Name: La medición paralela de la expresión de genes circadianos del reloj y Hormona en cultivos celulares primarios humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Aprende a medir la bioluminiscencia circadiana y la secreción hormonal en células primarias humanas mediante transducción lentiviral y perifusión continua. Este método permite estudiar los ritmos celulares en tiempo real.

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Estamos muy agradecidos a nuestros colegas de la Universidad de Ginebra: Jacques Philippe de comentarios constructivos sobre este trabajo, Ueli Schibler por su inestimable ayuda con el desarrollo del sistema de perfusión y para la inspiración científica, André Liani para el haber concebido el diseño, fabricación y puesta en servicio de el sistema de perfusión, la compañía de Lesa-Technology LTD para la asistencia en el sistema de perfusión y desarrollo de software de goteo biolumicorder, George Severi para obtener ayuda con los experimentos de perfusión, Ursula Loizides-Mangold para la lectura crítica del manuscrito, y Anne-Marie Makhlouf para las preparaciones de lentivirus ; a Etienne Lefai, Stéphanie Chanon y Hubert Vidal (INSERM, Lyon) para la preparación de mioblastos humanos primarios; y para Domenico Bosco y Thierry Berney (Centro de trasplante de islotes humanos, Hospital Universitario de Ginebra) para proporcionar islotes humanos. Este trabajo fue financiado por la Fundación de Ciencia de Suiza No. Nacional de Grant 31003A_146475 / 1, el Sinergia Swiss National Science Foundation Grant N º CRSII3-154405, Fondation Romande para la Investigación sobre la Diabetes, en Fundación Bo Hjelt, Fundación Ernst y Lucie Schmidheiny, y Société Académique de Genève (CD).

