de Tween (TBST) a temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Lavar tres veces con tampón de TBST durante 15 min. </li><li> Incubar la membrana durante la noche en m 6 A (&lt;em&gt; solución de N 6 -methyladenosine) de anticuerpos (1: no grasa de la leche TBST buffer 1.000 en 5%) a 4 ° C. </li><li> Se lava la membrana tres veces con tampón de TBST durante 15 min. </li><li> Incubar la membrana en la solución de burro conjugado con HRP anti-anticuerpo de conejo (1: 2000 en tampón TBST leche 5% no grasa) durante 1 h a temperatura ambiente. </li><li> Se lava la membrana tres veces con tampón de TBST durante 15 min. </li><li> Aplicar el sustrato quimioluminiscente intensificado (0,125 ml por cm2 de membrana). </li><li> Capturar la quimioluminiscencia con los ajustes óptimos de la cámara digital, de acuerdo con las instrucciones del fabricante 26. </li></ol></li><li> m 6 una cuantificación <ol><li> Medir la m 6 Una intensidad de quimioluminiscencia relativa utilizando el software ImageJ. <ol><li> Bajo el menú del software ImageJ, seleccione la opción &quot;Archivo&quot; para abrir el archivo pertinente. </li><li> Seleccione la herramienta &quot;Rectángulo&quot; de ImageJ y dibujar un marco alrededorlas señales. </li><li> Si RNA ribosomal no es el foco de los experimentos, evitar los 18S y 28S ARN ribosomal m 6 bandas A para el cálculo. </li><li> Haga clic en &quot;Comando&quot; y &quot;1&quot; para confirmar el carril seleccionado. </li><li> Pulse la tecla &quot;Comando&quot; y &quot;3&quot; para mostrar la parcela seleccionada. </li><li> Haga clic en la herramienta &quot;Straight&quot; y trazar líneas para separar el área segmentada. </li><li> Haga clic en la herramienta &quot;varita&quot; para registrar las mediciones. </li><li> Exportar los datos. </li><li> Normalizar los niveles de m 6 A con el 18S ARN ribosomal banda de la tinción con bromuro de etidio. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Klungland, A., Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+RNA+modifications+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Dynamic RNA modifications in disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las modificaciones del ARN tienen un papel importante en la función celular y la fisiología. La comprensión actual de la regulación, función y homeostasis de estas modificaciones aún se está explorando y ampliando8. Por lo tanto, se necesita un método preciso y estándar de oro para evaluar las modificaciones del ARN. El método de transferencia del norte modificado proporciona una cuantificación precisa de las modificaciones del ARN y una clara delimitación de las modificaciones en diversos ARN. Aunque el método requiere al menos 3 días, se puede estandarizar y se puede utilizar en varios diseños experimentales. Además, con diferentes anticuerpos, puede detectar diferentes modificaciones del ARN27.
Es importante separar diferentes ARN al analizar las modificaciones del ARN. El ARN ribosómico comprende una gran parte de la cantidad total de ARN28,29. Los resultados del análisis de las modificaciones del ARN solo en el ARN total representarán principalmente los cambios del ARNr. La metilación y otras modificaciones similares del ARNr podrían enmascarar los cambios en otros ARN. Con el procedimiento de separación en gel, las modificaciones del ARNm y otros ARN pequeños se pueden analizar con mayor precisión.
El mapeo de todo el transcriptoma con inmunoprecipitación y secuenciación de m6A proporciona información detallada sobre la modificación de cada tipo de ARN22. Proporciona información sobre los ARN específicos y una resolución de alrededor de 80-120 pb. Aunque m6A-Seq puede comparar las modificaciones entre diferentes condiciones experimentales, la selección de estándares y controles adecuados para tales experimentos es difícil18. La inmunoprecipitación es difícil de reproducir, a menudo dando variaciones significativas entre las repeticiones. Además, m6A-Seq requiere la fragmentación de muestras de ARN antes de la inmunoprecipitación y secuenciación30. El proceso de fragmentación podría inducir influencias indebidas en las modificaciones originales del ARN. Si el experimento no necesita la información del gen específico pero requiere diferentes condiciones para la comparación, el método actual proporciona una mejor visualización y control para diversas configuraciones experimentales. 
La modificación del ARN es un paso importante en la regulación del control transcripcional31. Sin embargo, la homeostasis y los mecanismos reguladores de varias modificaciones de ARN en diversos reinos fisiológicos aún no están claros. Utilizando el actual método de transferencia del norte modificado, se pueden cuantificar y comparar diferentes modificaciones del ARN. Además, los cambios y regulaciones de las modificaciones del ARN se pueden investigar con mayor detalle. En el futuro, también podría ser posible combinar los datos experimentales de los protocolos clásicos de Northern blot y Northern Blot modificados, proporcionando una mayor comprensión de la biología del ARN.
El factor más importante que determina el éxito del protocolo de transferencia del norte modificado es la integridad de la muestra de ARN. Los ARN con cierta cantidad de degradación pueden producir buenos resultados clásicos de Northern blotting, pero esto podría tener un impacto significativo en los resultados modificados de Northern blotting. Las modificaciones del ARN en diferentes tejidos o líneas celulares también podrían variar significativamente. Es importante probar las cargas de muestra de ARN adecuadas para diferentes tejidos antes de realizar los experimentos finales.
Como los procedimientos de transferencia han sido tradicionalmente nombrados en honor al Dr. Southern y diferentes direcciones geográficas, proponemos el nombre de transferencia "noreste" para la técnica actual.

