Name: El asa arteriovenosa (AV) en un modelo de pequeños animales para estudiar la angiogénesis e Ingeniería tejido vascularizado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprende a crear un asa arteriovenosa en ratas mediante microcirugía para estudiar la angiogénesis y generar tejidos vascularizados. Esta técnica permite analizar la vascularización in vivo y desarrollar tejidos trasplantables con acceso vascular inmediato.

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Nos gustaría agradecer a las siguientes instituciones por apoyar nuestra investigación bucle AV: Staedtler Stiftung, el Dr. Fritz Erler Fonds, Else Kröner Fesenius Stiftung, Baxter Healthcare GmbH, DFG, IZKF / ELAN / EFI / Oficina de Género y Diversidad, la Forschungsstiftung Medizin , Friedrich-Alexander Universidad de Erlangen-Nürnberg (FAU), Fundación AO, Manfred Roth Stiftung, Xue Hong, Fundación Hans Georg Geis, Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD), Alemania, y el Ministerio de Educación Superior e Investigación Científica, Irak. Nos gustaría dar las gracias a Stefan Fleischer, Marina Milde, Katrin Kohn y Ilse Arnold-Herberth por su excelente apoyo técnico.

El Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Friedrich-Alexander de Erlangen-Nürnberg (FAU) y el Gobierno de Franconia Media, Alemania, aprobó todos los experimentos. Para los experimentos, las ratas Lewis macho con un peso corporal de 300 - 350 g se utilizaron. 1. El modelo de bucle arteriovenosa en la rata <ol><li> Procedimiento de implantación (Figura 2) <ol><li> Para la anestesia utilizar una caja de plástico especial que está conectado a través del tubo al vaporizador de isoflurano y cerrado por una tapa. Encienda el suministro de gas y caudalímetro entre 0,8 - 1,5 l / min. </li><li> Coloque la rata en la caja de plástico inducción y sellar la parte superior. Activar el vaporizador de isoflurano al 5%. </li><li> Observe cuidadosamente la rata durante la inducción de la anestesia. Después de 3 - 4 min, se anestesió la rata. </li><li> Confirmar la anestesia adecuada: la pérdida del reflejo de enderezamiento, la pérdida del reflejo palpebral, reflejo de retirada, reflejo corneal positivo. </li><li> Retire la rata de la caja y comprobar supeso para el cálculo de las drogas. Aplicar ungüento para los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. </li><li> Administrar medicamentos para el dolor y antibióticos (por ejemplo., 7,5 mg / kg por vía subcutánea enrofloxacina (sc), 12,5 mg / kg de tramadol y 100 mg / kg metamizol tanto por vía intravenosa (iv)). Administrar cristaloides adaptada de peso durante el funcionamiento (por ejemplo., 30 ml / kg sc). </li><li> Coloque la rata en su parte posterior en una placa de calentamiento a 37 ° C bajo anestesia con 1 - 2% por inhalación de isoflurano administrado a través de la máscara. </li><li> Monitorear la anestesia adecuada y aumentar el nivel de anestesia con isoflurano si es demasiado baja (movimiento de la rata, la respuesta al dolor, el tono de la mandíbula, sin pérdida de los reflejos (véase 1.1.4.), El aumento de la frecuencia cardíaca). Tenga cuidado de no sufrir una sobredosis de isoflurano (pérdida de los reflejos corneales, alta frecuencia cardiaca, disminución de la saturación de oxígeno). Utilice una oximetría de pulso especial para pequeños animales para el control de la saturación de oxígeno (95-100%) y la frecuencia cardíaca (250 a 450 / min) de la rata. Durante los operatide la temperatura del monitor de la rata (36 - 40 ° C) y ajustar la temperatura de la placa de calentamiento si es necesario. </li><li> Afeitarse los lados interiores de las patas traseras con una maquinilla de afeitar eléctrica y desinfectar la zona con antisépticos. Difundir las extremidades traseras y fijarlos con cinta adhesiva. </li><li> Coloque la rata bajo un microscopio quirúrgico y para abarcar la rata con drapeado estéril. Asegúrese de que todo el procedimiento de operación se realiza en condiciones estériles. </li><li> Abra la piel en el medio del muslo izquierdo con una incisión longitudinal desde la rodilla hasta la ingle superior utilizando un bisturí (No. 10). </li><li> Cortar el tejido subcutáneo y la fascia en capas de aproximadamente 3 cm de longitud utilizando unas tijeras de disección y microforceps hasta que el haz vascular femoral está expuesto desde la arteria de la pelvis en la ingle a la bifurcación de la arteria femoral en la rodilla. </li><li> Separar los vasos y quitar la adventicia con unas tijeras y adventicia microforceps. </li><li> Coagular el lado Branchos utilizando la coagulación eléctrica. Cubrir el campo de operación con una compresa húmeda. </li><li> Abra la piel en el lado derecho como se describe para el lado izquierdo, 1.1.11 a 1.1.14. </li><li> Para la cosecha del injerto venoso, ligar la vena femoral derecha por coagulación eléctrica en los extremos proximal y distal a una distancia de 1 - 1,5 cm. </li><li> Retire el injerto venoso con microforceps y lave el injerto venoso con una solución de heparina (50 UI / ml en una solución de cloruro sódico al 0,9%) usando una cánula de irrigación y la transfiere en el muslo izquierdo. Cubrir el campo de operación en el lado derecho con una compresa húmeda. </li><li> Ligar la vena femoral en el lado izquierdo de manera proximal en la región