Caracterización de complejos de proteínas de múltiples subunidades de MxA humano Usando no desnaturalizante en gel de poliacrilamida-electroforesis

El objetivo general de este experimento es determinar el número de subunidades en complejos de proteínas homooligoméricas en lisados celulares utilizando electroforesis en gel de dodecosulfato de sodio y poliacrilamida no desnaturalizante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, como el estado oligomérico de las proteínas involucradas en procesos celulares fundamentales. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere purificación de los complejos de proteínas homooligoméricas ni equipos especializados y costosos.

Por lo tanto, se puede realizar en la mayoría de los laboratorios. Este experimento utiliza dos tipos de células. Células A549 que expresan la proteína A endógena de resistencia a Myxovirus, o MxA; y virocélulas que sobreexpresan MxA.

Siembre las células A549 y viroceldas en platos de seis pocillos con dos mililitros de medio de crecimiento por pocillo. Incubar las células durante la noche en una incubadora de cultivos celulares. Al día siguiente, cosecha las células.

Lave cada pocillo con un mililitro de PBS y fije las celdas agregando 0,5 mililitros de solución de tripsina-EDTA al 0,25% durante aproximadamente cinco minutos a temperatura ambiente. Tan pronto como las células se desprendan del plato, agregue 0,5 mililitros de medio de crecimiento y mezcle con cuidado pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera las celdas de cada pocillo a un tubo de dos mililitros y despídeles con una centrífuga de mesa.

Retire con cuidado el sobrenadante pipeteando sin alterar el pellet de la célula. Lave las células añadiendo un mililitro de PBS helado y pipeteando cuidadosamente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo. Granule las células en una centrífuga de mesa.

Retire con cuidado el sobrenadante pipeteando sin separar el pellet de la celda. Agregue 200 microlitros de tampón de lisis helado, vuelva a suspender las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo y luego colóquelas en hielo. Proteja inmediatamente el lisado de la luz cubriendo los tubos con papel de aluminio, ya que el yodoacetamida del tampón de lisis es sensible a la luz.

Incubar en hielo durante 30 minutos. El uso de yodoacetamida es crucial porque el yodoacetamida protege irreversiblemente el grupo tiol de las cisteínas libres formando un enlace tioéter y evita la agregación artificial de proteínas. A continuación, elimine los restos de células mediante centrifugación en una centrífuga de mesa preenfriada.

Durante la centrifugación, prepare columnas de diálisis con un límite de peso molecular de 10.000. Conecte las columnas de diálisis a una boya flotante y colóquelas en un vaso de precipitados lleno de tampón de diálisis preenfriado para equilibrar las columnas. No toque la membrana.

Coloque un agitador magnético en un vaso de precipitados y transfiera el vaso de precipitados a la cámara frigorífica. Usando el agitador magnético para asegurar una agitación suave, equilibre durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Después de 20 minutos, retire las columnas del tampón de diálisis y de la boya flotante.

Transfiera los lisados aclarados a las columnas de diálisis preparadas mediante pipeteo sin tocar la membrana. Fije las columnas a una boya de flotación. Vuelva a colocarlos en el vaso de precipitados lleno de tampón de diálisis y, a continuación, transfiera el vaso de precipitados a la cámara frigorífica.

Diálisar el lisado durante al menos cuatro horas a cuatro grados centígrados mientras se agita cuidadosamente con un agitador magnético para eliminar los metabolitos pequeños y las sales que podrían interferir con la electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante. Una vez finalizada la diálisis, transfiera cada muestra dializada a un tubo de 1,5 mililitros. Elimine los precipitados por centrifugación en una centrífuga de mesa.

La electroforesis debe realizarse inmediatamente después de la diálisis de los lisados para evitar la disociación de los complejos de proteínas oligoméricas. Llene la cámara de gel interior y exterior con tampón de funcionamiento preenfriado. Ejecute previamente el gel de poliacrilamida no desnaturalizante con tampón de funcionamiento preenfriado a 25 miliamperios por gel durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.

Mezcle 15 microlitros del lisado preparado con cinco microlitros de tampón de muestra 4X. Cargue un estándar de proteína nativa de su elección y 15 microlitros de muestra en el gel. Ejecute el gel a 25 miliamperios durante cuatro horas a cuatro grados centígrados.

Cuando se complete la electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante, desmonte el gel y transfiéralo con cuidado al tampón SDS. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente agitando suavemente. Prepare dos esponjas, cuatro hojas de papel de filtro de celulosa y una membrana secante por gel y sumérjalas en tampón secante.

Ensamble el sándwich de la siguiente manera de abajo hacia arriba. Una esponja, dos hojas de papel de filtro de celulosa, una membrana secante, el gel, dos hojas de papel de filtro de celulosa y una esponja. Coloque el sándwich en el tanque secante, asegurándose de que la membrana mire hacia el polo positivo, mientras que el gel mira hacia el polo negativo.

Llene el tanque de transferencia con tampón de transferencia preenfriado. Para obtener los mejores resultados de transferencia de proteínas, seque a 90 miliamperios durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, desmonta el sándwich.

Incubar la membrana en la solución de Ponceau S durante cinco minutos a temperatura ambiente para visualizar el estándar de proteína. Demanche la membrana colocándola en agua desionizada y lavándola. Después de transferir la membrana a una bandeja, marque las bandas del patrón de proteína con un bolígrafo.

Bloquee la membrana con tampón de bloqueo durante al menos una hora a temperatura ambiente o toda la noche a cuatro grados centígrados. Posteriormente, las proteínas de interés se visualizan mediante inmunotinción utilizando un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra MxA como se describe en el protocolo de texto. Las virocélulas que carecían de MxA endógena se transfectaron con MxA de tipo salvaje recombinante y varianza de MxA monomérica y dimérica.

La migración de la varianza recombinante MxA a su peso molecular esperado confirmó su estado oligomérico. El tipo salvaje MxA, expresado ectópicamente, migró como tetrámero. Estas proteínas recombinantes se utilizaron para evaluar el estado oligomérico de la proteína MxA humana endógena derivada de células A549 estimuladas con interferón alfa.

Los resultados revelaron que el tamaño de MxA en lisados de células A549 estimuladas por interferón-alfa corresponde a un tetrámero. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un día y medio si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no debe congelar ni descongelar las muestras durante todo el procedimiento, ya que esto podría destruir las interacciones de las proteínas o causar agregaciones de proteínas.

Además, cuando se trabaja con reactivos sensibles a la luz, como la yodoacetamida, es importante proteger las muestras de la luz durante la etapa de lisis. Después del SDS-PAGE no desnaturalizante, se pueden realizar otros métodos como la extracción de gel de proteínas y la actividad enzimática AsiS o un PAGE de segunda dimensión para responder a preguntas adicionales como la actividad enzimática y la caracterización de posibles complejos hetero-oligoméricos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploraran la composición de complejos de proteínas oligoméricas en células cultivadas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar lisados celulares a partir de cultivos celulares para estudiar proteínas oligoméricas en análisis PAGE no desnaturalizantes. No olvide que trabajar con yodoacetamida puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y protección para los ojos.