Declaración de la ética: Manipulaciones incluidas en este protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Universitario de Ginebra y por el Comité Ético SUD EST IV (Acuerdo 12/111) 19. Islotes humanos se aislaron a partir de páncreas de donantes múltiples órganos con muerte cerebral en el Centro de Trasplante de islotes en el Hospital Universitario de Ginebra (Suiza) como se ha descrito por nosotros en las referencias 16,18, u obtenida de una fuente comercial. 1. Preparación del cultivo de células primarias <ol><li> Aislamiento humanos islote pancreático, disociación y Cultura NOTA: Capa cada tubo, punta de plástico o una pipeta con Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) medio con el fin de evitar islotes o células de los islotes se pegue a la superficie de plástico, que puede conducir a una pérdida significativa de material celular. <ol><li> Un día antes de la disociación celular de los islotes añadir 1 ml de matriz extracelular laminina-5-rica (derivado de las células 804G como descricama en la referencia 29) por 3,5 cm plato. Antes de placas células, aspirar la matriz y se lava el plato 3 veces con agua bi-destilada estéril. Dejar que la cápsula se seque bajo la cabina de flujo laminar durante 5 min. </li><li> Dentro de la cabina de flujo laminar, distribuir los islotes obtenidos con medio CMRL en 15 tubo (s) ml. Centrifugar a 272 g durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante, y luego volver a suspender el sedimento en 1 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) previamente calentada a 37 ° C sin calcio y magnesio. Centrifugar a 272 g durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 1 ml de DPBS. </li><li> Para contar el número total de islotes, de pipeta 10 l de la suspensión de islotes 1 ml en un nuevo plato 3,5 cm. Contar el número de islotes en la caída de 10 l bajo el microscopio y de esta calcular el número total de islotes en la suspensión de islotes 1 ml. Añadir 14 ml de DPBS y centrifugar la suspensión celular una mástiempo en 272 xg durante 5 min. </li><li> Para la disociación de células de islote, aspirar el sobrenadante y añadir 1 ml de solución de desprendimiento de las células durante un máximo de 1,000 equivalentes de islotes (IEQ). Se coloca el tubo en un baño de agua a 37 ° C y mezclar suavemente los islotes pipeteando arriba y abajo varias veces cada minuto, durante 6-10 minutos. NOTA: Para verificar la calidad de la digestión, pipetear una caída de 2 l de suspensión en un portaobjetos de vidrio y se les presentarán bajo el microscopio que todas las células están bien separadas, y que no hay dobletes o grupos de células se han mantenido. </li><li> Detener la reacción mediante la adición de 14 ml de CMRL frío con suplementos (10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% de penicilina-estreptomicina (P / S), 1% de gentamicina, 1 piruvato de sodio%). Centrifugar a 425 g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y añadir 15 ml de medio CMRL al sedimento celular. </li><li> Resuspender el precipitado en un pequeño volumen de CMRL con suplementos. Contar el número de células en el microscopio utilizando una hemocytometro, ajustar el volumen CMRL con el fin de obtener una concentración de células de ~ 650, 000 células / ml. </li><li> Pipetear 3 separa gotas de 100 l cada una de la suspensión celular dispersada obtenida en la etapa 1.1.8 en una placa de 3,5 cm pre-recubiertas con laminina. NOTA: Las células se adhieren al plato en aproximadamente 24 horas. </li><li> Se incuban las células (Figura 1A) en un incubador de cultivo de tejidos a 37 ° C en una cámara húmeda. Cambiar el medio de la célula gotas cada 2-3 días por aspiración de 100 l de cada gota y su sustitución por el mismo volumen de medio fresco. </li></ol></li><li> Primaria humana mioblastos cultura y diferenciación en miotubos <ol><li> biopsia de tejido, el aislamiento de células satélite y la cultura de mioblastos Nota: Las biopsias musculares se obtuvieron del grupo de Etienne Lefai (INSERM, Lyon, Francia) 19. <ol><li> Purificar mioblastos esqueléticos primaria de acuerdo con el procedimiento anteriormente descrito 30. </li></ol></li><li> diferenciando pmioblastos en miotubos humanos rimary <ol><li> Tomar un vial (1 x 10 6 células) de mioblastos humanos almacenados en nitrógeno líquido y descongelar las células rápidamente poniendo el vial durante 30 segundos a 1 minuto en un baño de agua a 37 ° C con agitación. </li><li> células de pipeta (1 ml) en 24 ml de medio de crecimiento compuestas de HAM F-10 suplementado con 20% FBS, 1% P / S, 0,5% de gentamicina y 0,2% de anfotericina B. </li><li> Centrifugar 5 min a 150 x g. </li><li> Eliminar las células sobrenadante y resuspender con 15 ml de medio de crecimiento fresco por 2,5 x 10 5 células. </li><li> Placa de al menos 2,5 x 10 5 células por matraz F75 adherente. Mantener los mioblastos en un incubador de células a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Una vez que las células alcanzan 60-80% de confluencia, se disocian las células con tripsina-EDTA al 0,05% durante 1-2 minutos y la placa en 2 ml de medio de crecimiento sobre platos adherentes 3,5 cm de Petri. </li><li> Después de alcanzar la confluencia, se elimina el medio de crecimiento. </li><li> Iniciar el proto diferenciacióncol de mioblastos humanos en miotubos cultivando en 2 ml de de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene 1 g / L de glucosa, 2% de FBS, 1% P / S, 0,5% de gentamicina y 0,2% de anfotericina B (medio de diferenciación) en un incubador de células a 37 ° C y 5% de CO 2. Cambiar el medio cada 2 a 3 días. NOTA: Myotubes se forman generalmente dentro de 7-10 días. </li><li> Consultar la diferenciación de células de músculo bajo el microscopio (figura 2A) mediante la observación de la fusión de mioblastos en miotubos polinucleadas 19. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. pequeños ARN de interferencia (siRNA) Transfección <ol><li> siRNA transfección de células de islotes humanos NOTA: El protocolo de transfección se realiza en gotas de 100 l en el día siguiente, después de disociación de células (pasos 1.1.1-1.1.10). <ol><li> Aspirado de 100 l de medio CMRL de cada gota y reemplazarlo con el mismo volumen de suero libre de medio esencial mínimo (MEM) 2 hantes de la transfección mediante pipeteo. </li><li> Prepare una mezcla a base de MEM de reactivo de transfección y 50 nM de objetivo siRNA (Siclock) o 50 nM de no director siCONTROL de acuerdo con las instrucciones del fabricante. <ol><li> Por un plato con 3 gotas preparar dos tubos de 1,5 ml con 200 l de MEM cada uno. </li><li> Añadir a uno de estos tubos de 4 l de reactivo de transfección. </li><li> Añadir a la segunda tubo de 1 l de la solución de siRNA de la correspondiente (20 M). </li><li> Agitar estos dos tubos lentamente en el agitador orbital durante 5 min y luego mezclar el contenido de los tubos juntos y agitar durante 20 min más. </li></ol></li><li> Aspirar 100 l de MEM de cada gota y reemplazarlo con el mismo volumen de mezcla de transfección obtenida en el paso anterior con la pipeta. </li><li> Vuelva a colocar la solución de transfección con medio CMRL después de 4 horas de incubación a 37 ° C. Repita los pasos 2.1.1-2.1.3 al día siguiente para celular re-transfección. </li></ol></li><li> siRNA transfección de miotubos humanos <ol><li> Antes de la transfección, sustituir el medio (véase la etapa 1.2.2.8) con 2 ml de medio de diferenciación fresca por 3,5 cm plato petri. </li><li> En un tubo estéril de 1,5 ml, preparar una mezcla de 20 nM siRNA (siCONTROL o Siclock), que corresponde a 2,4 l de una solución 20 mM siRNA, y 12 l de reactivo de transfección diluidos en 100 l de medio de diferenciación. Incubar la solución a temperatura ambiente durante 15 min con agitación suave. </li><li> Transfectar células con 114,4 l de la mezcla de siRNA por 3,5 cm células plato de petri y lugar en un incubador de cultivo de tejidos a 37 ° C y CO 2 durante 24 horas al 5%. </li></ol></li></ol> 3. continuo a largo plazo circadiano bioluminiscencia de grabación a cabo en paralelo con la Evaluación de la secreción de la hormona en las células vivas humanas primarias <ol><li> La introducción circadianos Los reporteros de bioluminiscencia en células humanas primarias porLa transducción lentiviral NOTA: Todos los procedimientos con partículas de lentivirus se deben realizar en una instalación de bioseguridad de nivel 2 para tomar precauciones adicionales para el trabajo con los agentes que representan un peligro potencial moderado para el personal y el medio