Name: Utilizando el compuesto que libera etileno, ácido 2-cloroetilfosfónico, como una herramienta para estudiar la respuesta de etileno en bacterias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprende a estudiar la respuesta bacteriana al etileno usando CEPA de forma segura en el laboratorio. Este método simplifica el análisis de interacciones planta-microbio sin equipos especializados.

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Los autores agradecen al Dr. Dario Bonetta por proporcionar semillas de Arabidopsis thaliana y por la asistencia técnica en relación con el ensayo de triple respuesta, así como a Simone Quaranta por su ayuda con FT-IR. Este trabajo fue apoyado por una Beca de Descubrimiento del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC-DG) para JLS, una Beca de Posgrado de Ontario (OGS) para RVA y una Beca de Posgrado Reina Isabel II en Ciencia y Tecnología (QEII-GSST) para AJV.

1. Productos químicos <ol><li> Preparar una solución de CEPA 500 mM (144,49 g / mol), y una solución que consiste en tanto NaCl 500 mM (58,44 g / mol) y 500 mM NaH 2 PO 4 · H 2 O (137,99 g / mol) en acidificada (pH 2.5) agua ultra-pura o HCl 0,1 N. Mezclar utilizando un vórtice hasta que las soluciones son claras. </li><li> En serie diluir (10x) las soluciones 500 mM en el mismo disolvente para obtener 5 mM y 50 mM de existencias. </li><li> Preparar una solución de 10 mM de 1-aminocyclopropane ácido carboxílico (ACC; 101,1 g / mol) en agua ultra-pura. </li><li> Filtro-esterilizar las soluciones madre y almacenar alícuotas a -20 ° C. </li><li> Filtrar esterilizar celulasa. alícuotas se almacenan a 4 ° C. </li></ol> 2. Verificación de Producción de etileno a partir de 2-cloroetilfosfónico Ácido descomposición: Ensayo de Respuesta Triple <ol><li> Superficie-esterilizar Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia Semillas Uso de la fase de vapor Método: PRECAUCIÓN: El siguiente paso produce tóxica gas de cloro. Llevar a cabo la esterilización de semillas en una campana de humos. <ol><li> Obtener un recipiente hermético suficientemente profunda como para dar cabida a un vaso de precipitados de vidrio de 250 ml para la esterilización de semillas y lo coloca en una campana de humos. </li><li> Añadir A. thaliana semillas a un tubo de microcentrífuga y colocar el tubo en una gradilla. Coloque el bastidor que contiene el tubo abierto en el recipiente hermético. Nota: No llenar tubos individuales sobre medio lleno para que el gas de cloro para penetrar en las semillas inferiores. </li><li> Colocar un vaso de precipitados de 250 ml que contiene 100 ml de lejía comercial en el recipiente sellable. Añadir cuidadosamente 3 ml de HCl concentrado a la lejía y sellar inmediatamente el recipiente con su tapa. PRECAUCIÓN: El cloro y HCl reaccionan para producir gas de cloro tóxico que actúa a la superficie a esterilizar las semillas. </li><li> Se incuban las semillas en la presencia de gas cloro durante 4 horas en la campana de humos. Nota: Los tiempos de esterilización más largos reducen la eficiencia de la germinación. </li><li> Después de la esterilización, permitir que el chlorine de gas de ventilación en la campana de humos durante al menos 1 hora y luego sellar el tubo de microcentrífuga. Deje la mezcla de cloro y HCl en la campana de humos durante al menos 24 horas antes de desechar. Nota: Las semillas esterilizadas se pueden almacenar a temperatura ambiente para su uso inmediato. </li><li> Mantenga semillas a 4 ° C para el almacenamiento a largo plazo. Llevar las semillas a temperatura ambiente antes de abrir el tubo de microcentrífuga para evitar la condensación. Guarde las semillas en la oscuridad. </li></ol></li><li> Preparar las placas de agar en placas de Petri 4 del sector (90 x 15 mm): <ol><li> Preparar 110 ml de medio de crecimiento para A. thaliana plántulas: 1x Murashige y Skoog (MS) medio basal 15 (4,33 g / L) que contenía 1% (w / v) de sacarosa y 0,8% (w / v) de agar. Ajustar el medio MS a pH 6 con NaOH. </li><li> Preparar 100 ml de medio de crecimiento bacteriano para la descomposición CEPA: Schramm y Hestrin (SH) medio 16 que contiene 1,5% (w / v) de agar. Ajustar el medio SH a pH 7 con NaOH. </li><li> Esterilizar en autoclave y medios temper en un baño de agua a 55 ° C. </li><li> Una vez que el agar MS ha templado, añadir 40 ml a un matraz estéril. Para preparar el medio de crecimiento control positivo para A. thaliana plántulas, complementan la alícuota 40 ml de agar MS con 40 l de ACC 10 mM para obtener una concentración final de 10 mM ACC. </li><li> Añadir 5 ml de medio a los cuadrantes correspondientes de los platos de Petri sectorizadas (Figura 1) y permitir que el agar se solidifique. Preparar todas las placas por triplicado. Nota: CEPA no se añade al medio de crecimiento hasta más tarde en el protocolo. