Las perturbaciones de circulación miRNAs en el Síndrome del Intestino Irritable detectó utilizando una plataforma de expresión de genes de multiplexado de alto rendimiento
30 de noviembre de 2016
Describimos el uso de una plataforma de expresión génica multiplexada de alto rendimiento que cuantifica la expresión génica mediante códigos de barras y recuento de moléculas en sustratos biológicos sin necesidad de amplificación. Utilizamos la plataforma para cuantificar la expresión de microARN (miARN) en sangre total en sujetos con y sin síndrome de intestino irritable.
El objetivo general de este protocolo de cuantificación múltiple de ácidos nucleicos es cuantificar digitalmente la expresión de microARN en sangre total. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de los trastornos digestivos. Facilita la identificación de mecanismos moleculares desregulados y firmas de biomarcadores, como los microARN.
La principal ventaja de esta técnica es que la cuantificación de microARN no depende de la amplificación. Esta tecnología cuenta digitalmente los objetivos moleculares y es en gran parte automatizada. Para purificar el ARN total, descongele y incube muestras de sangre total previamente recolectadas y congeladas durante dos horas.
Utilice un rotor de cubeta oscilante para centrifugar los tubos a 5.000 ×g durante diez minutos a temperatura ambiente. Luego, elimine los sobrenadantes vertiendo cuidadosamente o pipeteando en un tubo de desecho, teniendo cuidado de no perturbar el precipitado. Añada cuatro mililitros de agua libre de RNasa al precipitado.
Cierre firmemente la tapa y vortexe hasta que el precipitado se disuelva visiblemente. Luego, centrifugue nuevamente el tubo y retire el sobrenadante. A continuación, agregue 350 microlitros de tampón BM1 al precipitado y vortexe hasta que el precipitado se disuelva visiblemente.
Luego, transfiera la muestra a un tubo de procesamiento de dos mililitros para la extracción automatizada de ARN total. Utilizando un kit de extracción de ARN disponible comercialmente, realice una purificación automatizada de ARN intracelular, incluyendo microARN, a partir de la muestra de sangre completa, cargando las puntas de pipeta precargadas, tubos centrífugos, tampones y reactivos proporcionados en el kit de purificación de ARN en el sistema robótico de extracción de ARN. En el menú de selección de protocolos, elija el protocolo Blood miRNA PartA e inicie la corrida.
Complete la extracción de ARN y almacene las muestras según el protocolo descrito en el texto. Prepare muestras de microARN utilizando primero agua libre de ARNasas para normalizar 12 muestras de ARN a 33 nanogramos por microlitro. Con agua libre de nucleasas, prepare una dilución 1:500 de los controles de microARN proporcionados en el kit de ensayo y manténgalos en hielo.
A continuación, prepare la mezcla maestra de hibridación combinando 13 microlitros de tampón de hibridación, 26 microlitros del reactivo micro R-tag y 6,5 microlitros de controles de microARN. A cada uno de 12 tubos tira de 0,2 mililitros, añada 3,5 microlitros de la mezcla maestra de hibridación y luego agregue 3 microlitros de la muestra de ARN. Agite suavemente los tubos para mezclar, céntrefuguelos a 2000 × g con una minicentrífuga de banco y ejecute los tubos en un termociclador utilizando el siguiente programa.
A continuación, prepare una mezcla maestra de ligación combinando tres microlitros del tampón de ligación y 19,5 microlitros de PEG. Luego, añada 2,5 microlitros de la mezcla maestra de ligación a cada una de las reacciones. Después de mezclar y centrifugar brevemente los tubos, devuélvalos al termociclador a 48 grados Celsius durante cinco minutos.
Luego, agregue un microlitro de ligasa directamente a cada muestra mientras aún está en el bloque del termociclador e incube los tubos utilizando el siguiente programa. Mezcle suavemente y centrifugue brevemente los tubos, y agregue un microlitro de enzima de limpieza de la ligación a cada muestra. A continuación, incube los tubos en el termociclador como se muestra aquí.
Después de la incubación, agregue 40 microlitros de agua libre de RNasa a las muestras antes de mezclarlas y centrifugarlas. Para llevar a cabo la hibridación de microARN, descongele los conjuntos de sondas reportadoras y de captura sobre hielo y centrifúgelos. Agregue 130 microlitros de tampón de hibridación al Conjunto de Códigos Reportadores 2 y mezcle para crear la mezcla maestra de hibridación.