ambiente. <ol><li> Preparar partículas reportero lentivirales por co-transfección del vector de pLenti6.4 interés / R4R2 / V5-DEST / Bmal1-luc o pLV156-Per2-dLuc (llamado Bmal1-luc y Per2-luc, respectivamente,) plásmido 31 con vectores lentivirales pMD2G y pspax en células 293T utilizando el método de polietilenimina (para el procedimiento detallado véase la referencia 16). </li><li> Valorar las partículas lentivirales obtenidos (detalles en la valoración se pueden obtener en http://lentilab.unige.ch/). Para otros experimentos, utilizar lentivirus con títulos que van 10 4 a 10 5 unidades de transducción [TU / l]. </li><li> Coloque los platos con células de islotes humanos o mioblastos humanos (en el 30-50% de confluencia) en el interior de la cabina de flujo laminaret y reemplazar el medio con 2 ml de medio CMRL suplementado fresco (ver paso 1.1.7) o medio de crecimiento (véase la etapa 1.2.2.2), respectivamente. </li><li> Calcular la multiplicidad de infección (MOI) (es decir, partículas infecciosas (unidades de transducción) / número de células). </li><li> Transducir el cultivo de células primarias pipeteando solución lentivirus para el plato con el fin de obtener una MOI = 3 (por ejemplo, para 65.000 células unidas añaden 3 l de la solución de virus con el título de 6,5 x 10 4-100 gota l de medio). </li><li> Incubar toda la noche en una incubadora de cultivo de tejidos. Cambio de medio el día siguiente. NOTA: transducir células de los islotes humanos al menos 4 días antes de la grabación de bioluminiscencia con el fin de lograr la expresión suficiente de la construcción indicadora. Los mioblastos se transdujeron durante la fase de expansión, entonces crecer hasta confluencia, y posteriormente se diferenciaron en miotubos. </li></ol></li><li> In Vitro La sincronización de las células humanas primarias <ol> &lt;li&gt; Añadir 10 M de ciclasa activador de ciclasa en 2 ml de medio por 3,5 cm plato de Petri que contiene las células primarias transducidas con anterioridad en el paso 3.1.5. </li><li> Incubar durante 60 min a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular. </li><li> Cambiar el medio que contiene el activador de la adenilato ciclasa con 2,5 ml del medio de grabación que contiene 100 mM de luciferina. NOTA: Para utilizar células de los islotes humanos CMRL suplementado con 10% de FBS, 1% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% P / S, el 1% de gentamicina; para miotubos humanos usan rojo de fenol - DMEM libre con 1 g / l de glucosa suplementado con 2% de FBS, 2% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% P / S, 0,5% de gentamicina y 0,2% de anfotericina B. </li></ol></li></ol> 4. Evaluación paralela de bioluminiscencia circadiano de grabación y Hormona perfiles en células sincronizadas humana secretora primarias <ol><li> Configuración de largo plazo perifusion constante y la bioluminiscencia de Grabación en células humanas primarias. NOTA: Cuando outs de trabajoide la campana de flujo laminar, limpiar todas las superficies de contacto y limitar la exposición de las culturas o medio para el aire para evitar la contaminación. <ol><li> Para preparar el medio de perfusión, añadir 100 mM de luciferina al medio. NOTA: Para utilizar células de los islotes humanos CMRL suplementado con 10% de FBS, 1% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% P / S, el 1% de gentamicina; para miotubos humanos usan rojo de fenol - DMEM libre con 1 g / l de glucosa suplementado con 2% de FBS, 2% de L-alanil-L-glutamina dipéptido, 1% P / S, 0,5% de gentamicina y 0,2% de anfotericina B. </li><li> Dentro de la cabina de flujo laminar, abrir los 3,5 cm platos que contienen los cultivos transducidos, transfectadas y sincronizados primarios de células (células de los islotes o miotubos) como se ha descrito anteriormente. Insertar tapas metálicas estériles (desarrollados en casa) (Figura 1B2) en los platos de 3,5 cm que están equipadas con afluencia de silicona / tubos de flujo de salida de conexión (Figura 1B1 / B5). </li><li> Colocar los recipientes en la plataforma de medición en el 37 ° C light estanca incubadora. Fijar los platos a la plataforma mediante el uso de un adaptador atornillable (Figura 1B3). Introducir los tubos de afluencia / flujo de salida del sistema de perifusion en los tubos de silicona apropiados de la tapa (Figura 1B1 / B5) y ajustar la velocidad de la bomba a una velocidad de flujo de ~ 0,5 ml de medio por 1 hr. </li><li> Abra el software de goteo biolumicorder de desarrollo propio que registra las señales del detector de tubo fotomultiplicador (PMT). Elegir el directorio donde se almacenarán y comienzan bioluminiscencia continua la grabación desde cada plato haciendo clic en el icono &quot;Inicio&quot; los datos. NOTA: Como alternativa al software Drip-biolumicorder, otros programas (por ejemplo LumiCycle), se pueden utilizar para grabar señales de detector PMT. </li><li> Colocar las placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos estériles en la colecta en hielo. </li><li> Abra el software de control que controla la sincronización del interruptor automático entre los pocillos de recogida. Configurar el tiempo window de la recogida de medio (seg). Iniciar la recogida del medio de salida de cada 4 horas (14.400 segundos; ~ 2 ml por punto de tiempo) haciendo clic en el icono &quot;run&quot;. </li><li> Transferir y medir el medio de salida de cada colección bien en recipientes estériles de tubos de 2 ml con la pipeta. Mantenga tubos en un congelador a -20ºC antes de comenzar el siguiente paso. Repita los pasos 4.1.5-4.1.6 cada 24 horas. </li><li> Detener la grabación bioluminiscencia y el flujo del medio haciendo clic en el icono de &quot;stop&quot; en el software correspondiente. Retire las tapas metálicas y aspirar el medio residual de los platos. </li><li> Con el fin de normalizar los valores de proteínas secretadas obtenidos en diferentes experimentos, o bien extraer el ADN (normalización por el contenido de ADN genómico para miotubos 19), o añadir 1 ml de tampón de lisis ácido-etanol (normalización del contenido total de la hormona para las células de los islotes 18) a la platos. </li></ol></li></ol> 5. Medición de los Niveles hormonales Islet y Myokine en el flujo de salidaSe obtiene por medio de perfusión continua de células humanas endocrino primario <ol><li> Insulina <ol><li> Cuantificar los niveles de insulina basales en el medio de salida de puntos de tiempo recogidos por el uso de un kit de insulina humana ligado a enzima ensayo inmunoenzimático (ELISA) siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Normalizar los datos para el volumen absoluto de medio recogido en cada pocillo y para el contenido total de insulina, extraído de células tratadas con ácido-etanol al final del experimento (etapa 4.1.9) 18. </li></ol></li><li> La interleucina-6 (IL-6) <ol><li> Cuantificar basales de IL-6 en el medio de salida desde los puntos temporales recogidos mediante el uso de un IL-6 humana kit ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Normalizar los datos para el volumen absoluto de medio recogido en cada pocillo y para el contenido de ADN genómico en el final del experimento (etapa 4.1.9). </li></ol></li></ol> 6. Los análisis del conjunto de datos circadianos para Bioluminescencia y Hormona Perfiles <ol><li> Análisis bioluminiscencia <ol><li> Analizar el perfil de bioluminiscencia utilizando el software suministrado 19. </li></ol></li><li> Análisis de ciclo JTK <ol><li> Analizar los perfiles de secreción de hormonas y registrar los resultados de bioluminiscencia utilizando el algoritmo JTK_CYCLE 32. </li><li> Establecer el ancho período circadiano a 20-24 h. NOTA: En caso de que se registraron las condiciones experimentales en paralelo, un análisis estadístico de dos puede llevar a cabo para comparar los experimentos. </li></ol></li><li> Análisis CosinorJ <ol><li> Por otra parte, analizar la secreción de hormonas y perfiles circadianos bioluminiscencia utilizando el software de CosinorJ 28. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los parámetros experimentales descritos aquí se componen de entrega lentiviral de reporteros de bioluminiscencia circadianos en células humanas primarias cultivadas, seguido de la posterior sincronización in vitro y el registro continuo de la bioluminiscencia durante varios días, y el análisis paralelo de la secreción de hormona por las mismas células. Representan un enfoque eficaz para explorar los mecanismos moleculares y los aspectos funcionales de los relojes circadianos en células humanas primarias. <p...

