Name: Caracterización de complejos de proteínas de múltiples subunidades de MxA humano Usando no desnaturalizante en gel de poliacrilamida-electroforesis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprende a caracterizar complejos oligoméricos de proteínas MxA humanas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante y western blot en lisados celulares de células A549.

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Este trabajo fue financiado por una beca de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (Subvención nr. 31003A_143834) a JP.

NOTA: Este protocolo se basa en el protocolo de PAGE no desnaturalizante publicado previamente 12. En ese estudio, el estado oligomérico de la proteína MxA se evaluó mediante cualquiera de las células Vero que sobreexpresan MxA o células A549 IFN-alfa estimulada que expresan endógeno MxA. El protocolo se describe a continuación se puede utilizar para analizar el estado oligomérico de cualquier proteína, además de MxA. Sin embargo, puede ser necesaria una mayor optimización. 1. Preparación de la célula lisado de PAGE no desnaturalizante NOTA: Para analizar el estado oligomérico de la proteína MxA humana en células Vero o A549, se recogieron 1,0 x 10 6 células. Dependiendo del tipo de célula o la abundancia de la proteína a analizar, el número de células se debe ajustar. También es importante proteger el tampón de lisis de exposición a la luz, tan pronto como se añade el yodoacetamida sensible a la luz. <ol><li> Seed 0,3 x 10 6 A549 o Vero células por pocillo en6 pocillos platos. Mantener las células en 2 ml de medio de crecimiento por pocillo (véase la Tabla 1). Se incuban las células durante la noche en una incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% de CO 2). </li><li> Recoger las células por lavado con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y separar por adición de ácido etilendiaminotetraacético tripsina 0,5 ml de 0,25% (EDTA) 1x solución durante aproximadamente 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Tan pronto como las células desprenden de la placa, añadir 0,5 ml de medio de crecimiento y se mezcla cuidadosamente con la pipeta arriba y abajo. </li><li> Transferencia de las células de cada pocillo en un tubo de 2 ml y sedimentar ellos utilizando una centrífuga de mesa (5000 xg, 4 ° C, 5 min). </li><li> Retirar con cuidado el sobrenadante mediante pipeteo y sin alterar el sedimento celular. </li><li> Se lavan las células con PBS 1 ml de hielo-frío pipeteando cuidadosamente la suspensión de células arriba y abajo. </li><li> Precipitar las células en una centrífuga de mesa (5.000 xg, 4 ° C, 5 min). </li><li> Retirar con cuidado el sobrenadante con la pipeta wiThout separar el sedimento celular. </li><li> Resuspender las células en 200 helado buffer de lisis l (véase la Tabla 1) pipeteando arriba y abajo y poner en hielo. </li><li> Inmediatamente, proteger lisado de la luz cubriendo los tubos usando papel de aluminio y se incuba durante 30 minutos en hielo. NOTA: Después de la incubación durante 30 min en hielo, ya no es esencial para proteger el lisado de exposición a la luz, ya que la protección de los grupos tiol libres es irreversible. </li><li> Eliminar los restos celulares por centrifugación en una centrífuga de mesa de pre-enfriado (13.000 xg, 4 ° C, 20 min). </li><li> Equilibrar columnas de diálisis en tampón de diálisis (Tabla 1) en el cuarto frío a 4 ° C durante 20 min durante la etapa de centrifugación. Utilizar una columna con un corte de peso molecular de 10.000. <ol><li> Una las columnas a una boya flotante y ponerlos en un vaso lleno de tampón de diálisis. Para asegurar una agitación suave, usar un agitador magnético. No toque la membrana. NOTA: Dialysse columnas se pueden comprar o preparar a partir de tubos de 1,5 ml de acuerdo con el protocolo descrito por Fiala y compañeros de trabajo 19. </li></ol></li><li> Retirar las columnas del tampón de diálisis y la boya de flotación. La transferencia de los lisados ​​de inmediata disposición en la columna de la diálisis preparada con la pipeta sin tocar la membrana. Una las columnas a una boya flotante y volver a ponerlos en el vaso lleno de tampón de diálisis. </li><li> Se dializa el lisado en un vaso de precipitados que contiene tampón de diálisis enfriado con hielo (Tabla 1) durante al menos 4 h (o preferiblemente durante la noche) a 4 ° C mientras se agitaba cuidadosamente usando un agitador magnético. Use al menos 100 ml de tampón de diálisis durante un lisado de 200 l. </li><li> Transferir la muestra dializada en un tubo de 1,5 ml. Eliminar precipitados por centrifugación en una centrífuga de mesa (13.000 xg, 4 ° C, 20 min). Para evitar la disociación de la proteína oligomérica complejos continúan con el protocolo (sección 2) inmediatamente después de la diálisis. No congelarlos lisados ​​preparados. </li></ol> 2. Electroforesis NOTA: La electroforesis se realizó como se ha descrito antes con algunas modificaciones 22. En el protocolo descrito a continuación, se utilizaron geles de gradiente premoldeados (4-15% de gradiente). Alternativamente, los geles se pueden preparar en el laboratorio. Es muy importante excluir cualquier agente desnaturalizante tal como SDS para evitar la disociación de los complejos de proteínas oligoméricas. Tiempo de electroforesis se ha optimizado para los diferentes estados oligoméricos de la proteína MxA humano. Sin embargo, puede variar para otras proteínas, dependiendo del tamaño del complejo oligomérico, así como la gama de separación que se supone que deben alcanzarse para analizar el complejo. Por lo tanto, el momento óptimo de la electroforesis se debe determinar empíricamente. Para una resolución óptima de los oligómeros a analizar la corriente no debe exceder de 25 mA. <ol><li> Montar el gel PAGE no desnaturalizante en gel de la cámara. llenar tél cámara interior y exterior con tampón de pre-enfriado (Tabla 1). </li><li> Pre-ejecutar el gel con tampón de funcionamiento previamente enfriada a 25 mA por gel durante 15 minutos en la sala fría a 4 ° C. </li><li> Mezclar 15 l de los lisados preparados anteriormente con 5 l de tampón de muestra 4x (Tabla 1). No hierva la muestra. </li><li> Cargar 15 l de muestra y un estándar de proteína nativa de elección en el gel. Correr el gel a 25 mA durante 4 horas en la cámara frigorífica a 4 ° C. NOTA: Para los análisis semi-cuantitativo, un protocolo de cuantificación de proteínas (por ejemplo, un ensayo de proteínas Bradford 23) se puede realizar con el fin de asegurar una carga de cantidades iguales de proteína total por carril. </li></ol> 3. Western Blot NOTA: A continuación se describe el protocolo de un sistema de transferencia de western húmedo. Cualquier membrana de transferencia se puede utilizar. Activar fluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas en 100% de metanol antes de la equilibración en secante buffer. La técnica de western blot semi-seco se puede utilizar como alternativa, pero tiene que ser optimizado para grandes complejos oligoméricos. <ol><li> Desmontar el gel y transferir con cuidado en tampón SDS (Tabla 1). </li><li> Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente mientras se agita suavemente. </li><li> Preparar 2 esponjas, 4 hojas de papel de filtro de celulosa y una membrana de transferencia por gel. Remojar en tampón secante (Tabla 1). </li><li> Montar el sándwich de la siguiente manera (abajo a arriba): 1 esponja, hojas de papel de filtro 2 de celulosa, membrana, gel, hojas de papel de filtro de celulosa 2, 1 esponja. </li><li> Ponga el sándwich en el tanque de transferencia. Asegúrese de que la membrana se enfrenta al polo positivo, mientras que el gel se enfrenta al polo negativo. </li><li> Llenar el depósito secante con tampón de transferencia enfriado previamente. </li><li> Seque a 90 mA durante la noche a 4 ° C para obtener los mejores resultados de la transferencia de proteínas. </li><li> Desmontar el sándwich y visualizar el nivel de proteínas mediante la incubación de la membrana en Poncsolución eau S durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Destain la membrana lavando cuidadosamente el Ponceau S con agua desionizada hasta que pueda ver claramente las bandas de la proteína estándar. </li><li> Marcar las bandas del patrón de proteína utilizando una pluma. NOTA: Residual Ponceau S puede interferir con la inmunotinción. Para evitar esto, la membrana se puede destiñó además por incubación en NaOH 0,1 M durante 1 min y posterior lavado con agua desionizada. </li><li> Bloquear la membrana con tampón de bloqueo (véase la Tabla 1) durante al menos 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. </li><li> Visualizar proteína (s) de interés mediante inmunotinción usando anticuerpos dirigidos contra la proteína a analizar. NOTA: La proteína MxA humano se visualizó utilizando el anticuerpo policlonal de conejo específico para Mx1 humano diluido 1: 1000 en tampón de bloqueo (Tabla 1). La solución de anticuerpo se incubó durante la noche a 4 ° C. Alternativamente, el monoclonal unanti-MxA anticuerpo (clon 143) se puede utilizar (datos no mostrados) 24. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí se describe un método sencillo que permite la rápida determinación del estado oligomérico de proteínas expresadas en células de mamífero por PAGE no desnaturalizante seguido de análisis de transferencia de Western. La principal ventaja de este enfoque es que el estado oligomérico de una proteína dada se puede determinar a partir de lisados ​​de células enteras sin purificación de la proteína anterior. Esto puede ser importante para las proteínas que oligomerizar o ejercen su función en asociación con factores auxil...

