Un método para medir el ARN N 6 -methyladenosine Modificaciones en células y tejidos

El objetivo general de la técnica de Northern blot modificado es medir las modificaciones de N6-metiladenosina, n6A en el ARN y detectar modificaciones en diversos ARN. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el papel de la epigenética del ARN, como las modificaciones de la N6-metiladenosina. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una separación efectiva del ARN, una mejor estandarización para los diseños experimentales y una clara delineación de la modificación de n6A en los ARN.

Este método puede proporcionar información sobre las modificaciones de n6A en el ARN y también se puede aplicar a otras modificaciones de ARN con diferentes anticuerpos de detección. Para comenzar el experimento, rocíe la solución de descontaminación de ribonucleasa sobre toallas de papel y limpie las pipetas y las superficies de la mesa de laboratorio. Humedece las toallas de papel con agua libre de nucleasas y vuelve a limpiar las pipetas y las superficies de la mesa de laboratorio.

Obtenga una solución de aislamiento de ARN mantenida a cuatro grados centígrados y agregue un mililitro de la solución a aproximadamente 75 miligramos de tejido de ratón. Utilice un agitador aéreo para homogeneizar el tejido. A continuación, agregue 100 microlitros de 1-Bromo-3-cloropropano o BCP por un mililitro de homogeneizado de muestra.

Agite los tubos vigorosamente durante 15 segundos y proceda al aislamiento total del ARN. Usando un espectrofotómetro, determine la concentración de ARN anotando la absorbancia a 260 nanómetros y 280 nanómetros. Compruebe la calidad de la muestra de ARN realizando electroforesis en gel de agarosa al 0,8%.

Enjuague todo el equipo de electroforesis con agua de dietilpirocarbonato o DEPC. Combine 2,5 gramos de agarosa, luego 215 mililitros de agua DEPC en un matraz Erlenmeyer y derrita completamente la mezcla en un microondas. Después de que la solución se haya derretido, agregue 12,5 mililitros de tampón MOPS 10X.

Y 22,5 mililitros de formaldehído al 37% por matraz. A continuación, vierta la solución en el aparato de electroforesis con un peine de 1,5 milímetros de grosor. Con un peine limpio, empuje las burbujas hacia los bordes del gel.

Deja que el gel se solidifique a temperatura ambiente. A continuación, utilice el tampón de funcionamiento 1X MOPS previamente preparado para enjuagar los pocillos del gel y ejecutar previamente el gel. Cargue las muestras de ARN en los pocillos del gel y luego haga correr el gel.

Al día siguiente, examine y fotografíe el gel bajo una luz ultravioleta. Para preparar la transferencia, corte el gel y retire la porción no utilizada. Prepare 500 mililitros de citrato de sodio salino 10X o tampón SSC.

Lave el gel dos veces con tampón SSC 10X. Corta una hoja de papel de filtro lo suficientemente grande como para cubrir el gel. Corta cuatro pedazos de papel de filtro del mismo tamaño que el gel.

A continuación, corte una hoja de membrana de nailon cargada positivamente del mismo tamaño que el gel. Marque una muesca en el gel y en la membrana como marcador para garantizar la orientación adecuada. Remoje la membrana en tampón SSC 2X.

Vierta 500 mililitros de tampón SSC 10X en la bandeja de transferencia. Coloque la hoja de papel de filtro grande sobre la placa de vidrio y humedezca el papel de filtro con tampón de transferencia. A continuación, utilice una pipeta para extender las burbujas.

Remoje dos trozos de papel de filtro precortado en un tampón de transferencia y colóquelos en el centro del papel de filtro. Retira las burbujas. A continuación, coloque la parte superior del gel hacia abajo sobre el papel de filtro y coloque la membrana encima del gel, asegurándose de alinear las muescas del gel y la membrana.

A continuación, coloque dos trozos de papel de filtro precortado encima de la membrana. Retira las burbujas entre las capas. Aplique una envoltura de plástico alrededor del gel para asegurarse de que las toallas solo absorban el tampón que pasa a través del gel y la membrana.

Luego, apila toallas de papel sobre el papel de filtro. Coloque un plato de vidrio de gran tamaño encima de las toallas y coloque un peso encima de la pila y permita que el ARN se transfiera del gel a la membrana durante la noche. Después de la transferencia, mantenga la membrana húmeda en tampón SSC 2X.

Sumerja dos hojas de papel de filtro con tampón SSC 10X, luego coloque las hojas en el reticulante UV. Asegúrese de que el lado absorbido por el ARN esté hacia arriba, luego coloque la membrana encima del papel de filtro. Seleccione el modo de reticulación automática y presione el botón de inicio para iniciar la irradiación.

Examine la membrana y el gel con un captador de imágenes de gel UV para confirmar la transferencia de ARN del gel a la membrana. Bloquee la membrana en leche descremada al 5% en tampón TBST a temperatura ambiente durante una hora. Incubar la membrana durante la noche en una solución de anticuerpos m6A a cuatro grados centígrados.

Al día siguiente, lave la membrana tres veces con tampón TBST durante 15 minutos. A continuación, incube la membrana en la solución de anticuerpos anti-conejo conjugada de burro HRP durante una hora a temperatura ambiente. Después de una hora, lave la membrana tres veces con tampón TBST durante 15 minutos.

Aplique el sustrato de quimioluminiscencia mejorada. Capture la quimioluminiscencia con un generador de imágenes digital. Finalmente, se pasó a la cuantificación de m6A y se midió la intensidad quimioluminiscente relativa de m6A utilizando la imagen J.Se tomaron muestras de ARN de hígado de ratón a intervalos de cuatro horas y se estudiaron con la técnica de Northern blot modificada.

Se detectó claramente la metilación de ARNr, ARNm y ARN pequeños. Se realizaron transferencias representativas de m6A para el ARN total y sin ARNr de los hígados de ratones de tipo salvaje. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro días si se realiza correctamente.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la epigenética del ARN exploraran los impactos en la fisiología humana relacionados con el ritmo circadiano y la obesidad.