El sistema de sincronización circadiano (del latín &quot;circa diem&quot;) se ha convertido en todos los organismos sensibles a la luz, como un mecanismo de adaptación a la rotación de la Tierra. En los mamíferos, está organizado de una manera jerárquica, que abarca el reloj central, que está situado en el núcleo supraquiasmático del hipotálamo ventral, y periférica (o esclavo) osciladores que son operativos en diferentes órganos. Además, estas células osciladores autónomas autosostenidas son funcionales en casi todas las células del cuerpo 1. Fóticos señales representan una señal de sincronización dominante (Zeitgeber) de las neuronas del SCN, mientras que las señales neurales y humorales que emanan del SCN reajustar los relojes periféricos. Se incrementan los ritmos de descanso-actividad, que impulsan en ciclos de alimentación-ayuno a su vez, son otros sincronizadores para relojes periféricos 2. De acuerdo con nuestro conocimiento actual, la composición molecular del reloj central se basa en la transcripción y translabucles de retroalimentación cionales, que se conservan entre los organismos. Esto comprende los activadores de la transcripción BMAL1 y el reloj, que en conjunto activan la transcripción de los genes negativos de reloj de núcleo PER y llorar. Los altos niveles de PER y proteínas Cry inhibirán su propia transcripción a través de la inhibición del complejo / RELOJ BMAL1. Un bucle auxiliar consta de los receptores nucleares REV-ERB y Rors, que también regulan la transcripción de BMAL1 y el reloj. Por otra parte, los acontecimientos posteriores a la traducción, incluyendo la fosforilación, sumoylation, acetilación, O-GlcNAcylation, la degradación y la entrada en el núcleo de las proteínas del reloj del núcleo representan una capa adicional reguladora importante en el establecimiento del ciclo de oscilación de 24 horas 3. La acumulación de pruebas se deriva de estudios en modelos de roedores y pone de relieve el papel fundamental del sistema circadiano en la coordinación de las funciones metabólicas y endocrinas 4-5. Un número de large-escala de análisis del transcriptoma indican que la alimentación - ayuno ciclos juegan un papel central en la sincronización de osciladores periféricos 6-8. En un acuerdo con estos estudios, el análisis metabolomic y lipidomic en roedores y seres humanos han revelado que un gran número de metabolitos oscile en el tejido, plasma, saliva y de una manera circadiano 9-11. Es importante destacar que, la mayoría de las hormonas exhiben ritmos circadianos en 5,12-13 sangre. Por otra parte, los relojes circadianos de la correspondiente hormona que produce el tejido periférico podrían regular la secreción de la hormona localmente. Osciladores circadianos células autónomas se han descrito en roedores y células de los islotes pancreáticos humanos 14-16. Estos osciladores juegan un papel esencial en la regulación del transcriptoma de los islotes pancreáticos y la función 15,17-18. Por otra parte, la secreción Myokine por miotubos esqueléticos humanos se ha demostrado recientemente para exhibir un patrón circadiano, que está regulada por oscillato de células autónomasrs operativos en estas células 19. Varios enfoques para el estudio de los ritmos circadianos en los seres humanos in vivo se han usado ampliamente. Por ejemplo, la melatonina plasma o los niveles de cortisol, así como temperatura de la superficie de la piel torácica (revisado en referencias 3,20) han sido estudiados para evaluar los relojes circadianos endógenos. Aunque estos métodos permiten el estudio de las oscilaciones circadianas sistémicos en vivo, que están lejos de proporcionar una evaluación fiable de los ritmos circadianos autónomos de funcionamiento libre en diferentes órganos y tejidos. Sin embargo, como la disección de la regulación sistémica sería una herramienta indispensable para la comprensión de los efectos específicos de los relojes moleculares intracelulares de la función de estas células. Por lo tanto, se ha realizado un esfuerzo considerable para desarrollar enfoques fiables para el estudio de los relojes humanos en cultivos celulares inmortalizadas o primarios sincronizados in vitro. Es importante destacar que se ha demostrado quecaracterísticas de reloj medidos en células de fibroblastos de piel cultivados primaria reflejan estrechamente las propiedades del reloj individuales de todo el organismo 21. El desarrollo de los reporteros fluorescentes y bioluminiscentes circadianos ha avanzado en gran medida este enfoque 22-27. Por otra parte, el estudio de los relojes de células primarias que se derivan de diferentes órganos periféricos permite la investigación de las propiedades moleculares de los relojes específicos de tejidos humanos 3,5,16,19-20,28. Por lo tanto, la evaluación de los relojes circadianos en in vitro de explantes o células primarias sincronizados, mediante el uso de los reporteros bioluminiscentes, representa un método muy útil para estudiar la composición molecular de los relojes periféricos humanos y su impacto en la función del órgano. En este artículo, presentaremos los protocolos detallados para la evaluación de la expresión de genes circadianos en las células de los islotes primaria y el músculo esquelético humano sincronizados in vitro, así como el impacto de reloj celular autónomala interrupción de la función secretora de estas células.