Las modificaciones dinámicas y reversibles del ARN tienen un papel importante en la homeostasis del ARN. Hace cuatro décadas, se encontró que las modificaciones de N 6-metiladenosina (m6A) eran abundantes en los transcriptomas eucariotas1. Tienen diversas funciones en el ARN mensajero (ARNm), el ARN ribosómico (ARNr), el ARN nucleolar pequeño, el ARN de transferencia y el microARN2. Las modificaciones m6A del ARNm influyen en su empalme3, traducción4, degradación5 y localización2. Además, afectan a la biogénesis de los ribosomas y a la función de los microARN6. La conservación evolutiva de las modificaciones m6A del ARN se observa en bacterias unicelulares a humanos multicelulares7. La delimitación de las funciones de las modificaciones de m6A se encuentra actualmente bajo una amplia exploración. Se espera que los esfuerzos proporcionen nuevos conocimientos sobre el control de la transcripción. Estudios recientes revelan que otras modificaciones químicas del ARNm8 también desempeñan un papel fundamental en el metabolismo del ARN. 
Ritmos circadianos9, pluripotencia de las células madre10, metabolismo de los triglicéridos4, fibrosis11, obesidad12 y depresión mayor13 son algunos ejemplos de procesos en los que se sabe que las modificaciones de m6A controlan los resultados. Muchas transcripciones de genes del reloj circadiano tienen sitios m6A14. La modulación de la m6A metilasa o demetilasa provoca cambios en el período circadiano15. Mettl3, una transferasa m6A, es un regulador de la pluripotencia de las células madre. Una deficiencia de Mettl3 conduce a una letalidad embrionaria temprana y a un cebado de linaje aberrante en la etapa post-implantación10. Una deficiencia de masa grasa asociada a la obesidad y la masa grasa (FTO), una m6A desmetilasa, en los adipocitos afecta la movilización de ácidos grasos y el peso corporal a través de la regulación postranscripcional de Angptl44. Estos estudios revelan que el m6A no solo controla el procesamiento del ARNm, sino que también desempeña un papel fundamental en el desarrollo embriológico y la fisiopatología. La función de las modificaciones de m6A tiene implicaciones para las consideraciones terapéuticas en el futuro.
Hay varios métodos disponibles para medir las modificaciones m6A del ARN16-18. Tradicionalmente, la cromatografía en capa fina (TLC) y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se utilizan para estudiar la distribución de m6A en varios ARN19,20. La espectrometría de masas es una herramienta sensible para la detección de modificaciones de m6A en el ARN. Sin embargo, el ARN necesita ser extirpado por la RNasa en fragmentos cortos antes del análisis por espectrometría de masas21. La inmunoprecipitación y secuenciación de metil-ARN (m6A-Seq)22 inmunoprecipita ARN fragmentados con anticuerpos m6A específicos y realiza una secuenciación paralela de ARN. Este método genera paisajes m6A de todo el transcriptoma. El mapeo de alta resolución de la reticulación e inmunoprecipitación de resolución de nucleótidos individuales m6A (miCLIP) mapea aún más las modificaciones de m6A a una resolución de un solo nucleótido23. Ambos métodos proporcionan detalles de la modificación de m6A en todo el transcriptoma, con información de genes específicos. Sin embargo, las cuantificaciones y estandarizaciones en ambos métodos son difíciles si los experimentos requieren la comparación de múltiples condiciones. Además, las fragmentaciones del ARN para m6A-Seq alteran la estructura original del ARN, lo que puede afectar a los niveles nativos de m6A. Para detectar modificaciones globales de m6A del ARN y sus cambios en diferentes condiciones experimentales, presentamos un método que emplea un protocolo de Northern blot modificado. Este método resuelve el ARN por peso molecular, utilizando electroforesis en gel18. Este procedimiento proporciona una mejor estandarización y cuantificación para experimentos que involucran múltiples condiciones o muestras. También proporciona información específica de modificación de m6A para diferentes ARN, ya sea ARNr, ARNm o microARN.