La estructura cuaternaria de una proteína juega un papel crucial en muchos procesos celulares. Vías de señalización, la expresión del gen de la enzima, y la activación / desactivación de todos se basan en el correcto montaje de complejos de proteínas 1-4. Este proceso también conocido como homo- o hetero-oligomerización se debe a covalente irreversible o interacciones proteína-proteína electrostáticas e hidrofóbicas reversibles. La oligomerización no sólo diversifica los diferentes procesos celulares sin aumentar el tamaño del genoma, sino que también proporciona una estrategia para las proteínas para construir complejos estables que son más resistentes a la desnaturalización y la degradación 5. Los defectos en la oligomerización tienen un impacto en la función de las proteínas y pueden conducir al desarrollo de enfermedades. Por ejemplo, la enzima fenilalanina hidroxilasa forma un complejo tetrámero. Algunas mutaciones dentro del complejo de proteínas pueden debilitar la formación de tetrámeros y conducir a la enfermedad fenilcetonuria 6. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; La proteína MxA humano es un interferón (IFN) inducida por proteína efectora antiviral ejerciendo una amplia actividad antiviral contra diversos RNA, así como los virus de ADN 7. Pertenece a la superfamilia de GTPasas grandes dynamin-como y tiene la capacidad de formar grandes estructuras oligoméricas in vitro 8. La oligomerización se ha sugerido para proteger MxA de degradación rápida 9,10. A pesar de intensos esfuerzos de muchos grupos de investigación, el mecanismo molecular de acción sigue siendo difícil de alcanzar en gran medida y el papel del estado de oligomerización de MxA para su función antiviral es objeto de debate 9,11,12. En este sentido, Gao y colaboradores propusieron un modelo en el que MxA ejerce su actividad antiviral mediante la interacción con nucleoproteínas virales en forma de grandes estructuras oligoméricas de anillo 11. Sin embargo, más recientemente, hemos demostrado que los dímeros MXa exhiben actividad antiviral e interactuar con la nucleoproteína del virus de influenza A 12. segundoobre la base de la estructura cristalina de MxA, Gao y colaboradores identificaron varios residuos de aminoácidos en las regiones de interfaz que son críticos para su oligomerización in vitro y su función antiviral 11,13. Por lo tanto, con el fin de dilucidar el cual oligomérica estado de MxA ejerce una actividad antiviral, hemos tratado de establecer un protocolo sencillo para determinar rápidamente el estado oligmeric de mutantes de interfaz MXa expresadas en las células humanas, así como endógenas MxA expresó después de la estimulación IFN. Aunque hay muchas técnicas que se utilizan comúnmente para investigar la interacción entre las proteínas tales como la proteína de split-verde fluorescente (split-GFP) ensayo de complementación 14, la resonancia de plasmón de superficie 15 y Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) 16, que no proporcionan la información de la estequiometría exacta de un complejo de proteínas oligoméricas. Para la investigación de este aspecto particular, las técnicas tales comodispersión de luz multiángulo (MALS) 17 y 18 de ultracentrifugación analítica son muy útiles. Por lo general, las proteínas analizadas usando estos métodos son proteínas purificadas. procesos de oligomerización también pueden depender de otros factores celulares. Si estos factores son desconocidos, el análisis es más difícil. Además, algunas proteínas son difíciles de expresar en E. coli y de purificar. Por lo tanto, estos métodos no son la elección óptima para analizar la oligomerización de proteínas en el medio ambiente celular. Además, estas técnicas requieren instrumentos caros que no son fácilmente disponibles. La no electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida (PAGE), cromatografía de exclusión por tamaño o reticulación química seguido de dodecil sulfato de sodio convencional -PAGE (SDS) son herramientas útiles para la caracterización de la formación de oligómeros a partir de lisados de células 2,19,20. Estos métodos no requieren equipo especializado y pueden ser fácilmente performed en un laboratorio estándar. Inicialmente se evaluaron varios protocolos de reticulación químicos que invariantly llevaron a la agregación y precipitación de MxA no específica. Por lo tanto, próximo a prueba los protocolos PAGE no desnaturalizante. Como PAGE no desnaturalizante excluye el uso de SDS, la migración de las proteínas depende de su carga nativo. PÁGINA Blue-nativo utiliza Coomassie G250 azul brillante para cargar las proteínas con una carga global negativa, similar a SDS, pero no desnaturaliza la proteína 21. Desafortunadamente, Coomassie precipitados azules brillantes de la presencia de niveles altos de sales y cationes divalentes (por ejemplo, Mg 2+) que a menudo se incluyen en tampones de lisis. Dependiendo de los tampones usados, puede ser difícil de analizar la muestra sin una mayor optimización de pasos que podrían tener un efecto en el complejo de proteína oligomérica. Aquí se presenta un protocolo simple basado en un método previamente publicado 22 para determinar oligomerización deMxA proteína humana derivada de lisados ​​celulares usando PAGE no desnaturalizante.