<table><tbody><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td>Para biopsia muscular Digestión</td></tr><tr><td>DPBS sin calcio sin magnesio</td><td>Invitrogen</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>HAM F-10</td><td>Invitrogen</td><td>41550-021</td><td>Para cultivo de mioblastos</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10270</td><td>Complemento al medio de cultivo</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P0781-100</td><td>Complemento del medio de cultivo</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Axon&nbsp;</td><td>A1492.0001</td><td>Suplemento al medio</td></tr><tr><td>de cultivo Fungizone</td><td>Invitrogen</td><td>15290-026</td><td>Anfotericina B, suplemento al medio</td></tr><tr><td>de cultivo DMEM 1g/L glucosa + piruvato de Na + glutamax&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>21885-025</td><td>Para cultivo de miotubos</td></tr><tr><td>DMEM 1g/L glucosa -Na Piruvato - glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>11880-028</td><td>Medio de registro para LumiCycle</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-028</td><td>L-alanil-L-glutamina dipéptido, complemento del medio de grabación</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT-104</td><td>Solución de desprendimiento de células, para la disociación de células de islotes</td></tr><tr><td>CMRL</td><td>Gibco</td><td>21530-027</td><td>Medio de cultivo para células de islotes</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td>Complemento del medio de cultivo</td></tr><tr><td>15 ml Tubo cónico de polipropileno de alta claridad Falcon</td><td></td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>matraz F75</td><td>BD Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri de 3,5 cm&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Foskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886</td><td>Activador de adenilil ciclasa, utilizado para la sincronización</td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Prolume LTD</td><td>260150</td><td>Complemento al medio de grabación</td></tr><tr><td>OptiMEM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>51985-026</td><td>Medio esencial mínimo (MEM) sin suero utilizado para la transfección de células de islotes humanos</td></tr><tr><td>Reactivo Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td>Reactivo de transfección</td></tr><tr><td>HiPerFect Reactivo</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td>Reactivo de transfección</td></tr><tr><td>ON-TARGET plus siCLOCK smartpool&nbsp;</td><td>Dharmacon</td><td>L-008212-00</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl)</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-01</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de pañuelos&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Para miotubos de extracción de ADN</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Para la extracción de ARN de miotubos</td></tr><tr><td>QIAshredder&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>Para miotubos Extracción de ARN</td></tr><tr><td>2 ml tubos colectores</td><td>Axygen</td><td>311-10-051</td><td>Para recoger el medio con la perifusión</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos, 6 pocillos</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td>353046</td><td>Para recoger el medio con el</td></tr><tr><td>kit de perifusión RNeasy Plus Micro&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td>Para la extracción de ARN de islotes</td></tr><tr><td>IL-6 humano Kit ELISA instantáneo&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>88-7066-22</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Insulina Humana Mercodia</td><td>Mercodia</td><td>10-1113-01</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico, min,37%,p.a.</td><td>Acros organics</td><td>124630010</td><td>Utilizado para la preparación de tampón de lisis (375 ml Etanol + 7,5%HCl + 117,5% H2O)</td></tr><tr><td>Etanol (>99,8%)</td><td>Fluka Analytical</td><td>02860-1L</td><td>Utilizado para la preparación de tampón de lisis (375 ml de etanol + 7,5%HCl + 117,5% H2O)</td></tr><tr><td>Islotes humanos para laboratorios de investigación</td><td>Prodo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipo:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 1.0R Baño</td><td></td></tr><tr><td>de agua</td><td>VWR</td><td>1112A</td><td>&nbsp; a 37 &deg; </td></tr><tr><td>Campana de cultivo C Tissu</td><td>Faster&nbsp;</td><td>Incubadora de cultivo SafeFastElite</td><td></td></tr><tr><td>Tissu</td><td>Heraeus</td><td>HeraCell 150</td><td>5% CO2 a 37 &deg; C, sin agua debido a la instalación de LumiCycle</td></tr><tr><td>Incubadora de cultivo Tissu</td><td>Heraeus</td><td>HeraCell 150</td><td>5% CO2 a 37 &deg; C, sin agua debido a la instalación de LumiCycle</td></tr><tr><td>Incubadora de cultivo Tissu</td><td>Thermo Scientific</td><td>Hera Cell 150i</td><td>5% CO2 a 37 & grados; C</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Heidolph Instruments</td><td>Unimax 1010</td><td>Para la agitación de la mezcla de siRNA</td></tr><tr><td>LumiCycle</td><td>Actimetrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LumiCycle software</td><td>Actimetrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CosinorJ software</td><td>EPFL</td><td></td><td>Disponible gratuitamente en: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/</td></tr> <tr><td>Rheodyne titan MX&nbsp;</td><td>ERC GmbH</td><td></td><td>Software de control que controla la temporización del interruptor automático</td></tr></tbody></table>