<table><tbody><tr><td>Solución RNaseZap</td><td>Protocolo Ambion</td><td>AM9782</td><td>1.1</td></tr><tr><td>Solución de reactivo TRI</td><td>Protocolo Ambion</td><td>AM9738</td><td>1.2.1.1</td></tr><tr><td>1-Bromo-3-cloropropano (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B9673</td><td>Protocolo 1.2.1.3</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Protocolo JTbaker</td><td>8006</td><td>1.2.1.3</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>Protocolo 1.2.1.3</td></tr><tr><td>Kit de minipreparación de ARNm GenElute</td> Protocolo <td>Sigma</td><td>MRN70</td><td>1.2.2.1</td></tr><tr>Protocolo <td>Ambion</td><td>AM9510</td> de<td>glucógeno</td><td>1.2.2.2</td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Protocolo Fluka</td><td>71183</td><td>1.2.2.2</td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td><td>Protocolo Ambion</td><td>AM9930</td><td>1.2.2.6</td></tr><tr><td>Protocolo DEPC</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>2.1.1</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>JT Baker</td><td>Protocolo A426</td><td>2.1.2</td></tr><tr><td>Protocolo MOPS</td><td></td><td>Sigma M1254</td><td>2.1.3</td></tr><tr><td>Solución de formaldehído al 37%</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Protocolo 2.1.3</td></tr><tr><td>EDTA, sal disódica</td><td>Protocolo JT Baker</td><td>8993</td><td>2.1.3 10x MOPS tampón</td></tr><tr><td>formamida</td><td>Sigma</td><td>F7503</td><td>Protocolo 2.2.1</td></tr><tr><td>ARN Marcador Milenio</td><td>Ambion</td><td>AM7150</td><td>Protocolo 2.2.2</td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Amresco</td><td>X328</td><td>Protocolo 2.2.5</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0300-10</td><td>Protocolo 2.2.5 Colorante de rastreo</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma</td><td>114391</td><td>Protocolo 2.2.5 colorante de rastreo</td></tr><tr><td>Xileno Cyanol FF</td><td>Sigma</td><td>X4126</td><td>Protocolo 2.2.5 colorante de rastreo</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio dihidratado</td><td>JT Baker</td><td>Protocolo 3624</td><td>2.4.2 Tampón SSC 20x</td></tr><tr><td>Citrato trisódico</td> Protocolo <td>Sigma</td><td>S1804</td><td>2.4.2 Tampón SSC 20x</td></tr><tr><td>Papel secante Hybond Protocolo</td><td>RPN6101M</td><td>GE Healthcare</td><td>2.4.4</td></tr><tr><td>Membrana GE Hybond-N+</td> Protocolo <td>RPN303B</td><td>GE</td><td>Healthcare 2.4.6</td></tr><tr><td>Reticulante UV Stratalinker 2400</td><td>Protocolo 400075 Estratageno</td><td></td><td>3.1.2</td></tr><tr><td>Gel Catcher 1500</td><td>Tecnología ANT</td><td>Gel Catcher 1500</td><td>Protocolo 3.1.5</td></tr><tr><td>Anti-m6A (N6-metiladenosina)</td><td>Sistemas sinápticos</td><td></td><td>Protocolo 202003 3.2.3</td></tr><tr><td>Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, enlazado a HRP entero Ab</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934</td><td>Protocolo 3.2.5</td></tr><tr><td>Sistema ChemiDoc MP</td><td>BIO-RAD</td><td>1708280</td><td>Protocolo 3.2.8</td></tr></tbody></table>