<table><tbody><tr><td>Unidades de diálisis Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0,5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69570</td><td>Preequilibrio en tampón de diálisis (si se desea eliminar el glicerol) Puede ser de fabricación propia según Fiala et al. 2011</td></tr><tr><td>4&ndash; 15% Mini-PROTEAN TGX Geles de proteínas prefabricadas, 10 pocillos,Bio-Rad</td><td></td> <td>456-1083</td><td>Pre-ejecución en tampón en funcionamiento para ajustar el sistema de tampón</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, sin EDTA</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11836170001</td><td>utilizar 1 comprimido por 50 ml</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4&nbsp; frasco de 500 ml Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S solución</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td><fuerte>TÓXICO</fuerte> use guantes y proteja los ojos</td></tr><tr><td>NativeMark Unstained Protein Standard&nbsp; 50 &micro; l</td><td>Invitrogen</td><td>N/P 57030</td><td>carga 5 y micro; l/pozo</td></tr><tr><td>A549 células</td><td>ATCC ATCC</td><td>CCL185</td><td>Crecer en medio de crecimiento (ver <fuerte>Tabla 1</fuerte>)</td></tr><tr><td>Células Vero</td><td>ATCC ATCC</td><td>CCC81</td><td>Crecer en medio de crecimiento (ver <fuerte>Tabla 1</fuerte>)</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-Mx1</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00004599_D01P</td><td>Uso en una dilución de 1:1.000</td></tr><tr><td>ECL Anti-IgG anti-conejo, rábano picante Anticuerpo entero ligado a la peroxidasa (de burro)</td><td>GE-Healthcare</td><td>NA934V</td><td>Úselo en una dilución 1:10.000</td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA (1x)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Life Technologies</td><td>Thermo Fisher</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Yodoacetamida&nbsp; &nbsp; 5 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6125</td><td>culata&nbsp; 100 mM</td></tr><tr><td>Bromphenolblue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td> DMEM +4.5g<td></td></tr><tr><td>/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Pen&nbsp; Estreptococo 100 x&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 100 ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; life technologies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140 - 130</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x Caldo, 100 ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; life technologies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>350500-038</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, dializado, EE. UU. Origen 500 ml Gibco Lote:42G9552K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro de celulosa</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>membrana de transferencia de PVDF</td><td>GE-Healthcare 10600022</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano</td><td>Biosolve</td><td>0020092391BS</td><td></td></tr><tr><td>fluoruro de sodio (NaF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-7920</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492015</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, sin EDTA</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11836170001</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Calbiochem</td><td>6555204</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS 10% solución</td><td>Amresco</td><td>N907</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Biosolve</td><td>0007132391BS</td><td></td></tr><tr><td>ortovanadato sódico (Na3VO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-Glicerofosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Leche en polvo</td><td>Migros/Suiza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Millipore</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de magnesio (MgCl2)</td><td>Amresco</td><td>288</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de dodecilo de sodio (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-8045</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterización de complejos de proteínas de múltiples subunidades de mxa humano usando no desnaturalizante en gel de poliacrilamida-electroforesis