inguinal con una abrazadera de microvasos. Coagular la vena femoral distal por coagulación eléctrica, en la rodilla superior antes de ramificación, en una distancia de unos 2 cm. </li><li> Para anastomosis conecte el extremo proximal del injerto venoso con el extremo proximal de la vena por anastomosis de extremo a extremo con un Sutur 11-0mi. Utilizar unos 8 suturas interrumpidas. Comience con la colocación de los dos primeros puntos de sutura en las posiciones de las 12 y las 6 horas. Luego, se coloca en 2 a 3 suturas más entre estos puntos en la parte frontal y luego poner 2 a 3 suturas más en la parte de atrás. </li><li> Ligar la arteria femoral de la misma manera descrita para la vena femoral (1.1.18.). Asegúrese de que los buques de bucle no estén torcidas. Anastomosan el extremo distal del injerto venoso con el extremo proximal de la arteria como se describe para la vena femoral (pasos 1.1.19.). </li><li> Administrar 25 UI de heparina por vía intravenosa. Hacer de nuevo que los vasos de bucle no se tuercen, Retire las abrazaderas y comprobar si hay fugas y la permeabilidad del bucle durante unos 5 minutos. </li><li> Papaverina regate (por ejemplo, 4 mg / ml) en los buques a prevenir los espasmos vasculares. Si hay permeabilidad, el bucle se expande y el pulso de la arteria se puede observar. </li><li> Rellenar previamente la cámara de implantación con la primera media (aproximadamente 500 l) de la matriz (por ejemplo, &lt;/ Em&gt;, un hidrogel o una matriz ósea con o sin células). Incrustar el bucle en la cámara de la implantación. </li><li> Llenar la cámara de implantación con el segundo medio de la matriz a un volumen total de 1.000 l. Sellar la cámara con la tapa de la cámara. </li><li> Fijar la cámara de implantación en el muslo con un no-absorbible 6-0 sutura. Fijar la tapa de la cámara con un no-absorbible 6-0 sutura. Pare posible sangrado con coagulación eléctrica. </li><li> Cierre la piel con suturas absorbibles 4-0. Cubra la herida con el aerosol de aluminio. </li><li> Administrar antibióticos y analgésicos (por ejemplo, 7,5 mg / kg sc enrofloxacina, tramadol 12,5 mg / kg per os (PO) (a través de agua potable) durante 3 - 5 días y después en función del comportamiento de la rata). </li><li> Girar el vaporizador y deje que la rata para respirar los gases de alimentación hasta que empieza a despertar. </li><li> Coloque la rata en una caja con la ayuda térmica y observar con cuidado hasta que esté completamente recuperado. </li><li> No deje la ONU rataasistido hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. </li><li> No regrese a la rata a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado. </li></ol></li><li> Procedimiento de explantación <ol><li> Realice la explantación después de un corto tiempo o la implantación de largo plazo (de acuerdo con el diseño del estudio, por favor ver Referencias ejemplos 27-32). Anestesiar la rata de acuerdo con los pasos 1.1.1.-1.1.9. </li><li> Abra la piel del abdomen con un escalpelo (No. 10) y mover los intestinos a un lado con una compresa. Exponer la aorta abdominal y la vena cava caudalis utilizando hisopos de algodón. </li><li> Canular la aorta abdominal (por ejemplo., Calibre 24 cánula de plástico) y cortar la vena cava caudalis con las tijeras de disección. </li><li> Enjuague la aorta abdominal con solución de cloruro sódico al 0,9% que contenía 100 UI / ml de heparina hasta que este líquido es claro. Perfundir la aorta con 30 ml de solución de perfusión (por ejemplo., Agente o contrastar la India enk). </li><li> La eutanasia a las ratas mediante la inyección de una dosis letal de embutramida, yoduro de mebezonio, solución de clorhidrato de tetracaína inyectable (0,1-0,2 ml / kg) en anestesia profunda. </li><li> Ligar la aorta abdominal y la vena cava caudalis con un no-absorbible 4-0 sutura. </li><li> Cierre el área de la herida abierta con 1 - 2 abrazaderas. Almacenar la rata durante 24 horas a 4 ° C (endurecimiento de la solución de perfusión). </li><li> Coloque la rata en su parte posterior. Difundir las extremidades traseras y fijarlos con cinta adhesiva. </li><li> Abrir la piel por encima de la cámara con una incisión longitudinal con un bisturí (nº 10). </li><li> Eliminar el tejido conjuntivo de la cámara y el pedículo de bucle utilizando tijeras de disección y microforceps. Cortar el pedículo de bucle a una distancia de 1 cm de la abertura de la cámara con las tijeras de disección y retire la cámara. </li><li> Abra la tapa de la cámara y retirar con cuidado la construcción de la cámara con unas pinzas y fijarlo en solución de formalina tamponada al 4% durante 24 horas a la habitacióntemperatura. Utilizar posteriormente para la construcción 3D de tomografía o incluido en parafina para el análisis histológico de 30 micro-computarizada. </li></ol></li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Desde hace más de una década, se ha utilizado con éxito el asa arteriovenosa (AV) para propósitos de ingeniería tisular y la angiogénesis estudiar in vivo en el modelo animal pequeño. Hemos podido demostrar que este modelo de microcirugía se adapta muy bien para la ingeniería de tejidos diferentes y que también se puede utilizar para los estudios de la angiogénesis o antiangiogénico. Importancia de la Técnica en Materia de Métodos Alternativos / Existentes Te...