la medición paralela de la expresión de genes circadianos del reloj y hormona en cultivos celulares primarios humanos

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Los relojes circadianos son funcionales en todos los organismos sensibles a la luz, lo que permite una adaptación al mundo exterior mediante la previsión de los cambios ambientales diarios. considerables progresos en la comprensión de la estrecha conexión entre el reloj circadiano y la mayoría de los aspectos de la fisiología se ha hecho en el campo durante la última década. Sin embargo, desentrañar la base molecular que subyace a la función del oscilador circadiano en los seres humanos se mantiene más alta de desafío técnico. A continuación, ofrecemos una descripción detallada de un enfoque experimental para el largo plazo (2-5 días) de grabación de bioluminiscencia y la recogida de medio de salida en células primarias humanas cultivadas. Para este propósito, hemos transducidas células primarias con un indicador de luciferasa lentiviral que está bajo control de un promotor del gen de reloj del núcleo, lo que permite la evaluación paralela de la secreción de la hormona y la bioluminiscencia circadiano. Además, se describen las condiciones para interrumpir el reloj circadiano en primary células humanas mediante la transfección de siRNA RELOJ de orientación. Nuestros resultados en la regulación circadiana de la secreción de insulina por los islotes pancreáticos humanos, y Myokine secreción de las células del músculo esquelético humanos, se presentan aquí para ilustrar la aplicación de esta metodología. Estos ajustes se pueden utilizar para estudiar la composición molecular de los relojes periféricos humanos y analizar su impacto funcional en las células primarias en condiciones fisiológicas o fisiopatológicas.