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

La formación de complejos oligoméricos es un requisito previo crucial para la estructura y función adecuadas de muchas proteínas. La proteína efectora antiviral MxA inducida por interferón ejerce una amplia actividad antiviral contra muchos virus. MxA es una GTPasa similar a la dinamina y tiene la capacidad de formar estructuras oligoméricas de orden superior. Sin embargo, si la oligomerización de MxA es necesaria para su actividad antiviral es un tema de debate. Describimos aquí un protocolo sencillo para evaluar el estado oligomérico de MxA expresado endógena o ectópicamente en la fracción citoplasmática de líneas celulares humanas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante (PAGE) en combinación con análisis de Western blot. Un paso crítico del protocolo es la elección de detergentes para evitar la agregación y/o precipitación de proteínas particularmente asociadas con membranas celulares como MxA, sin interferir con su actividad enzimática. Otro aspecto crucial del protocolo es la protección irreversible de los grupos tiol libres de los residuos de cisteína mediante yodoacetamida para evitar interacciones artificiales de la proteína. Este protocolo es adecuado para una evaluación sencilla del estado oligomérico de MxA y, además, permite una correlación directa de la actividad antiviral de los mutantes de la interfaz MxA con sus respectivos estados oligoméricos.

Usando PAGE no desnaturalizante, se analizó el estado oligomérico de la naturaleza humana tipo MxA, los mutantes de interfaz dimérica MxA (R640A) y MxA (L617D), así como el mutante interfaz monomérica MxA (M527D) a partir de lisados celulares 12. Las células se lisaron en un tampón que contiene 1% octilfenoxipolietoxietanol (NP-40) y yodoacetamida para asegurar la solubilización de proteínas y la protección de los grupos tiol libres (véase la figura 1). Como se ha descrito antes, la sal y peq...

Este artículo describe un protocolo simple y rápido para evaluar el estado oligomérico de la proteína GTPasa MxA similar a la dinamina a partir de lisados de células humanas utilizando una combinación de PAGE no desnaturalizante con análisis de Western blot.

