La medición paralela de la expresión de genes circadianos del reloj y Hormona en cultivos celulares primarios humanos
11 de noviembre de 2016
Aquí, describimos los ajustes para monitorear en paralelo la bioluminiscencia circadiana y la actividad secretora de las células de los islotes humanos y los miotubos primarios. Para ello, empleamos la administración de genes lentivirales de un indicador de reloj central de luciferasa, seguido de sincronización in vitro y recolección del medio de salida por perifusión celular continua.
El objetivo general de este procedimiento es la evaluación paralela de la bioluminiscencia circadiana y la actividad secretora de células endocrinas primarias humanas cultivadas y sincronizadas in vitro. Este método puede ayudar a investigar el patrón temporal de la secreción celular y cómo puede ser regulada por relojes circadianos autónomos de las células. La principal ventaja de esta técnica es que nos permite monitorizar las luciferinas circadianas como actividad reportera y, al mismo tiempo, recoger el medio de salida para medir los niveles de hormonas secretadas y mioquinas. Para introducir los reporteros de bioluminiscencia circadiana en las células primarias por transducción lentiviral, primero transfiera las placas de Petri de 3,5 cm que contienen mioblastos humanos con una confluencia del 30% al 50% a una cabina de flujo laminar. Reemplace el medio de mioblasto humano con 2 mL de medio de crecimiento. A continuación, transducir el cultivo celular primario pipeteando la solución de lentivirus en la placa para obtener una multiplicidad de infección igual a tres. Incubar las células durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos. Cambie el medio al día siguiente. Para lograr la sincronización in vitro, añadir 10 micromolares de adenilil ciclasa activador en 2 mL de medio por placa de Petri de 3,5 cm que contenga las células primarias previamente transfectadas. Incubar las células durante 60 minutos a los 37
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Descripción general
Este estudio describe métodos para monitorear la bioluminiscencia circadiana junto con la actividad secretora de células de islotes humanos y miotúbulos primarios. El enfoque implica la entrega génica mediante lentivirus de un reportero de luciferasa del reloj biológico central, seguida de sincronización in vitro y perifusión continua de células para la recolección de medio.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Cronobiología
Antecedentes
- Los ritmos circadianos desempeñan un papel crucial en las funciones celulares.
- El monitoreo de la bioluminiscencia puede proporcionar información sobre la actividad celular.
- Las células de islotes humanos son vitales para la secreción de insulina.
- Los miotubos primarios son importantes para estudiar la fisiología muscular.
Objetivo del estudio
- Investigar la relación entre los ritmos circadianos y la actividad secretora.
- Desarrollar un método para el monitoreo en tiempo real de funciones celulares.
- Mejorar la comprensión de los procesos metabólicos en células humanas.
Métodos Utilizados
- Entrega génica mediante lentivirus para la expresión del reportero luciferasa.
- Sincronización in vitro de cultivos celulares.
- Perfusión continua para la recolección de medio.
- Medición de bioluminiscencia para evaluar ritmos circadianos.
Resultados principales
- Monitoreo exitoso de la bioluminiscencia circadiana en células de islotes humanos.
- Actividad secretora demostrada en miotúbulos primarios.
- Establecimiento de un método confiable para estudiar los ritmos celulares.
- Proporcionó información sobre la interacción entre la biología circadiana y la función celular.
Conclusiones
- El estudio ofrece un enfoque novedoso para monitorear actividades celulares en tiempo real.
- Los hallazgos contribuyen a la comprensión de las influencias circadianas sobre el metabolismo.
- Aplicaciones potenciales en la investigación de la diabetes y la fisiología muscular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La medición paralela de la expresión de genes del reloj circadiano y la secreción hormonal en cultivos primarios de células humanas permite una interrogación directa de la regulación temporal en los sistemas endocrino y muscular humanos. Este enfoque mejora la confianza predictiva en la validación de dianas al vincular osciladores circadianos moleculares con salidas funcionales de secreción. La integración de estas mediciones en la etapa de descubrimiento apoya el avance ajustado al riesgo de programas metabólicos y de cronobiología en todo el portafolio.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la reducción de riesgos mecanicistas mediante la correlación de la actividad de los genes reloj con la secreción de hormonas y miocinas en células humanas primarias.
- Apoya la validación funcional de dianas al interrumpir los genes reloj principales y cuantificar los efectos secretorios descendentes.
- Facilita la confianza predictiva en la selección de vías para dianas metabólicas y endocrinas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Establece sistemas validados y sincronizados de células primarias para el desarrollo robusto de ensayos.
- Proporciona lecturas cuantitativas y resueltas en el tiempo tanto de la expresión génica como de la actividad secretora.
- Permite la evaluación reproducible de los efectos de perturbaciones por compuestos o genéticas sobre salidas reguladas por ritmo circadiano.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Correlaciona hallazgos in vitro con la fisiología humana relevante para la enfermedad mediante el uso de células primarias de islotes y músculo.
- Apoya el descubrimiento de biomarcadores traslacionales al vincular la alteración del reloj molecular con fenotipos funcionales de secreción.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica en investigaciones de metabolismo y cronobiología.
Integración de la Línea de Procesamiento y Flujo de Trabajo
Este método conecta el descubrimiento inicial y la investigación preclínica al permitir la verificación de hipótesis sobre la regulación circadiana en células primarias humanas, apoyando tanto la validación de dianas como la continuidad traslacional.
- Biología del Descubrimiento: Permite la evaluación directa de la función de genes circadianos y su impacto en las vías secretoras.
- Selección: Proporciona modelos celulares primarios sincronizados y listos para ensayos, con resultados cuantitativos para la evaluación de compuestos.
- Análisis: Genera datos de bioluminiscencia y secreción resueltos en el tiempo para comparaciones estadísticas sólidas entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta la alteración del reloj molecular con fenotipos secretorios relevantes para enfermedades en células humanas.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable para evaluar la regulación circadiana en diversos tipos celulares primarios y dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo de medición a largo plazo y en paralelo en células humanas primarias.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al vincular salidas moleculares y funcionales en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de programas de metabolismo y cronobiología.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en transducción lentiviral, cultivo de células primarias y medición de bioluminiscencia.
- Necesita acceso a sistemas de perfusión sincronizados y ensayos sensibles de hormonas/miocinas.
- Exige estandarización entre equipos para la recolección reproducible de datos de series temporales.
- Puede ser necesaria una adaptación para diferentes tipos de células primarias o puntos finales secretorios.
- Debe validarse la estabilidad del cultivo a largo plazo y del reportero para cada aplicación.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
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Title
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Continuos Long-term Circadian Bioluminescence Recording, Performed in Parallel with the Assessment of Hormone Secretion in Living Human Primary Cells
2:24
Parallel Assessment of Circadian Bioluminescence Recording and Hormone Secretion Profiles in Synchronized Human Secretory Primary Cells
4:37
Results: Evaluation of the Clock Regulation of Basal IL-6 Secretion by Human Myotubes
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Conclusion