La mayoría de los tejidos y órganos del cuerpo humano dependen de una red de vasos sanguíneos funcionales que suministra nutrientes, intercambia los gases y elimina los productos de desecho. Mal funcionamiento de este sistema debido a los problemas vasculares locales o sistémicos puede conducir a una multitud de enfermedades graves. Por otra parte, en las áreas de investigación, como la ingeniería de tejidos o la medicina regenerativa, una red de vasos sanguíneos funcionales dentro de los tejidos generados artificialmente u órganos trasplantados es indispensable para el éxito de la aplicación clínica. Durante décadas los investigadores han estado investigando los mecanismos exactos involucrados en la creciente vasculatura para ganar la penetración más profunda en situaciones patológicas con el fin de encontrar nuevas intervenciones terapéuticas y proporcionar una mejor prevención de trastornos vasculares. En el primer paso, los procesos básicos tales como las interacciones célula-célula o el efecto de moléculas sobre las células del sistema vascular son generalmente investigados por vitro en 2D o 3Dexperimentos. modelos 2D tradicionales son fáciles de realizar, están bien establecidos y han contribuido en gran medida a una mejor comprensión de estos procesos. Por primera vez en 1980, Folkman et al. reportado en la siembra de la angiogénesis in vitro de células endoteliales capilares en placas revestidas de gelatina 1. Esto inmediatamente dio lugar a la publicación de una multitud de otros experimentos de angiogénesis 2D en tubo de ensayo de células endoteliales formación 2, ensayo de migración de 3 y el co-cultivo de diferentes tipos de células 4, así como otros. Estos ensayos se siguen utilizando hoy en día y se aceptan como estándar en métodos in vitro. Sin embargo, esta configuración experimental no siempre es adecuada para el estudio del comportamiento de células in vivo ya que la mayoría tipos de células requieren un entorno 3D para formar estructuras de tejidos fisiológicos relevantes 5. Se pudo demostrar que la arquitectura de la matriz 3D es decisivo para morphogenesi capilars 6 y que las interacciones célula-matriz celular adicional (ECM) y la cultura 3D condiciones regulan factores importantes que intervienen en la angiogénesis tumoral 7. La matriz 3D proporciona entradas mecánicas complejas, pueden unirse a las proteínas efectoras y establecer gradientes de concentración de solutos tejido escala. Por otra parte, se considera necesario con el fin de imitar en morfogenética vivo y pasos de remodelación de tejidos complejos 5. En estos sistemas, tanto la angiogénesis como la vasculogénesis puede ser estudiado. Mientras que la angiogénesis se describe el surgimiento de capilares a partir de vasos sanguíneos preexistentes 8, vasculogénesis se refiere a la formación de novo de vasos sanguíneos a través de células endoteliales o sus progenitores 9,10. La maduración de los vasos se describe en un proceso llamado &quot;arteriogénesis&quot; a través de reclutamiento de células de músculo liso 11. Un angiogénico típico modelo in vitro es el surgimiento de células endoteliales de la monocapa existentes sembró como una monocapa en las superficies de gel, en la superficie de las microesferas incrustadas dentro de un gel o mediante la construcción de esferoides de células endoteliales 12. En los modelos vasculogénicos células endoteliales individuales están atrapados en un gel 3D. Ellos interactúan con las células endoteliales adyacentes para formar estructuras y redes de novo vasculares, típicamente en combinación con células de apoyo 12. Sin embargo, incluso en 3D compleja en modelos in vitro no pueden imitar en entornos in vivo dado completamente la multitud de célula-célula y célula-ECM Interacciones de 13. Las sustancias con alta actividad in vitro no muestran automáticamente los mismos efectos in vivo y viceversa 14. Para un análisis exhaustivo de la vascularización procesa existe una necesidad urgente de desarrollar in vivo en modelos que simulan mejor la situación en el cuerpo. Una amplia gama de ensayos de angiogénesis in vivo se describen en la