Caracterización de complejos de proteínas de múltiples subunidades de MxA humano Usando no desnaturalizante en gel de poliacrilamida-electroforesis

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

El objetivo general de este experimento es determinar el número de subunidades en complejos proteicos homooligoméricos en lisados celulares utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico no desnaturalizante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, como el estado oligomérico de proteínas implicadas en procesos celulares fundamentales. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere la purificación de los complejos proteicos homooligoméricos ni equipos especializados y costosos.Por lo tanto, puede realizarse en la mayoría de los laboratorios. Este experimento utiliza dos tipos de células: células A549 que expresan la proteína de resistencia a mixovirus A, o MxA, de forma endógena; y virocélulas que sobreexpresan MxA.Siembre las células A549 y las virocélulas en placas de seis pocillos con dos mililitros de medio de crecimiento por pocillo. Incube las células durante la noche en una incubadora de cultivo celular. Al día siguiente, recolecte las células.Lave cada pocillo con un mililitro de PBS y desprenda las células añadiendo 0,5 mililitros de solución de tripsina-EDTA al 0,25 % durante aproximadamente cinco minutos a temperatura ambiente. Tan pronto como las células se desprendan del recipiente, añada 0,5 mililitros de medio de crecimiento y mezcle cuidadosamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera las células de cada pocillo a un tubo de dos mililitros y forme un precipitado mediante centrifugación en una centrífuga de sobremesa.Retire cuidadosamente el sobrenadante mediante pipeteo sin perturbar el botón celular. Lave las células añadiendo un mililitro de PBS frío con hielo y pipeteando suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo. Precipite las células en una centrífuga de sobremesa.Retire cuidadosamente el sobrenadante mediante pipeteo sin desprender el botón celular. Añada 200 microlitros de tampón de lisis frío con hielo, resuspenda las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo, y luego coloque en hielo. Proteja inmediatamente el lisado de la luz cubriendo los tubos con papel de aluminio, ya que el yodacetamida en el tampón de lisis es sensible a la luz.Incubar en hielo durante 30 minutos. El uso de iodoacetamida es crucial porque la iodoacetamida protege de forma irreversible el grupo tiol de las cisteínas libres mediante la formación de un enlace tioléter y evita la agregación proteica artificial. A continuación, eliminar los restos celulares mediante centrifugación en una centrífuga de sobremesa previamente enfriada.Durante la centrifugación, prepare columnas de diálisis con un límite de peso molecular de 10.000. Fije las columnas de diálisis a una boya flotante y colóquelas en un vaso de precipitados lleno con tampón de diálisis previamente enfriado para equilibrar las columnas. No toque la membrana.Coloque un agitador magnético en un vaso de precipitados y transfiera el vaso a la cámara fría. Utilice el agitador magnético para asegurar una agitación suave y equilibre durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Después de 20 minutos, retire las columnas del tampón de diálisis y de la boya flotante.Transfiera los lisados clarificados a las columnas de diálisis preparadas mediante pipeteo sin tocar la membrana. Fije las columnas a una boya flotante. Colóquelas nuevamente en el vaso de precipitados lleno con tampón de diálisis y luego transfiera el vaso de precipitados a la cámara fría.Dialice el lisado durante al menos cuatro horas a cuatro grados Celsius mientras agita cuidadosamente con un agitador magnético para eliminar metabolitos pequeños y sales que podrían interferir con la electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante. Una vez completado el dializado, transfiera cada muestra dializada a un tubo de 1.5 mililitros. Elimine los precipitados mediante centrifugación en una centrifugadora de mesa.La electroforesis debe realizarse inmediatamente después de la diálisis de los lisados para evitar la disociación de los complejos proteicos oligoméricos. Llene las cámaras de gel interna y externa con tampón de corrida previamente enfriado. Realice una corrida previa del gel de poliacrilamida no desnaturalizante con tampón de corrida previamente enfriado a 25 miliamperios por gel durante 15 minutos a cuatro grados Celsius.Mezcle 15 microlitros del lisado preparado con cinco microlitros de tampón de muestra 4X. Cargue un patrón de proteína nativa de elección y 15 microlitros de muestra en el gel. Corra el gel a 25 miliamperios durante cuatro horas a cuatro grados Celsius.Cuando finalice la electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante, desarme el gel y transfiéralo cuidadosamente al tampón de SDS. Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. Prepare dos esponjas, cuatro hojas de papel filtro de celulosa y una membrana de transferencia por cada gel, y sumérjalas en el tampón de transferencia.Arme el sándwich de la siguiente manera, de abajo hacia arriba: una esponja, dos hojas de papel filtro de celulosa, una membrana para transferencia, el gel, dos hojas de papel filtro de celulosa y una esponja. Coloque el sándwich en el tanque de transferencia, asegurándose de que la membrana quede frente al polo positivo y el gel frente al polo negativo.Llene el tanque de transferencia con tampón de transferencia previamente enfriado. Para obtener los mejores resultados en la transferencia de proteínas, realice la electrotransferencia a 90 miliamperios durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, desarme el sándwich.Incube la membrana en solución de Ponceau S durante cinco minutos a temperatura ambiente para visualizar el patrón de proteínas. Revele la membrana colocándola en agua desionizada y lavándola. Después de transferir la membrana a una bandeja, marque las bandas del patrón de proteínas utilizando un bolígrafo.Bloquee la membrana con tampón de bloqueo durante al menos una hora a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius. Posteriormente, las proteínas de interés se visualizan mediante inmunotinción utilizando un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra MxA, como se describe en el protocolo del texto. Las virocélulas que carecen de MxA endógena se transfectaron con MxA recombinante de tipo silvestre y con variantes de MxA monomérico y dimérico.La migración de la variante recombinante de MxA en su peso molecular esperado confirmó su estado oligomérico. La MxA de tipo silvestre expresada ectópicamente migró como un tetrámero. Estas proteínas recombinantes se utilizaron posteriormente para evaluar el estado oligomérico de la proteína MxA humana endógena derivada de células A549 estimuladas con interferón-alfa.El resultado reveló que el tamaño de MxA en lisados de células A549 estimuladas con interferón-alfa corresponde a un tetrámero. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un día y medio si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar no congelar ni descongelar las muestras durante todo el procedimiento, ya que esto podría destruir las interacciones proteicas o causar agregaciones proteicas.Además, al trabajar con reactivos sensibles a la luz, como la iodoacetamida, es importante proteger las muestras de la luz durante el paso de lisis. Tras la electroforesis en gel no desnaturalizante en condiciones de SDS-PAGE, se pueden realizar otros métodos como la extracción de proteínas a partir de geles, la actividad enzimática AsiS o una electroforesis en segunda dimensión, con el fin de responder preguntas adicionales, como la actividad enzimática y la caracterización de posibles complejos hetero-oligoméricos. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploraran la composición de complejos proteicos oligoméricos en células en cultivo.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar lisados celulares a partir de cultivos celulares para estudiar proteínas oligoméricas en análisis mediante electroforesis en gel en condiciones nativas (PAGE). No olvide que trabajar con iodoacetamida puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como usar guantes y protección ocular.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