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig1.jpg" /> Figura 1:. Configuración de placas de agar utilizados para el ensayo de respuesta triple con CEPA Un diagrama esquemático ilustra los cuadrantes específicos para el control negativo (A), control positivo (B), y las placas experimentales (C). Esta cifra ha sido modificado a partir de Augimeri y 9 de la correa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="3"><li> Estratificar A. Las semillas thaliana para asegurar una germinación sincrónico: <ol><li> Añadir aproximadamente el cincuenta por A. semillas thaliana en cada cuadrante que contiene MS o MS + ACC agar. Asegurarse de semillas se distribuyen uniformemente para facilitar la extracción y el análisis de las plántulas. </li><li> Incubar las placas que contienen semillas en la oscuridad a 4 ° C durante 3-4 días. </li></ol></li><li> Descomponer CEPA el crecimiento bacteriano Medio (SH) y realizar Triple ensayo de respuesta: <ol><li> Después de la estratificación, exponer las semillas a la luz fluorescente durante 2 horas. </li><li> Spread 10 l de la CEPA mM solución madre 500 en los cuadrantes de las placas de agar que contienen experimentales SH (pH 7; Figura 1) para obtener una concentración final CEPAde 1 mM. </li><li> Sellar las placas con película de laboratorio y cubrir con papel de aluminio para crear un ambiente oscuro para las semillas. </li><li> Germinar las semillas mediante la incubación de las placas en la oscuridad a 23 ° C durante 3 días con el agar hacia abajo. Nota: Las placas pueden ser apiladas, pero los controles negativos se deben colocar en la parte inferior desde el etileno es más ligero que el aire. </li></ol></li><li> Analizar Triple respuesta del ensayo de datos: <ol><li> Con unas pinzas esterilizadas a la llama, retire una plántula de una placa correspondiente a cada tratamiento y vistas bajo un microscopio de disección o digital USB. Asegúrese de que la parte inferior de las plántulas están alineados y la fotografía. </li><li> Retire 30 plántulas de cada cuadrante (60 plántulas por repetición biológica y 180 plántulas por tratamiento). Alinear en una superficie con un fondo negro y una fotografía con una regla. </li><li> Medir la longitud del hipocotilo (mm) de las plántulas replicados utilizando el software ImageJ 17. Establecer la escala haciendo clic y arrastrando el recto * *herramienta para seleccionar una longitud de 10 mm. Seleccione &quot;Escala de Ajuste&quot; en la pestaña &quot;Analizar&quot; y ajuste la distancia conocida a 10. Con la herramienta * * segmentado, haga clic y arrastre para seleccionar la longitud del hipocotilo y pulse M para medir la distancia. Comparar las medias de réplicas biológicas utilizando un ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Tukey. Las diferencias se consideraron significativas si p &lt;0,05. </li></ol></li></ol> 3. Análisis de pH en todo el crecimiento bacteriano <ol><li> Crecer y cuantificar Komagataeibacter culturas xylinus arranque por triplicado: <ol><li> Se inocula una sola colonia de K. xylinus en 5 ml de medio SH (pH 5) suplementado con 0,2% (v / v) celulasa esterilizada por filtración. Incubar cultivos a 30 ° C con agitación a 150 rpm hasta una DO 600 se alcanza de 0,3 a 0,4 (alrededor de 72 hr). </li><li> Cosecha cultivos iniciadores por centrifugación (2.000 xg, 4 ° C, 10 min). Con 5 ml 0,85% estéril (w / v) NaCll solución, lavar las células dos veces y resuspender el sedimento celular. Mantener las células en hielo. </li><li> Cuantificar las células utilizando una cámara de recuento de Petroff-Hausser. </li></ol></li><li> Inocular cultivos para el análisis de pH: <ol><li> Añadir 150 ml de caldo de SH (pH 7) suplementado con 0,2% (v / v) de celulasa esterilizada por filtración a doce 500 ml frascos con tapas de aluminio. Inocular matraces con K. cultivos iniciadores xylinus a una concentración de 10 5 células / ml. El uso de los tres cultivos iniciadores, se preparan tres repeticiones por tratamiento biológico. </li><li> culturas suplemento con 300 l de las soluciones madre de CEPA mM 5, 50, o 500 para obtener concentraciones finales de CEPA de 0,01, 0,1, y 1,0 mM, respectivamente. Suplemento los