literatura, incluyendo elensayo polluelo corioalantoidea membrana (CAM), el modelo de pez cebra, el ensayo de angiogénesis de la córnea, el modelo de saco de aire dorsal, la cámara dorsal del pliegue cutáneo, los modelos de tumores subcutáneos 14. Sin embargo, estos ensayos se asocian a menudo con limitaciones, tales como cambios morfológicos rápidos, problemas en nuevos capilares distintivas de las ya existentes en el ensayo de CAM, o el espacio limitado en el ensayo de angiogénesis de la córnea 15. Además, se utilizan sistemas de no mamíferos (por ejemplo., El modelo de pez cebra 16), que conduce a problemas en los xenotrasplantes 17. En el modelo de tumor subcutáneo, la angiogénesis se origina sólo a partir del propio tumor no puede ser analizada desde el tejido adyacente contribuye en gran medida al proceso de vascularización. Por otra parte, el tejido circundante puede tener un papel decisivo en la formación del microambiente tumoral 18. No sólo para el estudio de la angiogénesis o vasculogénesis es que hay una fuerte need para una estandarizado y bien caracterizado modelo in vivo, sino también para el estudio de diferentes estrategias de vascularización en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Hoy en día, la generación de órganos artificiales complejos o tejidos es posible tanto in vitro como in vivo. Bioprinting 3D proporciona una técnica de fabricación bajo demanda para la generación de complejo 3D tejidos vivos funcional 19. Además, los biorreactores se pueden utilizar para la generación de tejidos de 20 o incluso el propio cuerpo puede ser utilizado como biorreactor 21. Sin embargo, el principal obstáculo para la aplicación exitosa de los tejidos generados artificialmente es la falta de vascularización dentro de las construcciones de ingeniería. Conexión inmediata a la vasculatura del huésped tras el trasplante es un requisito previo importante para la supervivencia, especialmente en el caso de tejidos u órganos artificiales de gran escala. Diferentes estrategias in vitro o in vivo en prevascularization eran desadesa- para establecer una microvasculatura funcional en construcciones antes de la implantación 22. La implantación de un andamio con in vitro capilares ingeniería preformadas sobre la piel dorsal de ratones condujo a una rápida anastomosis de la vasculatura ratones dentro de un día 23. En contraste, un co-cultivo de esferoides que consiste en células madre mesenquimatosas humanas y células endoteliales de la vena umbilical humana reunidos en una red prevascular tridimensional desarrolló aún más después de la implantación in vivo. Sin embargo, la anastomosis con la vasculatura huésped se limitó 24. Por encima de todo, en los defectos pobremente vascularizados, como las áreas necróticas o irradiados, esta llamada vascularización extrínseca - el crecimiento interno de los vasos de la zona circundante en el andamio - a menudo falla. Vascularización intrínseca, por el contrario, se basa en un eje vascular como fuente de nuevos capilares que brotan en el armazón 25. Utilizando el enfoque de la vascularización axial, La ingeniería tisular puede ser trasplantado con su eje vasculares y conectado a los vasos locales en el sitio receptor. Inmediatamente después del trasplante, el tejido está adecuadamente soportada por el oxígeno y los nutrientes, lo que crea las condiciones adecuadas para la integración óptima. Debido a la limitada disponibilidad de modelos para la investigación de la angiogénesis in vivo y en reconocimiento de la creciente importancia de generar tejido vascularizado axialmente, hemos desarrollado el enfoque microquirúrgico de Erol y Spira además para generar un bucle arteriovenosa (AV) en el modelo animal 26. El uso de una cámara de implantación completamente cerrada hace que este método muy adecuado para estudiar la formación de los vasos sanguíneos debajo de &quot;controlado&quot;, bien caracterizado en condiciones in vivo (Figura 1). Este modelo no sólo es útil para la investigación de la angiogénesis, pero también se adapta de forma óptima para la vascularización axial de los andamios de tejido Engininge- propósitos.