un método para medir el arn<em&gt; n</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine modificaciones en células y tejidos

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

NLas modificaciones del ARN de 6-metiladenosina (m6A) son diversas y ubicuas entre los eucariotas. Se encuentran en ARNm, ARNr, ARNt y microARN. Estudios recientes han revelado que estas modificaciones reversibles del ARN afectan al empalme, la traducción, la degradación y la localización del ARN. Múltiples procesos fisiológicos, como los ritmos circadianos, la pluripotencia de las células madre, la fibrosis, el metabolismo de los triglicéridos y la obesidad, también están controlados por las modificaciones m6A. La inmunoprecipitación/secuenciación, la espectrometría de masas y la transferencia de Northern modificada son algunos de los métodos comúnmente empleados para medir las modificaciones de m6A. En este trabajo se presenta una técnica de transferencia noreste para medir las modificaciones de m6A. El protocolo actual proporciona una buena separación del tamaño del ARN, una mejor adaptación y estandarización para varios diseños experimentales, y una clara delineación de las modificaciones de m6A en varias fuentes de ARN. Si bien se sabe que las modificaciones de m6A tienen un impacto crucial en la fisiología humana relacionada con los ritmos circadianos y la obesidad, su papel en otros estados (pato)fisiológicos no está claro. Por lo tanto, las investigaciones sobre las modificaciones de m6A tienen una inmensa posibilidad de proporcionar información clave sobre la fisiología molecular.

Después de 14 días en la fase circadiana normal de luz-oscuridad, los ratones de tipo salvaje se colocaron en la oscuridad constante. Los ARN de hígado fueron muestreados a intervalos de 4 horas y estudiados con el norte de secante modificada. La metilación de rRNAs, mRNAs, y pequeños RNAs se detectaron claramente (Figura 2). La comparación entre diferentes momentos circadianos (CT) se puede calcular con precisión con el estándar de 18S rRNA. Hubo robusta oscilación circadiana de m 6 niveles A en ARNr, ARNm y ARN pequeños. Para evitar la interferencia ofrecida por ARNr, ARN poliadenilados se pueden purificar, como en el paso 1.2.2. Después de la purificación, el rRNA puede ser eliminado en gran medida para permitir una mejor visualización de los otros ARN (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig1.jpg" /> <stron<html> g&gt; Figura 1: Montaje de la unidad de transferencia blot. Se muestra la unidad de transferencia capilar para secar el ARN a la membrana. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig2.jpg" /> Figura 2: El ritmo circadiano de los m 6 niveles A en ratones C57BL / 6J. Esta figura muestra la m 6 Una mancha de ARN total de hígado de los ratones de tipo salvaje se sacrificó en el primer día de la fase oscura-oscura después de 14 días de una fase normal de luz-oscuridad a las 4 h intervalos. La cuantificación se realizó utilizando el m 6 A diferencia de densidad de imagen entre 18S y 28S rRNA. El m 6 Un abundancia se normalizó a la banda de 18S rRNA de la gel de formaldehído en la parte inferior.et = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig3.jpg" /> Figura 3: Los m 6 borrones A con o sin rRNA. M representativos se muestran 6 A borrones de ARN total y ARN poliadenilado de los hígados de los ratones de tipo salvaje. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1 </td><td colspan="3"> 10x tampón MOPS (pH 7,0, protegerlo de la luz) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> MOPS </td><td> 41.85 </td><td> gramo </td><td> 0,2 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Acetato de sodio </td><td> 4.1 </td><td> gramo </td><td>0,05 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> EDTA, sal disódica </td><td> 3.7 </td><td> gramo </td><td> 0,01 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> agua DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Total </td><td> 1 </td><td> L </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Se agita a temperatura ambiente </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="3"> tampón SSC 20x (pH 7,0) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Cloruro de sodio </td><td> 175.3 </td><td> gramo </td><td> 3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Citrato de trisodio </td><td> 88.3 </td><td> gramo </td><td> 0,3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> agua DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Total </td><td> 1 </td><td> L </td><td></td&gt; </tr><tr><td></td><td colspan="3"> Se agita a temperatura ambiente, a continuación, el autoclave </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="3"> colorante guía </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 10x tampón MOPS </td><td> 500 </td><td> l </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Ficoll 400 </td><td> 0.75 </td><td> gramo </td><td> 15% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> azul de bromofenol </td><td> 0.01 </td><td> gramo </td><td> 0,2% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> xileno cianol </td><td> 0.01 </td><td> gramo </td><td> 0,2% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> agua DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Total </td><td> 5 </td><td> ml </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Almacenar a -20 ° C </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="3"> agua DEPC </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Diluir en relación 1: 1.000 de DEPC en ddH2O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Se agita durante la noche a temperatura ambiente, a continuación, el autoclave </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="3"> tampón de muestra (protegerlo de la luz) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 10x tampón MOPS </td><td> 200 </td><td> l </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 37% de formaldehído </td><td> 270 </td><td> l </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> formamida </td><td> 660 </td><td> l </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Almacenar a -20 ° C </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table> Tabla 1: Los tampones y soluciones.