La evaluación de los islotes con Hormona paralelo circadiano bioluminiscencia de grabación a partir de células de islotes humanos Perifused Después de proporcionar una primera caracterización molecular del reloj circadiano, operativo en las células de los islotes humanos 16, que apunta a estudiar el impacto de la interrupción del reloj en función de los islotes y la transcripción 18. Hemos creado un proto...

Aquí, describimos los ajustes para monitorear en paralelo la bioluminiscencia circadiana y la actividad secretora de las células de los islotes humanos y los miotubos primarios. Para ello, empleamos la administración de genes lentivirales de un indicador de reloj central de luciferasa, seguido de sincronización in vitro y recolección del medio de salida por perifusión celular continua.

La medición paralela de la expresión de genes circadianos del reloj y Hormona en cultivos celulares primarios humanos

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

El objetivo general de este procedimiento es la evaluación paralela de la bioluminiscencia circadiana y la actividad secretora de células endocrinas humanas primarias cultivadas y sincronizadas in vitro. Este método puede ayudar a investigar el patrón temporal de la secreción celular y cómo puede estar regulado por relojes circadianos autónomos de la célula. La principal ventaja de esta técnica es que permite monitorear la luciferina circadiana como actividad reportera y, simultáneamente, recolectar el medio de salida para medir los niveles de hormonas y miocinas secretadas. Para introducir reporteros de bioluminiscencia circadiana en células primarias mediante transducción lentiviral, primero transfiera las placas de Petri de 3,5 cm que contienen mioblastos humanos con una confluencia del 30 % al 50 % a una cabina de flujo laminar. Reemplace el medio de mioblastos humanos con 2 mL de medio de crecimiento. Luego, transduzca el cultivo de células primarias pipeteando la solución de lentivirus en la placa para obtener una multiplicidad de infección igual a tres. Incube las células durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos. Cambie el medio al día siguiente. Para lograr la sincronización in vitro, agregue 10 micromolar de activador de adenilil ciclasa en 2 mL de medio por placa de Petri de 3,5 cm que contenga las células primarias previamente transfectadas. Incube las células durante 60 minutos a 37 °C.

parallel-measurement-circadian-clock-gene-expression-hormone

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

El procedimiento de preparación de cortes que contiene el ratón adulto núcleo supraquiasmático del hipotálamo (NSQ), y de una manera rápida a la cultura del tejido SCN en condiciones de cultivo organotípico, se informó. Además, la medición de la expresión de la proteína del gen del reloj oscilatorio utilizando la tecnología dinámica de luciferasa se describe.

