La medición paralela de la expresión de genes circadianos del reloj y Hormona en cultivos celulares primarios humanos
11 de noviembre de 2016
Aquí, describimos los ajustes para monitorear en paralelo la bioluminiscencia circadiana y la actividad secretora de las células de los islotes humanos y los miotubos primarios. Para ello, empleamos la administración de genes lentivirales de un indicador de reloj central de luciferasa, seguido de sincronización in vitro y recolección del medio de salida por perifusión celular continua.
El objetivo general de este procedimiento es la evaluación paralela de la bioluminiscencia circadiana y la actividad secretora de células endocrinas primarias humanas cultivadas y sincronizadas in vitro. Este método puede ayudar a investigar el patrón temporal de la secreción celular y cómo puede ser regulada por relojes circadianos autónomos de las células. La principal ventaja de esta técnica es que nos permite monitorizar las luciferinas circadianas como actividad reportera y, al mismo tiempo, recoger el medio de salida para medir los niveles de hormonas secretadas y mioquinas. Para introducir los reporteros de bioluminiscencia circadiana en las células primarias por transducción lentiviral, primero transfiera las placas de Petri de 3,5 cm que contienen mioblastos humanos con una confluencia del 30% al 50% a una cabina de flujo laminar. Reemplace el medio de mioblasto humano con 2 mL de medio de crecimiento. A continuación, transducir el cultivo celular primario pipeteando la solución de lentivirus en la placa para obtener una multiplicidad de infección igual a tres. Incubar las células durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos. Cambie el medio al día siguiente. Para lograr la sincronización in vitro, añadir 10 micromolares de adenilil ciclasa activador en 2 mL de medio por placa de Petri de 3,5 cm que contenga las células primarias previamente transfectadas. Incubar las células durante 60 minutos a los 37
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Descripción general
Este estudio describe métodos para monitorear la bioluminiscencia circadiana junto con la actividad secretora de células de islotes humanos y miotubos primarios. El enfoque implica la entrega génica lentiviral de un reportero del reloj central de luciferasa, seguido de sincronización in vitro y perfusión celular continua para la recolección del medio.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Cronobiología
Antecedentes
- Los ritmos circadianos juegan un papel crucial en las funciones celulares.
- El monitoreo de la bioluminiscencia puede proporcionar información sobre la actividad celular.
- Las células de islotes humanos son vitales para la secreción de insulina.
- Los miotubos primarios son importantes para el estudio de la fisiología muscular.
Propósito del estudio
- Investigar la relación entre los ritmos circadianos y la actividad secretora.
- Desarrollar un método para el monitoreo en tiempo real de las funciones celulares.
- Mejorar la comprensión de los procesos metabólicos en las células humanas.
Métodos utilizados
- Entrega génica lentiviral para la expresión del reportero de luciferasa.
- Sincronización in vitro de cultivos celulares.
- Perfusión continua para la recolección del medio.
- Medición de bioluminiscencia para evaluar los ritmos circadianos.
Principales resultados
- Monitoreo exitoso de la bioluminiscencia circadiana en células de islotes humanos.
- Actividad secretora demostrada de miotubos primarios.
- Establecimiento de un método confiable para el estudio de los ritmos celulares.
- Proporcionó información sobre la interacción entre la biología circadiana y la función celular.
Conclusiones
- El estudio ofrece un enfoque novedoso para monitorear actividades celulares en tiempo real.
- Los hallazgos contribuyen a la comprensión de las influencias circadianas en el metabolismo.
- Aplicaciones potenciales en la investigación de la diabetes y la fisiología muscular.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures enables direct interrogation of temporal regulation in human endocrine and muscle systems. This approach enhances predictive confidence in target validation by linking molecular circadian oscillators to functional secretory outputs. Integrating these measurements at the discovery stage supports risk-adjusted advancement of metabolic and chronobiology programs across the portfolio.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic de-risking by correlating clock gene activity with hormone and myokine secretion in primary human cells.
- Supports functional target validation by disrupting core clock genes and quantifying downstream secretory effects.
- Facilitates predictive confidence in pathway selection for metabolic and endocrine targets.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, synchronized primary cell systems for robust assay development.
- Delivers quantitative, time-resolved readouts of both gene expression and secretory activity.
- Enables reproducible assessment of compound or genetic perturbation effects on circadian-regulated outputs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant human physiology by using primary islet and muscle cells.
- Supports translational biomarker discovery by linking molecular clock disruption to functional secretion phenotypes.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation in metabolic and chronobiology research.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis testing of circadian regulation in human primary cells, supporting both target validation and translational continuity.
- Discovery Biology: Allows direct testing of circadian gene function and its impact on secretory pathways.
- Screening: Provides synchronized, assay-ready primary cell models with quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Generates time-resolved bioluminescence and secretion data for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Connects molecular clock perturbation to disease-relevant secretory phenotypes in human cells.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for evaluating circadian regulation across diverse primary cell types and targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes long-term, parallel measurement workflows in primary human cells.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking molecular and functional outputs in disease-relevant systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of metabolic and chronobiology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral transduction, primary cell culture, and bioluminescence measurement.
- Needs access to synchronized perifusion systems and sensitive hormone/myokine assays.
- Demands cross-team standardization for reproducible time-course data collection.
- Adaptation may be needed for different primary cell types or secretory endpoints.
- Long-term culture and reporter stability must be validated for each application.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Continuos Long-term Circadian Bioluminescence Recording, Performed in Parallel with the Assessment of Hormone Secretion in Living Human Primary Cells
2:24
Parallel Assessment of Circadian Bioluminescence Recording and Hormone Secretion Profiles in Synchronized Human Secretory Primary Cells
4:37
Results: Evaluation of the Clock Regulation of Basal IL-6 Secretion by Human Myotubes
5:33
Conclusion