Se describe un método de transferencia de Northern modificado para la medición de N 6 -methyladenosine (m 6 A) las modificaciones en el ARN. El método actual puede detectar modificaciones en diversos ARN y controles en virtud de diversos diseños experimentales.

Un método para medir el ARN<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Modificaciones en células y tejidos

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

El objetivo general de la técnica modificada de northern blot es medir las modificaciones de N6-metiladenosina, n6A, en el ARN y detectar modificaciones en diversos tipos de ARN. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el papel de la epigenética del ARN, como las modificaciones de N6-metiladenosina. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una separación eficaz del ARN, una mejor estandarización para los diseños experimentales y una delimitación clara de la modificación n6A en los ARN.Este método puede proporcionar información sobre las modificaciones n6A en el ARN y también puede aplicarse a otras modificaciones del ARN utilizando diferentes anticuerpos de detección. Para comenzar el experimento, rocíe la solución de descontaminación de ribonucleasa sobre toallas de papel y limpie las pipetas y las superficies del banco de laboratorio. Humedezca las toallas de papel con agua libre de nucleasas y vuelva a limpiar las pipetas y las superficies del banco de laboratorio.Obtenga la solución para aislamiento de ARN mantenida a cuatro grados Celsius y añada un mililitro de la solución a aproximadamente 75 miligramos de tejido de ratón. Utilice un agitador magnético con barra para homogeneizar el tejido. A continuación, añada 100 microlitros de 1-bromo-3-cloropropano o BCP por cada mililitro de homogenado de la muestra.Agite los tubos vigorosamente durante 15 segundos y continúe con el aislamiento de ARN total. Mediante un espectrofotómetro, determine la concentración de ARN anotando la absorbancia a 260 nanómetros y 280 nanómetros. Verifique la calidad de la muestra de ARN realizando una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 %.Lave todo el equipo de electroforesis con agua diethylpirocarbonato o agua DEPC. Combine 2,5 gramos de agarosa y luego 215 mililitros de agua DEPC en un matraz Erlenmeyer y derrita completamente la mezcla en un microondas. Después de que la solución se haya fundido, agregue 12,5 mililitros de tampón MOPS 10X.Y 22,5 mililitros de formaldehído al 37 % al matraz. Luego, vierta la solución en el aparato de electroforesis con un peine de 1,5 milímetros de espesor. Utilizando un peine limpio, empuje las burbujas hacia los bordes del gel.Deje que el gel se solidifique a temperatura ambiente. A continuación, utilice tampón de electroforesis MOPS 1X previamente preparado para enjuagar los pocillos del gel y realizar la electroforesis previa. Cargue las muestras de ARN en los pocillos del gel y luego realice la electroforesis.Al día siguiente, examine y fotografíe el gel bajo luz ultravioleta. Para preparar la transferencia, corte el gel y retire la porción no utilizada. Prepare 500 mililitros de tampón SSC 10X (salina de citrato de sodio).Lave el gel dos veces con tampón SSC 10X. Corte una hoja de papel filtro lo suficientemente grande como para cubrir el gel. Corte cuatro trozos de papel filtro del mismo tamaño que el gel.A continuación, corte una hoja de membrana de nailon con carga positiva al mismo tamaño