Preparación Cortar, cultivo de tejidos organotípicos y grabación de la actividad luciferasa de reloj de genes en el núcleo supraquiasmático

Los relojes circadianos funcionar dentro de las células individuales, es decir, son células autónomas. A continuación, se describen los métodos para la generación de células autónomas modelos de reloj de forma no invasiva, luciferasa tiempo real basado en la tecnología de bioluminiscencia. Células Reporter proporcionar sistemas manejables, modelo funcional para el estudio de la biología circadiana.

Monitoreo de células autónomas Ritmos reloj circadiano de expresión génica utilizando luciferase reporteros Bioluminiscencia

El reloj circadiano regula alrededor de un tercio del transcriptoma de Arabidopsis, pero el porcentaje de genes que se alimentan de nuevo en la hora normal permanece desconocida. Aquí visualizamos un método para evaluar rápidamente los fenotipos circadianos en cualquier línea mutante de Arabidopsis utilizando imágenes luminiscentes de un reportero circadiano transitoriamente expresada en protoplastos.

Análisis rápido de los fenotipos circadianos en Arabidopsis protoplastos transfectadas con un reloj luminiscentes Reportero

Se presenta un ensayo de bioluminiscencia en vitro para determinar del ritmo circadiano celular en células epiteliales mamarias. Este método utiliza plásmidos de reportero de células de mamífero expresando desestabilizada luciferasa bajo el control del promotor del gen de periodo 2 . Puede ser adaptado a otros tipos de células para evaluar efectos de órgano-específicas en el ritmo circadiano.

In Vitro Ensayo de bioluminiscencia para la caracterización del ritmo circadiano en células epiteliales mamarias

Luciferase genéticamente codificado es un popular reportero no invasivo de la expresión génica. Uso de un automatizado luciferase longitudinal imagen optimizada de gas y temperatura grabadora (cocodrilo) permite la grabación longitudinal de células bioluminiscentes bajo una amplia gama de condiciones. Aquí mostramos cómo cocodrilo puede utilizarse en el contexto de la investigación de los ritmos circadianos.

Medida flexible de reporteros bioluminiscentes con un automatizado Luciferase Longitudinal imagen optimizada de Gas y temperatura grabadora (cocodrilo)

Esta nueva tecnología basada en la fluorescencia permite la monitorización a largo plazo de la transcripción de los genes del reloj circadiano en el núcleo supraquiasmático (SCN) de mover libremente ratones en tiempo real y con una alta resolución temporal.

En Vivo Control de la expresión de genes del reloj circadiano en el núcleo supraquiasmático de ratón usando fluorescencia Reporteros

Este protocolo describe una técnica usando esplenocitos de ratón para descubrir patrones moleculares asociados a patógenos que alteran la expresión de genes reloj molecular.

El uso de esplenocitos de ratón para evaluar la influencia de patrón Molecular asociado a patógenos en la expresión de genes reloj

Aquí, presentamos un método para investigar los ritmos diurnos en el rendimiento después de la categorización precisa de los participantes en grupos de fenotipos circadianos basados en el Cuestionario ChronoType de Múnich, biomarcadores de fase circadiana estándar de oro y medidas actigráficas.

Fenotipado circadiano humano y pruebas de rendimiento diurno en el mundo real

Los ritmos circadianos, que existen en la mayoría de los organismos, regulan la organización temporal de los procesos biológicos. Los organoides 3D han surgido recientemente como un modelo in vitro fisiológicamente relevante. Este protocolo describe el uso de reporteros bioluminiscentes para observar los ritmos circadianos en organoides, lo que permite investigaciones in vitro de los ritmos circadianos en sistemas multicelulares.

Monitorización de las oscilaciones circadianas con un indicador de bioluminiscencia en organoides

Este informe describe un método que involucra un script R en el software de código abierto RStudio para analizar conjuntos de datos a gran escala obtenidos de experimentos de series temporales.

Un análisis R potente y fácil de usar de conjuntos de datos a gran escala

Aprende a medir la bioluminiscencia circadiana y la secreción hormonal en células primarias humanas mediante transducción lentiviral y perifusión continua. Este método permite estudiar los ritmos celulares en tiempo real.

La medición paralela de la expresión de genes circadianos del reloj y Hormona en cultivos celulares primarios humanos

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