cultivos de control no tratados con 300 l de disolvente utilizado para disolver CEPA. </li><li> Sellar los matraces con cinta adhesiva firmemente las tapas de papel de aluminio a los matraces y se incuban los cultivos durante 14 días a 30 ° C con agitación a 150 rpm. </li></ol></li><li> Cada día, asepticaLLY eliminar muestras de 5 ml de cada matraz y las células de pellets por centrifugación (2.000 xg; 4 ° C; 10 min). Transferencia de los sobrenadantes a un tubo limpio y medir el pH de cada réplica biológica utilizando un medidor de pH. </li><li> Analizar los datos de tiempo-por supuesto graficando el pH promedio de las réplicas biológicas. Nota: Es importante que el pH del cultivo no sea inferior a 3,5; un pH del cultivo de 5 reduce significativamente la liberación de etileno a partir de CEPA, y un pH inferior a 3,5 inhibe completamente la liberación de etileno. </li><li> Para el control de los niveles de cloro y fosfato, lleve a cabo un experimento idéntico utilizando 0,01, 0,1, y 1,0 mM de la solución de NaCl-NaH 2 PO 4 utilizando los, 50, las existencias 5 y 500 mm, respectivamente. </li></ol> 4. Morfología de colonias <ol><li> Crecer K. Los cultivos xylinus de arranque, por triplicado: <ol><li> Se inocula una sola colonia de K. xylinus en 5 ml de medio SH (pH 5) suplementado con 0,2% (v / v) celulasa esterilizada por filtración. Incubadorasculturas TE a 30 ° C con agitación a 150 rpm hasta una DO 600 de 0,3 a 0,4 se alcanza (aproximadamente 72 hr). </li><li> Cosecha cultivos iniciadores por centrifugación (2.000 xg, 4 ° C, 10 min). Con 5 ml de solución salina estéril, se lavan las células y luego resuspender el botón celular. Mantener las células en hielo. </li></ol></li><li> Preparar 24 placas de agar que contienen 25 ml de SH (pH 7) medio con 1,5% (w / v) de agar. </li><li> Una vez que el agar se ha solidificado, se extendió 50 l de la 5, 50, y 500 de CEPA mM de soluciones madre en el agar para obtener concentraciones finales de CEPA de 0,01, 0,1, y 1,0 mM, respectivamente. Creados placas de control no tratados y de disolvente, que constan de ninguna modificación y difusión de 50 l de disolvente usado para disolver los compuestos de ensayo. </li><li> Placas de imagen unidimensional para las colonias aisladas con un bucle completo (~ 5 l) de K. xylinus cultivo iniciador y sellarlos con película de parafina. Inocular todas las placas por triplicado. Incubar las placas durante cinco días a 30 ° C. </li><li> Fotoograph colonias de 20 aumentos con un microscopio digital USB y la evaluación cualitativa de producción de celulosa y la morfología colonial en medio sólido. Nota: Celulosa aparece como una sustancia nebuloso lo largo del margen de la colonia. </li><li> Para el control de los niveles de cloro y fosfato, lleve a cabo un experimento idéntico utilizando 0,01, 0,1, y 1,0 mM de la solución de NaCl-NaH 2 PO 4 utilizando los, 50, las existencias 5 y 500 mm, respectivamente. </li></ol> 5. Ensayos de película <ol><li> Crecer y cuantificar K. Los cultivos xylinus de arranque, por triplicado: <ol><li> Por triplicado, inocular una única colonia de K. xylinus en 5 ml de medio SH (pH 5) suplementado con 0,2% (v / v) celulasa esterilizada por filtración. Incubar cultivos a 30 ° C con agitación a 150 rpm hasta una DO 600 se alcanza de 0,3 a 0,4 (alrededor de 72 hr). </li><li> Cosecha cultivos iniciadores por centrifugación (2.000 xg, 4 ° C, 10 min). Con 5 ml de solución salina estéril, lavar tél células dos veces y volver a suspender el sedimento celular. Mantener las células en hielo. </li><li> Cuantificar las células utilizando una cámara de recuento de Petroff-Hausser. </li></ol></li><li> Preparar las mezclas maestras para inocular placas de 24 pocillos: <ol><li> Suplemento 60 ml de medio SH (pH 7) con 120 l de la 5, 50, y las poblaciones de 500 mM de CEPA para obtener concentraciones finales de CEPA de 0,01, 0,1, y 1,0 mM, respectivamente. Suplemento otros 60 ml de medio SH (pH 7) con 120 l de disolvente utilizado para disolver CEPA. Vórtice para mezclar. </li><li> Dividir cada una de 60 ml de CEPA que contienen medio en cuatro alícuotas de 14 ml. Inocular tres de los 14 ml alícuotas con réplicas biológicas de cultivo iniciador a una concentración de 10 5 células / ml. Mantenga los tubos con las células en hielo para evitar la producción de celulosa. Nota: La alícuota restante 14 ml se utilizará para los pocillos de control estériles. </li></ol></li><li> Inocular placas de 24 pocillos: <ol><li> Pruebe cada tratamiento en su propio