En este video, se describe la caracterización de los complejos multiproteicos (PSM) por el azul electroforesis nativa en gel de poliacrilamida (BN-PAGE). En una primera dimensión, se dializan lisados ​​celulares están separados por BN-PAGE para identificar PSM individual. En una segunda dimensión SDS-PAGE, PSM de interés se subdividen para analizar sus componentes por inmunotransferencia.

Azul nativos electroforesis en gel de poliacrilamida (BN-PAGE) para el análisis de los complejos Multiproteinas de lisados ​​celulares

Este video muestra una técnica de separación de proteínas basada en poliacrilamida desnaturalizante. Esta técnica ayuda en la identificación preliminar de proteínas en función de sus pesos moleculares.

Electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio para el análisis de proteínas: una técnica para separar y visualizar proteínas basada en el peso molecular

Este video describe PAGE multimérico para separar complejos de proteínas nativas de homogeneizados de tejidos. La técnica es un híbrido de las técnicas blue native-PAGE y SDS-PAGE. Los complejos separados pueden caracterizarse y estudiarse por su papel en el funcionamiento celular.

Multimer-PAGE para separar complejos de proteínas nativas: una técnica de separación híbrida que consiste en Blue Native-PAGE y SDS-PAGE para separar proteínas multiméricas intactas del lisado de tejidos.

