Caracterización de complejos de proteínas de múltiples subunidades de MxA humano Usando no desnaturalizante en gel de poliacrilamida-electroforesis

El objetivo general de este experimento es determinar el número de subunidades en complejos proteicos homooligoméricos en lisados celulares utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico no desnaturalizante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, como el estado oligomérico de proteínas implicadas en procesos celulares fundamentales. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere la purificación de los complejos proteicos homooligoméricos ni equipos especializados y costosos.

Por lo tanto, puede realizarse en la mayoría de los laboratorios. Este experimento utiliza dos tipos de células: células A549 que expresan la proteína de resistencia a mixovirus A, o MxA, de forma endógena; y virocélulas que sobreexpresan MxA.

Siembre las células A549 y las virocélulas en placas de seis pocillos con dos mililitros de medio de crecimiento por pocillo. Incube las células durante la noche en una incubadora de cultivo celular. Al día siguiente, recolecte las células.

Lave cada pocillo con un mililitro de PBS y desprenda las células añadiendo 0,5 mililitros de solución de tripsina-EDTA al 0,25 % durante aproximadamente cinco minutos a temperatura ambiente. Tan pronto como las células se desprendan del recipiente, añada 0,5 mililitros de medio de crecimiento y mezcle cuidadosamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera las células de cada pocillo a un tubo de dos mililitros y forme un precipitado mediante centrifugación en una centrífuga de sobremesa.

Retire cuidadosamente el sobrenadante mediante pipeteo sin perturbar el botón celular. Lave las células añadiendo un mililitro de PBS frío con hielo y pipeteando suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo. Precipite las células en una centrífuga de sobremesa.

Retire cuidadosamente el sobrenadante mediante pipeteo sin desprender el botón celular. Añada 200 microlitros de tampón de lisis frío con hielo, resuspenda las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo, y luego coloque en hielo. Proteja inmediatamente el lisado de la luz cubriendo los tubos con papel de aluminio, ya que el yodacetamida en el tampón de lisis es sensible a la luz.

Incubar en hielo durante 30 minutos. El uso de iodoacetamida es crucial porque la iodoacetamida protege de forma irreversible el grupo tiol de las cisteínas libres mediante la formación de un enlace tioléter y evita la agregación proteica artificial. A continuación, eliminar los restos celulares mediante centrifugación en una centrífuga de sobremesa previamente enfriada.

Durante la centrifugación, prepare columnas de diálisis con un límite de peso molecular de 10.000. Fije las columnas de diálisis a una boya flotante y colóquelas en un vaso de precipitados lleno con tampón de diálisis previamente enfriado para equilibrar las columnas. No toque la membrana.

Coloque un agitador magnético en un vaso de precipitados y transfiera el vaso a la cámara fría. Utilice el agitador magnético para asegurar una agitación suave y equilibre durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Después de 20 minutos, retire las columnas del tampón de diálisis y de la boya flotante.

Transfiera los lisados clarificados a las columnas de diálisis preparadas mediante pipeteo sin tocar la membrana. Fije las columnas a una boya flotante. Colóquelas nuevamente en el vaso de precipitados lleno con tampón de diálisis y luego transfiera el vaso de precipitados a la cámara fría.

Dialice el lisado durante al menos cuatro horas a cuatro grados Celsius mientras agita cuidadosamente con un agitador magnético para eliminar metabolitos pequeños y sales que podrían interferir con la electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante. Una vez completado el dializado, transfiera cada muestra dializada a un tubo de 1.5 mililitros. Elimine los precipitados mediante centrifugación en una centrifugadora de mesa.

La electroforesis debe realizarse inmediatamente después de la diálisis de los lisados para evitar la disociación de los complejos proteicos oligoméricos. Llene las cámaras de gel interna y externa con tampón de corrida previamente enfriado. Realice una corrida previa del gel de poliacrilamida no desnaturalizante con tampón de corrida previamente enfriado a 25 miliamperios por gel durante 15 minutos a cuatro grados Celsius.

Mezcle 15 microlitros del lisado preparado con cinco microlitros de tampón de muestra 4X. Cargue un patrón de proteína nativa de elección y 15 microlitros de muestra en el gel. Corra el gel a 25 miliamperios durante cuatro horas a cuatro grados Celsius.

Cuando finalice la electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante, desarme el gel y transfiéralo cuidadosamente al tampón de SDS. Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. Prepare dos esponjas, cuatro hojas de papel filtro de celulosa y una membrana de transferencia por cada gel, y sumérjalas en el tampón de transferencia.

Arme el sándwich de la siguiente manera, de abajo hacia arriba: una esponja, dos hojas de papel filtro de celulosa, una membrana para transferencia, el gel, dos hojas de papel filtro de celulosa y una esponja. Coloque el sándwich en el tanque de transferencia, asegurándose de que la membrana quede frente al polo positivo y el gel frente al polo negativo.

Llene el tanque de transferencia con tampón de transferencia previamente enfriado. Para obtener los mejores resultados en la transferencia de proteínas, realice la electrotransferencia a 90 miliamperios durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, desarme el sándwich.

Incube la membrana en solución de Ponceau S durante cinco minutos a temperatura ambiente para visualizar el patrón de proteínas. Revele la membrana colocándola en agua desionizada y lavándola. Después de transferir la membrana a una bandeja, marque las bandas del patrón de proteínas utilizando un bolígrafo.

Bloquee la membrana con tampón de bloqueo durante al menos una hora a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius. Posteriormente, las proteínas de interés se visualizan mediante inmunotinción utilizando un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra MxA, como se describe en el protocolo del texto. Las virocélulas que carecen de MxA endógena se transfectaron con MxA recombinante de tipo silvestre y con variantes de MxA monomérico y dimérico.

La migración de la variante recombinante de MxA en su peso molecular esperado confirmó su estado oligomérico. La MxA de tipo silvestre expresada ectópicamente migró como un tetrámero. Estas proteínas recombinantes se utilizaron posteriormente para evaluar el estado oligomérico de la proteína MxA humana endógena derivada de células A549 estimuladas con interferón-alfa.

El resultado reveló que el tamaño de MxA en lisados de células A549 estimuladas con interferón-alfa corresponde a un tetrámero. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un día y medio si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar no congelar ni descongelar las muestras durante todo el procedimiento, ya que esto podría destruir las interacciones proteicas o causar agregaciones proteicas.

Además, al trabajar con reactivos sensibles a la luz, como la iodoacetamida, es importante proteger las muestras de la luz durante el paso de lisis. Tras la electroforesis en gel no desnaturalizante en condiciones de SDS-PAGE, se pueden realizar otros métodos como la extracción de proteínas a partir de geles, la actividad enzimática AsiS o una electroforesis en segunda dimensión, con el fin de responder preguntas adicionales, como la actividad enzimática y la caracterización de posibles complejos hetero-oligoméricos. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploraran la composición de complejos proteicos oligoméricos en células en cultivo.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar lisados celulares a partir de cultivos celulares para estudiar proteínas oligoméricas en análisis mediante electroforesis en gel en condiciones nativas (PAGE). No olvide que trabajar con iodoacetamida puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como usar guantes y protección ocular.