plato con tres filas de réplicas biológicas yuna fila de controles estériles (Figura 2). </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig2.jpg" /> Figura 2:. Diagrama de flujo que ilustra el protocolo utilizado para el ensayo de película y el análisis complementado-CEPA Stock medio SH pH 7 (60 ml) se dividió en alícuotas de tres inoculaciones repetidas biológica separada y un control estéril (14 ml cada uno). Estos cultivos se dividen en partes alícuotas en seis repeticiones técnica (2 ml) en una placa de 24 pocillos y luego se sellan con película de parafina. Después de la incubación durante 7 días a 30 ° C, unas películas se cosechan y se caracterizan por la determinación del peso en húmedo, grosor, peso seco, y la cristalinidad mediante FT-IR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura</a> <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> El uso de la mezcla maestra de 14 ml, añadir 2 ml en EACh de seis pocillos de una placa de 24 pocillos estériles. Completar las tres repeticiones biológica y el control estéril (Figura 2). Repita este procedimiento para cada tratamiento. </li><li> placas de sellado con película de parafina y se incuba estáticamente durante 7 días a 30 ° C. </li></ol><ol start="4"><li> Medir la cosecha y Pellicle Wet peso, grosor, peso seco (rendimiento de celulosa) y la cristalinidad (Figura 2): <ol><li> Presione un lado de la película para elevar el borde película contrario y eliminar unas películas individuales con fórceps. Al tiempo que mantiene el agarre, colocarlos sobre una toalla de papel limpia durante 3 segundos para eliminar el exceso de medio antes de pesar para determinar sus pesos en húmedo. </li><li> Alinear unas películas adyacentes a un gobernante y una fotografía de la cara usando una cámara digital de alta resolución. </li><li> El uso de software ImageJ 17, medir el espesor de película en el hombro izquierdo, hombro derecho y el centro de cada película. Un promedio de todos los técnicos repeticiones para cada RepliCat biológicami. </li><li> Individualmente transferir las unas películas en los pocillos de una placa de 6 pocillos. El tratamiento de unas películas con 12 ml de NaOH 0,1 N a 80 ° C durante 20 minutos para lisar las células. </li><li> Retire el NaOH y neutralizar unas películas mediante el lavado con agua ultra pura durante 24 horas con agitación. Cambie el agua cada 6 horas. Nota: unas películas deben ser de color blanco tras la finalización de la etapa de lavado. </li><li> Coloque unas películas en las esteras de silicio y seco a 50 ° C durante 48 horas hasta peso constante. Una vez seco, retirar de esteras y medir los pesos peliculares en una balanza analítica para determinar el rendimiento de celulosa bacteriana. </li><li> Analizar cristalinidad película usando transformada de Fourier espectroscopia de infrarrojos (FT-IR) usando 32 barridos y una resolución de 4 cm -1 en el rango de 4.000 a 650 cm -1. Calcular el índice de cristalinidad, CI (IR), usando un 1437 / A 895; la relación de absorbancia de la &quot;banda cristalina&quot; y &quot;banda amorfa&quot;, como se ha descrito previamente 18. </li></ol&gt; </li><li> Para el control de los niveles de cloro y fosfato, lleve a cabo un experimento idéntico utilizando 0,01, 0,1, y 1,0 mM de la solución de NaCl-NaH 2 PO 4 utilizando los, 50, las existencias 5 y 500 mm, respectivamente. </li><li> Analizar Pellicle datos: <ol><li> Calcular la hidratación película mediante la determinación de la diferencia entre la película de peso húmedo y el peso seco. </li><li> La media de los valores de todas las repeticiones técnica para obtener un valor único para cada réplica biológica para el análisis estadístico. Comparación de tratamientos usando un ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Tukey. Las diferencias son significativas si p &lt;0,05. </li><li> Normalizar los datos como el porcentaje de los controles no tratados y trazar los medios de réplicas biológicas. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos descritos aquí describen la producción in situ de etileno a partir de CEPA para el estudio de la respuesta de etileno bacteriana usando el organismo modelo, K. xylinus. Este método es muy útil como etileno puede ser producido por complementar cualquier medio acuoso que tiene un pH mayor que 3,5 10,11 con CEPA negando la necesidad de gas de etileno puro o equipo de laboratorio especializado. Este método no se limita a estudiar los efectos del etileno CEPA derivados de bacterias, p...