En este video, demostramos un método de electroforesis en gel bidimensional que separa proteínas individuales de una mezcla compleja de proteínas obtenidas de tejidos tumorales de adenoma hipofisario humano no funcional (NFPA). Las proteínas se separan en función de su carga eléctrica en la primera dimensión y se separan aún más en función de los pesos moleculares en la segunda dimensión.

Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida: una técnica de separación para el análisis de proteínas en mezclas complejas de proteínas basada en la carga y el peso molecular

Las mucinas son glicoconjugados de alto peso molecular, con un tamaño que oscila entre 0,2 y 200 megadalton (MDa). Debido a su tamaño, las mucinas no penetran en los geles de poliacrilamida convencionales y requieren poros más grandes para su separación. Proporcionamos un protocolo detallado para la electroforesis en gel de mucina agarosa para evaluar la cuantificación relativa y estudiar el ensamblaje de polímeros.

La mucina en gel de agarosa de electroforesis: Western Blotting para glicoproteínas de alta peso molecular

La oligomerización del receptor de rianodina, un canal iónico homotetrámero que media la liberación de Ca2+ de las reservas intracelulares, es fundamental para la contracción del músculo esquelético y cardíaco. Aquí, presentamos métodos complementarios in vivo e in vitro para detectar la autoasociación de proteínas y determinar la estequiometría de homooligómeros.

Los enfoques genéticos y bioquímicos para<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; In Vitro</em&gt; Evaluación de la oligomerización de proteínas el receptor de rianodina Estudio de caso

Un método para estabilizar y separar los complejos de proteínas nativas de lisado de tejido no modificado utilizando un proteína reticulante reactivo con amina acoplada a una novela de dos dimensiones electroforesis en gel de poliacrilamida se presenta sistema (PAGE).

Multímero-PAGE: Un método para capturar y Proteína Resolver Complejos en muestras biológicas

Aquí presentamos protocolos para la purificación por afinidad de los complejos de proteínas y su separación por PAGE nativa azul, seguido por la proteína de perfiles de correlación utilizando etiqueta espectrometría de masa libre cuantitativo. Este método es útil para resolver interactomes en complejos de proteínas distintas.

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

Este protocolo describe la separación de complejos funcionales de cadenas de transporte de electrones mitocondriales (Cx) IV y sus supercomplejos utilizando electroforesis nativa para revelar información sobre su ensamblaje y estructura. El gel nativo puede someterse a inmunotransferencia, ensayos en gel y purificación por electroelución para caracterizar adicionalmente los complejos individuales.

Análisis de supercomplexes de la cadena de transporte de electrones mitocondriales con electroforesis nativa, ensayos en gel y electroelución

Un protocolo para la aclaración de planta tilacoides proteína compleja organización y composición con poliacrilamida nativa azul gel electroforesis (BN-PAGE) y 2D-SDS-PAGE se describe. El protocolo está optimizado para Arabidopsis thaliana, , pero puede ser utilizado para otras especies de plantas con modificaciones menores.

Análisis de los complejos de la proteína de membrana de tilacoides por electroforesis nativa azul

Este protocolo describe la combinación de cromatografía de exclusión de tamaño con dispersión de luz multiángulo (SEC-MALS) para la caracterización absoluta de proteínas y complejos en solución. SEC-MALS determina el peso molecular y el tamaño de proteínas puras, oligómeros nativos, heterocomplejos y proteínas modificadas como glicoproteínas.

Caracterización de proteínas por cromatografía de exclusión de tamaño acoplada a dispersión de luz multiángulo (SEC-MALS)

Aprende a caracterizar complejos oligoméricos de proteínas MxA humanas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante y western blot en lisados celulares de células A549.

Caracterización de complejos de proteínas de múltiples subunidades de MxA humano Usando no desnaturalizante en gel de poliacrilamida-electroforesis (Video) | JoVE Journal

Caracterización de complejos de proteínas de múltiples subunidades de MxA humano Usando no desnaturalizante en gel de poliacrilamida-electroforesis

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