Las perturbaciones de circulación miRNAs en el Síndrome del Intestino Irritable detectó utilizando una plataforma de expresión de genes de multiplexado de alto rendimiento

El objetivo general de este protocolo de cuantificación múltiple de ácidos nucleicos es cuantificar digitalmente la expresión de microARN en sangre total. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de los trastornos digestivos. Ayuda a identificar mecanismos moleculares desregulados y firmas de biomarcadores, como los microARN.

La principal ventaja de esta técnica es que la cuantificación de microARN no depende de la amplificación. Esta tecnología cuenta digitalmente objetivos moleculares y está en gran medida automatizada. Para purificar el ARN total, descongele e incube muestras de sangre entera previamente recolectadas y congeladas durante dos horas.

Utilice un rotor de cubo oscilante para centrifugar los tubos a 5.000 veces g a temperatura ambiente durante diez minutos. Luego, retire los sobrenadantes vertiéndolos o pipeteándolos con cuidado en un tubo de desechos, teniendo cuidado de no alterar el pellet. Agregue cuatro mililitros de agua libre de RNasa al pellet.

Vuelva a colocar de forma segura la tapa y el vórtice hasta que el pellet se disuelva visiblemente. A continuación, vuelve a centrifugar el tubo y retira el sobrenadante. A continuación, agregue 350 microlitros de tampón BM1 al pellet y al vórtice hasta que el pellet se disuelva visiblemente.

Luego, transfiera la muestra a un tubo de procesamiento de dos mililitros para la extracción automatizada de ARN total. Utilizando un kit de extracción de ARN disponible en el mercado, lleve a cabo una purificación automatizada del ARN intracelular, incluido el microARN de la muestra de sangre completa, cargando puntas de pipeta precargadas, tubos de centrífuga, tampones y reactivos proporcionados en el kit de purificación de ARN en el sistema robótico de extracción de ARN. En el menú de selección de protocolos, elija el protocolo Blood miRNA PartA e inicie la ejecución.

Complete la extracción de ARN y almacene las muestras de acuerdo con el protocolo de texto. Prepare muestras de microARN utilizando primero agua sin ARNasa para normalizar 12 muestras de ARN a 33 nanogramos por microlitro. Con agua sin nucleasas, prepare una dilución de 1 en 500 de los controles de microARN proporcionados en el kit de ensayo y manténgalo en hielo.

A continuación, prepare la mezcla maestra de recocido combinando 13 microlitros de tampón de recocido, 26 microlitros de reactivo micro R-tag y 6,5 microlitros de controles de microARN. A cada uno de los 12 tubos de tiras de 0,2 mililitros, agregue 3,5 microlitros de la mezcla maestra de recocido y luego agregue 3 microlitros de la muestra de ARN. Agite los tubos para mezclar, gírelos a 2000 g con una mini microcentrífuga de sobremesa y haga funcionar los tubos en un termociclador utilizando el siguiente programa.

A continuación, prepare una mezcla maestra de ligadura combinando tres microlitros de tampón de ligadura y 19,5 microlitros de PEG. A continuación, añade 2,5 microlitros de la mezcla maestra de ligadura a cada una de las reacciones. Después de mezclar y girar los tubos, devuélvalos al termociclador a 48 grados centígrados durante cinco minutos.

A continuación, añada un microlitro de ligasa directamente a cada muestra mientras aún está en el bloque termociclador, e incube los tubos utilizando el siguiente programa. Mezcle suavemente y gire los tubos, y agregue un microlitro de enzima de limpieza de ligadura a cada muestra. Luego, incube los tubos en el termociclador como se muestra aquí.

Después de la incubación, agregue 40 microlitros de agua libre de ARNasa a las muestras antes de mezclarlas y centrifugarlas. Para llevar a cabo la hibridación de microARN, descongele los conjuntos de sondas reporteras y de captura proporcionados en el hielo y hágalos girar. Agregue 130 microlitros de tampón de hibridación al Reporter Code Set 2 y mezcle para crear la mezcla maestra de hibridación.

En 12 nuevos tubos de tiras de 0,2 mililitros, agregue 20 microlitros de la mezcla maestra de hibridación. Desnaturaliza las muestras de microARN recién preparadas a 85 grados centígrados durante cinco minutos y enfríalas con hielo. A continuación, añada 5 microlitros de las muestras de microARN a cada uno de los tubos de tiras que contienen la mezcla maestra de hibridación.

Programe el termociclador a 65 grados Celsius, a una temperatura calculada por volumen de 30 microlitros, y la tapa calentada en la configuración de tiempo permanente para que no baje a 4 grados Celsius al final de la ejecución. Agregue 5 microlitros del juego de sondas de captura a cada tubo y mezcle. Luego, después de girarlos, coloque inmediatamente los tubos en el termociclador a 65 grados centígrados.

Incubar las muestras durante no menos de 12 horas y no más de 30 horas. Configure la estación de preparación calentando primero el cartucho y las placas a temperatura ambiente. A continuación, gira los platos.

Para cargar la estación de preparación, abra la puerta de la estación y cargue las placas de reactivos, el cartucho, las puntas de pipeta, las muestras preparadas en tubos de tiras de 0,2 mililitros y dos tubos vacíos de 12 tubos de 0,2 mililitros en las ubicaciones adecuadas del robot. Retire las tapas de los tubos de tiras y la cubierta de la placa de reactivo. A continuación, cierre la puerta de la estación de preparación y ejecute el ensayo adecuado desde el panel de control.

Para visualizar y contar los códigos de barras de los complejos tripartitos inmovilizados y orientados, retire el cartucho de la estación de preparación, utilice la cubierta provista para sellarlo y colóquelo en el analizador digital en cualquier ranura disponible. Utilice la pantalla táctil para crear un archivo de definición de cartucho o CDF. Asegúrese de que se asigna el archivo de biblioteca de informes adecuado a cada muestra de la CDF.

Una vez finalizado el escaneo, descargue los archivos de datos del analizador digital utilizando una unidad USB o por correo electrónico, antes de procesar y analizar los datos, de acuerdo con el control de calidad y el protocolo de análisis asociados. El sistema de ensayo de la plataforma de expresión génica reduce el ruido técnico gracias a su naturaleza altamente automatizada, y la química única que utiliza produce datos de expresión génica de alta precisión. Las réplicas técnicas que se muestran aquí demuestran la alta reproducibilidad en la cuantificación de la expresión de microARN endógeno y viral que es posible.

Con este método, los microARN humanos endógenos y codificados por virus que muestran una desviación de la expresión esperada, según lo definido por participantes sanos del estudio, pueden identificarse como objetivos de interés en el SII. La precisión y sensibilidad del método permite detectar perturbaciones entre objetivos de baja expresión, y también se pueden observar perturbaciones sutiles de forma fiable. Estas figuras muestran algunas de las perturbaciones en los microARN circulantes en el SII y los subtipos de SII, en comparación con los controles sanos.

Aquí se presentan los dos microARN diferencialmente elevados más significativos en los participantes con SII. Las curvas de este gráfico de violín indican la frecuencia de los recuentos de miR-150. Las barras verticales representan el primer y tercer cuartil y el cuadrado rojo indica el recuento mediano.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar ensayos personalizados más específicos basados en la misma tecnología para validar las firmas de biomarcadores en cohortes más grandes y explorar las asociaciones esenciales de ARN y proteínas. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación biomédica desarrollaran rápidamente, con precisión y exactitud, paneles de biomarcadores de diagnóstico para enfermedades.