El etileno olefina (C 2 H 4) fue descubierto por primera vez como una hormona vegetal en 1901 cuando se observó que las plántulas de guisante, cultivadas en un laboratorio que utiliza lámparas de gas de carbón, exhiben una morfología anormal en la que los vástagos (hipocotilos) eran más cortas, más gruesas y dobladas hacia los lados en comparación con las plantas de semillero de guisantes normales; un fenotipo más adelante llamado el 1,2 respuesta triple. Estudios posteriores demostraron que el etileno es una fitohormona vital que regula numerosos procesos de desarrollo tales como el crecimiento, la respuesta al estrés, la maduración del fruto y la senescencia 3. Arabidopsis thaliana, un organismo modelo para la investigación de biología vegetal, ha sido bien estudiado en cuanto a su respuesta al etileno. Varios mutantes de respuesta de etileno se han aislado mediante la explotación del fenotipo triple respuesta observada en la oscuridad de cosecha A. plántulas thaliana en presencia de etileno 1,4,5. El precursor biosintético para la producción de etileno en las plantas es 1-aácido minocyclopropane carboxílico (ACC) 6 y es comúnmente usado para el ensayo de triple respuesta para aumentar la producción de etileno endógeno que conduce a la triple 1,4,5 fenotipo de respuesta. Aunque la respuesta de etileno es ampliamente estudiado en las plantas, el efecto del etileno exógeno sobre las bacterias es muy poco estudiado a pesar de la estrecha asociación de bacterias con plantas. Un estudio informó de que ciertas cepas de Pseudomonas pueden sobrevivir usando etileno como única fuente de carbono y energía 7. Sin embargo, sólo dos estudios han demostrado que las bacterias responden a etileno. El primer estudio demostró que las cepas de Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, y P. syringae eran quimiotáctica hacia etileno usando un ensayo de tapón de agarosa en el que agarosa fundida se mezcló con un tampón de quimiotaxis equilibrada con gas etileno puro 8. Sin embargo, hasta donde sabemos, no ha habido Furthinformes er utilizando gas de etileno puro para caracterizar la respuesta de etileno bacteriana, probablemente debido a la dificultad de manejo de gases en el laboratorio sin equipo especializado. El segundo informe de respuesta a etileno bacteriana demostró que el etileno se incrementó la producción de celulosa bacteriana y la expresión génica influido en la bacteria asociada a fruta, Komagataeibacter (anteriormente Gluconacetobacter) xylinus 9. En este caso, el compuesto que libera etileno, se utilizó ácido 2-cloroetilfosfónico (CEPA) para producir etileno in situ dentro del medio de crecimiento bacteriano, evitando la necesidad de gas de etileno puro o equipo especializado. CEPA produce etileno a una proporción de 1: 1 molar por encima de pH 3.5 a través de un 10,11, la reacción 12 de primer orden catalizada por base - 14. La degradación de la CEPA se correlaciona positivamente con el pH y la temperatura 13,14 y los resultados en la producción de acetato deeno, cloruro y fosfato. CEPA proporciona a los investigadores interesados ​​en el estudio de las respuestas bacterianas de etileno con una alternativa conveniente a etileno gaseoso. El objetivo general de los siguientes protocolos es proporcionar un método simple y eficaz para estudiar la respuesta de etileno bacteriana e incluye la validación de los niveles fisiológicamente relevantes de la producción de etileno a partir de la descomposición CEPA en medio de crecimiento bacteriano, el análisis de pH del cultivo para asegurar CEPA descomposición no se vea afectada durante el crecimiento bacteriano, y la evaluación del efecto del etileno sobre la morfología y el fenotipo bacteriano. Demostramos que utilizan estos protocolos K. xylinus, sin embargo, estos protocolos se puede adaptar para estudiar la respuesta de etileno en otras bacterias utilizando el medio de crecimiento apropiado y análisis fenotipo.