<table><tbody><tr><td>Cloruro de sodio al 0,9%</td><td>Berlin-Chemie AG</td><td>34592508</td><td></td></tr><tr><td>11-0 Ethilon / poliamida 6/6</td><td>Ethicon</td><td>EH7438G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Vicryl / poligalactina 910</td><td>Ethicon</td><td>V392H</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Prolene / polipropileno</td><td>Ethicon</td><td>8695H</td><td></td></tr><tr><td>spray de aluminio</td><td>Pharma Partner Vertriebs-GmbH</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>antisépticos&nbsp;</td><td>BODE Chemie GmbH&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catéter&nbsp;</td><td>B Braun Meslungen AG</td><td>4251612-02</td><td></td></tr><tr><td>agente de contraste</td><td>Flowtech</td><td>&nbsp; MV-122</td><td></td></tr><tr><td>embutramida, yoduro de mebezonio, solución inyectable de clorhidrato de tetracaína&nbsp;</td><td>Intervet International GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>encre de chine tinta china intensa</td><td>Lefranc & Bourgeois</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enrofloxacina</td><td>Bayer AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ungüento oftálmico</td><td>Bayer AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formalina 4%</td><td>Carl Roth GmbH & Co. KG</td><td>P087.4</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Ratiopharm GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>isoflurano&nbsp;</td><td>Abbott Laboratories</td><td>6055482</td><td></td></tr><tr><td>rata Lewis, macho</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamizol-Natrium&nbsp;</td><td>Ratiopharm GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>papaverine / Paveron N</td><td>Linden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tramadol / Tramal</td><td>Gr&uuml; nenthal GmbH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