que el gel. Haga una muesca en el gel y en la membrana como marcador para asegurar la orientación adecuada. Sumerja la membrana en tampón 2X SSC.Vierta 500 mililitros de tampón SSC 10X en la bandeja de transferencia. Coloque la hoja grande de papel filtro sobre la placa de vidrio y humedezca el papel filtro con tampón de transferencia. Luego, use una pipeta para eliminar cualquier burbuja.Empape dos trozos de papel filtro previamente cortados en tampón de transferencia y colóquelos en el centro del papel filtro. Elimine cualquier burbuja. Luego, coloque el gel con la cara superior hacia abajo sobre el papel filtro y coloque la membrana encima del gel, asegurándose de alinear las muescas del gel y la membrana.A continuación, coloque dos trozos de papel filtro previamente cortados encima de la membrana. Elimine cualquier burbuja entre las capas. Aplique una envoltura de plástico alrededor del gel para asegurar que las toallas solo absorban el tampón que pasa a través del gel y la membrana.Luego, coloque toallas de papel encima del papel filtro. Coloque una placa de vidrio de tamaño grande encima de las toallas y coloque un peso encima del conjunto y deje que el ARN se transfiera desde el gel a la membrana durante la noche. Después de la transferencia, mantenga la membrana húmeda en tampón SSC 2X.Sumerja dos hojas de papel de filtro con tampón SSC 10X, luego coloque las hojas en el enlazador UV. Asegúrese de que el lado donde se absorbió el ARN esté hacia arriba, luego coloque la membrana encima del papel de filtro. Seleccione el modo de enlace cruzado automático y presione el botón de inicio para comenzar la irradiación.Examine la membrana y el gel con un capturador de imágenes de gel UV para confirmar la transferencia de ARN desde el gel hasta la membrana. Bloquee la membrana en tampón TBST con 5% de leche descremada durante una hora a temperatura ambiente. Incube la membrana durante la noche en solución de anticuerpo anti-m6A a cuatro grados Celsius.Al día siguiente, lave la membrana tres veces con tampón TBST durante 15 minutos. A continuación, incube la membrana en la solución de anticuerpo secundario de burro anti-conejo conjugado con HRP durante una hora a temperatura ambiente. Después de una hora, lave la membrana tres veces con tampón TBST durante 15 minutos.Aplique el sustrato de quimioluminiscencia mejorado. Capture la quimioluminiscencia mediante un sistema de imagen digital. Finalmente, continúe con la cuantificación de m6A y mida la intensidad quimioluminiscente relativa de m6A utilizando ImageJ. Se recolectaron ARN de hígado de ratón a intervalos de cuatro horas y se analizaron mediante la técnica de northern blot modificada.Se detectó claramente la metilación de ARNr, ARNm y ARN pequeños. Se realizaron blotting de m6A representativos para ARN total y sin ARNr a partir de hígados de ratones de tipo silvestre. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cuatro días si se lleva a cabo adecuadamente.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la epigenética del ARN exploraran los impactos sobre la fisiología humana relacionados con el ritmo circadiano y la obesidad.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

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Este protocolo proporciona un enfoque detallado para evaluar los niveles de modificación de m6Ade ARN específico utilizando MeRIP-qPCR.

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