<table><tbody><tr><td>Ácido carboxílico 1-aminociclopropano (ACC)</td><td>Sigma</td><td>A3903</td><td>Precursor biosintético del etileno en plantas</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 4 sectores</td><td>Phoenix Biomedical</td><td>CA73370-022</td><td>Para pruebas de triple respuesta</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop</td><td>AGR001.1</td><td>Para solidificar el medio</td></tr><tr><td>Cámara Canon Rebel T1i DLSR Canon</td><td></td><td>3818B004</td><td>Para imágenes de películas</td></tr><tr><td>Celulasa de Trichoderma reesei ATCC 26921&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C2730</td><td>Solución acuosa</td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>BioShop</td><td>CIT002.500</td><td>Para medio SH</td></tr><tr><td>Lejía comercial</td><td>Life Brand 57800861874</td><td></td><td>Lejía para la esterilización de semillas</td></tr><tr><td>HCl concentrado</td><td>BioShop</td><td>HCL666.500</td><td>Ácido clorhídrico para el ajuste del pH</td></tr><tr><td>Microscopio digital USB</td><td>Enchufable</td><td>N/A</td><td>Para fotos de colonias</td></tr><tr><td>Etefón (&ge; 96%; Ácido 2-cloroetilfosfónico)</td><td>Sigma</td><td>C0143</td><td>Compuesto liberador de etileno</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>Para medio SH</td></tr><tr><td>Komagataeibacter xylinus ATCC 53582</td><td>ATCC</td><td>53582</td><td>Alfaproteobacteria productora de celulosa bacteriana</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga</td><td>LifeGene</td><td>LMCT1.7B</td><td>Tubo de microcentrífuga de 1,7 ml</td></tr><tr><td>Murashige y Skoog (MS) basal medio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td>Medio de crecimiento de Arabidopsis thaliana</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPD579.500</td><td>Fosfato de sodio, heptahidratado dibásico para medio SH</td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>BioBasic SOD001.1</td><td>Cloruro de sodio para solución salina y de control</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPM306.500</td><td>Fosfato de sodio, monobásico monohidrato para solución de control</td></tr><tr><td>NaOH</td><td></td><td>BioShop SHY700.500</td><td>Hidróxido de sodio para el ajuste del pH Película de</td></tr><tr><td>parafina</td><td>Parafilm</td><td>PM996</td><td>Para el sellado de placas y matraces</td></tr><tr><td>Peptona (bacteriológica)</td><td>BioShop</td><td>PEP403.1</td><td>Para medio SH</td></tr><tr><td>Cámara de recuento Petroff-Hausser</td><td>Hausser scientific</td><td>3900</td><td>Cámara de recuento de células bacterianas</td></tr><tr><td>Filtro de esterilización de polietersulfona 0,2 y micro; m</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>Para esterilizar celulasa</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>BioShop</td><td>SUC600.1</td><td>Sacarosa para medio MS</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>Para medio SH</td></tr></tbody></table>

utilizando el compuesto que libera etileno, ácido 2-cloroetilfosfónico, como una herramienta para estudiar la respuesta de etileno en bacterias

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

El etileno (C2H4) es una fitohormona gaseosa que interviene en numerosos aspectos del desarrollo de las plantas, desempeñando un papel dominante en la senescencia y la maduración de los frutos. El etileno exógeno aplicado durante el desarrollo temprano de la planta desencadena el fenotipo de triple respuesta; un hipocótilo más corto y grueso con un gancho apical exagerado. A pesar de la íntima relación entre las plantas y las bacterias, el efecto del etileno exógeno sobre las bacterias se ha pasado por alto en gran medida. Esto se debe en parte a la dificultad de controlar el etileno gaseoso dentro del laboratorio sin equipo especializado. El ácido 2-cloroetilfosfónico (CEPA) es un compuesto que se descompone en etileno, cloro y fosfato en una proporción molar de 1:1:1:1 cuando se disuelve en un medio acuoso de pH 3,5 o superior. En este trabajo describimos el uso de CEPA para producir etileno in situ para la investigación de la respuesta al etileno en bacterias utilizando como organismo modelo la bacteria productora de celulosa Komagataeibacter xylinus, asociada a la fruta. Los protocolos descritos en este documento incluyen tanto la verificación de la producción de etileno a partir de CEPA a través del ensayo de triple respuesta de Arabidopsis thaliana como los efectos del etileno exógeno sobre la producción de celulosa de K. xylinus, las propiedades de la película y la morfología colonial. Estos protocolos se pueden adaptar para examinar el efecto del etileno en otros microbios utilizando medios de crecimiento apropiados y análisis de fenotipos. El uso de CEPA proporciona a los investigadores una alternativa simple y eficiente al gas etileno puro para la determinación rutinaria de la respuesta bacteriana al etileno.