el asa arteriovenosa (av) en un modelo de pequeños animales para estudiar la angiogénesis e ingeniería tejido vascularizado

The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

Una red funcional de vasos sanguíneos es un requisito previo para la supervivencia y el crecimiento de casi todos los tejidos y órganos del cuerpo humano. Además, en situaciones patológicas como el cáncer, la vascularización juega un papel principal en la progresión de la enfermedad. En consecuencia, existe una gran necesidad de un modelo in vivo estandarizado y bien caracterizado para dilucidar los mecanismos de la neovascularización y desarrollar diferentes enfoques de vascularización para la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa.
Describimos un enfoque microquirúrgico para un modelo animal pequeño para la inducción de un eje vascular que consiste en una vena y una arteria que se anastomosan a un asa arteriovenosa (AV). El asa AV se transfiere a una cámara de implantación cerrada para crear un microambiente aislado in vivo, que está conectado al organismo vivo solo por medio del eje vascular. Mediante el uso de imágenes 3D (resonancia magnética, microtomografía computarizada) e inmunohistología, la vasculatura en crecimiento se puede visualizar con el tiempo. Mediante la implantación de diferentes células, factores de crecimiento y matrices, su función en la formación de redes de vasos sanguíneos se puede analizar sin ninguna influencia perturbadora del entorno en un entorno bien controlable. 
Además de los estudios de angiogénesis y antiangiogénesis, el modelo de bucle AV también es perfectamente adecuado para la ingeniería de tejidos vascularizados. Después de un cierto tiempo de prevascularización, los tejidos generados pueden trasplantarse al sitio del defecto y conectarse microquirúrgicamente a los vasos locales, asegurando así el suministro inmediato de sangre y la integración del tejido diseñado. Al variar las matrices, las células, los factores de crecimiento y la arquitectura de la cámara, es posible generar varios tejidos, que luego se pueden adaptar a las necesidades individuales del paciente.

Ingeniería de tejidos Para los propósitos de ingeniería de tejido óseo, un número de diferentes sustitutos de hueso se implanta en el intestino de rata de animales modelo de bucle AV 27,28,33,34. Vascularización perfectamente pudo demostrarse por 3D tomografía micro-computarizada (micro-CT) (Figura 3A). La vascularización de una matriz procesada bovina hueso esponjoso (PBCB) fue significativamente mayor en el grupo de bucle en comparaci...

Se describe un enfoque microquirúrgico para la generación de un bucle arteriovenosa (AV) como un modelo para el análisis de la vascularización in vivo en un entorno aislado y bien caracterizado. Este modelo no sólo es útil para la investigación de la angiogénesis, pero también es adecuado de manera óptima para la ingeniería vascularizado axialmente y tejidos trasplantables.

El asa arteriovenosa (AV) en un modelo de pequeños animales para estudiar la angiogénesis e Ingeniería tejido vascularizado

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in ...

El objetivo general de este enfoque microquirúrgico es generar un bucle arteriovenoso para la ingeniería de tejidos axiolares, vascularizados y trasladables, así como para analizar la vascularización in vivo y en un entorno aislado y bien caracterizado. Con este método, podemos utilizar nuestros propios cuerpos como biorreactores vivos para la generación de diferentes tipos de tejidos vascularizados axialmente adaptados a las necesidades individuales de cada paciente. La principal ventaja de esta técnica es que el tejido generado puede trasladarse con su acceso vascular y conectarse a los vasos locales en el sitio receptor para un suministro inmediato de oxígeno y nutrientes.Además de los estudios de ingeniería de tejidos, este método puede proporcionar información sobre los procesos de angiostenosis en un organismo vivo. También puede aplicarse a situaciones patológicas, como la angiogénesis en el cáncer. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la alta complejidad de la cirugía, como la anastomosis microscópica del vaso submilimétrico.La idea de este método surgió por primera vez cuando nos enfrentamos a casos clínicos con defectos tisulare

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