Una configuración de placa esquemática para la verificación de la liberación de etileno de CEPA en medio SH (pH 7) mediante el ensayo de triple respuesta se muestra en la Figura 1A - C. Un diagrama de flujo que ilustra el protocolo de película se muestra en la Figura 2. Dark-adulto A. thaliana plántulas exhiben el fenotipo de triple respuesta (hipocotilo corto y más grueso con un gancho apical exagerada) en presencia de ACC y en...

Los protocolos descritos en este documento facilitan la investigación conveniente de las respuestas bacterianas al etileno mediante la utilización de ácido 2-cloroetilfosfónico (CEPA). El etileno se produce in situ a través de la descomposición de CEPA en un medio acuoso de crecimiento bacteriano, eludiendo el requisito de gas etileno puro.

Utilizando el compuesto que libera etileno, ácido 2-cloroetilfosfónico, como una herramienta para estudiar la respuesta de etileno en bacterias

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un método sencillo y seguro para el estudio de la respuesta bacteriana al etileno. Este método responderá preguntas clave sobre las interacciones planta-microbio, como el papel que desempeña el etileno en la adhesión bacteriana y la colonización de las plantas. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere equipo especializado y es mucho más segura que manipular etileno gaseoso en el laboratorio.Aunque este método puede proporcionar información sobre cómo la producción de celulosa bacteriana se ve afectada por el etileno, también puede aplicarse a otros microorganismos asociados a plantas para el estudio in vitro de cómo los procesos mediados por etileno participan en la colonización de plantas. Como preparación, prepare 100 mililitros de medio de crecimiento para las plántulas de Arabidopsis y prepare 100 mililitros de medio de crecimiento bacteriano para la descomposición de CEPA. Una vez que el medio de Arabidopsis haya alcanzado temperatura ambiente, divida 40 mililitros en un matraz estéril y suplemente la alícuota con 40 microlitros de ACC 10 milimolar.Ahora, cargue los cuadrantes de la placa con cinco mililitros de medio y deje que el agar se solidifique. Cuadrantes opuestos de todas las placas contienen medio de crecimiento bacteriano y medio de arabidopsis. Utilice tres configuraciones diferentes de medio.El tratamiento CEPA tendrá lugar más adelante en el protocolo. Prepare cada configuración de placa por triplicado. Una vez que el agar haya enfriado, distribuya uniformemente aproximadamente 50 semillas en cada cuadrante del medio de arabidopsis.A continuación, incubar las placas en la oscuridad a cuatro grados Celsius durante tres a cuatro días. Posteriormente, tras la incubación de las semillas, exponerlas a luz fluorescente durante dos horas. Luego, distribuir 10 microlitros de la solución stock de CEPA 500 milimolar sobre el agar bacteriano de una configuración de placa.La concentración final de CEPA en el agar será de un milimolar. Ahora, selle todas las placas con película de laboratorio y envuélvalas con papel de aluminio. Luego, coloque las placas en un ambiente oscuro a 23 grados Celsius con la cara del agar hacia abajo y déjelas incubar durante tres días para germinar las semillas.Después de que germinen las semillas, utilice pinzas esterilizadas con llama para retirar las plántulas correspondientes a cada tratamiento. Seleccione 30 plántulas de cada cuadrante para un total de 180 por tratamiento. Capture imágenes de las plántulas bajo un microscopio estereoscópico o con una cámara digital de alta resolución sobre un fondo negro junto a una regla para la escala.Luego, mida la longitud del hipocótilo utilizando el software ImageJ. Con la herramienta de línea recta, mida 10 milímetros y seleccione Establecer escala en la pestaña Analizar para definir la escala. A continuación, utilice la herramienta Segmentada bajo la herramienta de Línea recta para medir cada hipocótilo y presione M para calcular sus longitudes.El ensayo de película es una herramienta de análisis estándar para la producción de celulosa bacteriana. El análisis del pH y la morfología se describe detalladamente en el protocolo sexual. Como preparación, recolecte células de cultivos iniciadores por triplicado y cuantifique las células utilizando una cámara de conteo Petroff-Hauser.Luego, prepare cuatro mezclas maestras de medio con diferentes concentraciones de CEPA. Para cada mezcla maestra, agregue 60 mililitros de medio SH con pH 7 y añada 120 microlitros de una solución stock de CEPA de 0, 5, 50 o 500 milimolar para obtener concentraciones finales de CEPA de 0, 0,1, 0,1 o 1,0 milimolar. Mezcle estos medios agitando suavemente los matraces.Se necesita un conjunto de medios para cada uno de los tres réplicas y un cuarto conjunto debe utilizarse como control estéril. Por lo tanto, divida cada preparación de medio de 60 mililitros en cuatro alícuotas de 14 mililitros. Luego, enfríe previamente las alícuotas de 14 mililitros antes de inocularlas con sus cultivos iniciadores respectivos para obtener una concentración final de 100.000 células por mililitro.Mantenga todos los tubos inoculados sobre hielo para evitar la producción de celulosa. Utilice los 14 mililitros restantes de eluatos para los pozos de control estéril. A continuación, a partir de cada mezcla maestra de 14 mililitros, cargue alícuotas de 2 mililitros en seis pozos de una placa estéril de 24 pozos, para un total de cuatro placas cargadas por cultivo inicial analizado.Cierre cuidadosamente las placas con película de parafina e incúbelas estáticamente durante siete días a 30 grados Celsius. Durante la incubación, incube un cultivo líquido de 25 mililitros en paralelo para medir periódicamente la acidez del medio. Si la acidez desciende por debajo de un pH de cinco, el crecimiento del organismo inhibirá la descomposición de CEPA en etileno y, por lo tanto, será incompatible con este ensayo.Una semana después, coseche y mida el peso húmedo, el grosor, el peso seco y la cristalinidad del pel&iacute;culo. Para recolectar un pel&iacute;culo de la placa, presione un lado del pel&iacute;culo para elevar el borde opuesto y lev&aacute;ntelo con pinzas. Mientras mantiene el agarre, col&oacute;quelo sobre una toalla de papel fresca durante tres segundos para eliminar el exceso de medio.Luego, pese cada película y registre este valor como el peso húmedo. A continuación, alinee las películas a lo largo de una regla y tómelas una fotografía desde el lateral utilizando una cámara digital de alta resolución. Analice estas fotografías para determinar los espesores de las películas.A continuación, transfiera individualmente las películas a las pocillos de una placa de seis pocillos. Trátelos con 12 mililitros de hidróxido de sodio 0,1 N a 80 °C durante 20 minutos para lisar las células. Luego, retire el hidróxido de sodio y neutralice las películas tratadas lavándolas exhaustivamente con 12 mililitros de agua ultrapura durante 24 horas con agitación en una placa de seis pocillos.Durante esta incubación, cambie el agua cada seis horas. Cuando finalice la incubación, las películas deben estar blancas. Luego, coloque las películas sobre almohadillas de silicona y séquelas a 50 grados Celsius durante 48 horas para prepararlas para la medición del peso seco.La cristalinidad de las películas se puede analizar mediante espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier. Las plántulas de arabidopsis thaliana cultivadas en la oscuridad mostraron el fenotipo de respuesta triple, con un hipocótilo corto y grueso y un gancho apical exagerado, en presencia de ACC y en presencia de etileno producido por la descomposición de CEPA en medio SH, pero no bajo condiciones no tratadas. Claramente, la longitud del hipocótilo de las semillas tratadas fue significativamente menor que la de los controles no tratados.Por lo tanto, el etileno se liberó del CEPA en medio SH a una concentración fisiológicamente relevante. Todas las concentraciones de etileno derivado del CEPA disminuyeron significativamente el peso húmedo de la película, pero no afectaron el grosor de la película, y todas las concentraciones de etileno derivado del CEPA aumentaron significativamente el peso seco de la película. Además, la hidratación de la película se redujo con todas las concentraciones de etileno derivado del CEPA.Al realizar este procedimiento, es importante medir el pH del medio de crecimiento para asegurarse de que el pH no descienda por debajo de cinco, de modo que la degradación de CEPA en etileno no se vea inhibida. Recuerde que el CEPA en polvo es extremadamente peligroso para las membranas mucosas. Siempre se deben tomar las precauciones adecuadas al llevar a cabo este protocolo.Esta técnica permitirá a los investigadores interesados en las interacciones entre bacterias y plantas explorar de forma segura las respuestas mediadas por etileno in vitro. Esto ayudará a esclarecer cómo las señales de las plantas median la colonización y la adhesión bacteriana. Actualmente, esta área ha sido poco estudiada.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Utilizando el compuesto que libera etileno, ácido 2-cloroetilfosfónico, como una herramienta para estudiar la respuesta de etileno en bacterias (Video) | JoVE Journal

Utilizando el compuesto que libera etileno, ácido 2-cloroetilfosfónico, como una herramienta para estudiar la respuesta de etileno en bacterias

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