En 12 nuevos tubos en tira de 0,2 mililitros, agregue 20 microlitros de la mezcla maestra de hibridación. Desnaturalice las muestras de microARN recién preparadas a 85 grados Celsius durante cinco minutos y enfríelas en hielo. Luego, agregue 5 microlitros de las muestras de microARN a cada uno de los tubos en tira que contienen la mezcla maestra de hibridación.
Programe el termociclador a 65 grados Celsius, con una temperatura calculada por volumen de 30 microlitros, y la tapa caliente en la configuración de tiempo «Forever» para que no disminuya a 4 grados Celsius al final del ciclo. Añada 5 microlitros del conjunto de sondas de captura a cada tubo y mezcle. Luego, después de centrifugar brevemente, coloque inmediatamente los tubos en el termociclador a 65 grados Celsius.
Incube las muestras durante no menos de 12 horas y no más de 30 horas. Prepare la estación de trabajo calentando primero el cartucho y las placas a temperatura ambiente. Luego, centrifugue las placas.
Para cargar la estación de preparación, abra la puerta de la estación y coloque las placas de reactivos, el cartucho, las puntas de pipeta, las muestras preparadas en tubos tira de 0,2 mililitros y dos tubos tira vacíos de 0,2 mililitros con 12 tubos en las ubicaciones correspondientes del robot. Retire las tapas de los tubos tira y la cubierta de la placa de reactivos. Luego, cierre la puerta de la estación de preparación y ejecute el ensayo correspondiente desde el panel de control.
Para visualizar y contar los códigos de barras de los complejos tripartitos inmovilizados y orientados, retire el cartucho de la estación de preparación, úselo para sellarlo y colóquelo en el analizador digital en cualquier ranura disponible. Utilice la pantalla táctil para crear un archivo de definición de cartucho, o CDF. Asegúrese de que el archivo de biblioteca de reporteros apropiado esté asignado a cada muestra en el CDF.
Una vez completado el escaneo, descargue los archivos de datos del analizador digital utilizando una unidad USB o mediante correo electrónico, antes de procesar y analizar los datos, según el protocolo asociado de control de calidad y análisis. El sistema de ensayo de la plataforma de expresión génica reduce el ruido técnico gracias a su naturaleza altamente automatizada, y la química única que utiliza produce datos de expresión génica de alta precisión. Los replicados técnicos mostrados aquí demuestran la alta reproducibilidad posible en la cuantificación de la expresión de microARN endógenos y virales.
Mediante este método, se pueden identificar como objetivos de interés en el SII las microARN codificadas por virus y las microARN humanas endógenas que presentan desviaciones respecto a la expresión esperada, definida por participantes sanos en el estudio. La precisión y sensibilidad del método permiten detectar perturbaciones entre objetivos de baja expresión, y también se pueden observar de forma confiable perturbaciones sutiles. Estas figuras muestran algunas de las perturbaciones en las microARN circulantes en el SII y sus subtipos, en comparación con controles sanos.
Se presentan aquí los dos microARN más significativamente elevados de forma diferencial en participantes con SII. Las curvas en este gráfico de violín indican la frecuencia de conteos para miR-150. Las barras verticales representan el primer y tercer cuartil, y el cuadrado rojo indica el conteo mediano.
Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar ensayos personalizados más específicos basados en la misma tecnología para validar firmas de biomarcadores en cohortes más grandes y explorar las asociaciones esenciales de ARN y proteínas. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación biomédica desarrollaran rápida, precisa y exactamente paneles de biomarcadores diagnósticos para enfermedades.
Descripción general
Este artículo presenta una plataforma de expresión génica multiplexada de alto rendimiento diseñada para cuantificar la expresión de microARN en muestras de sangre total. El método permite mediciones precisas sin amplificación, lo que la hace adecuada para estudiar afecciones como el síndrome del intestino irritable.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Análisis de expresión génica
- Cuantificación de microARN
- Investigación sobre trastornos digestivos
Antecedentes
- Los microARN desempeñan un papel crucial en la regulación génica.
- Comprender su expresión puede proporcionar información sobre diversas enfermedades.
- Los métodos actuales suelen basarse en la amplificación, lo que puede introducir variabilidad.
- Este estudio tiene como objetivo superar esas limitaciones con un enfoque novedoso.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para la cuantificación digital de microARN en sangre.
- Identificar mecanismos moleculares desregulados en el síndrome del intestino irritable.
- Establecer firmas de biomarcadores para trastornos digestivos.
Métodos Utilizados
- Extracción automatizada de ARN a partir de muestras de sangre completa.
- Preparación de muestras de microARN utilizando reactivos específicos.
- Procesos de hibridación y ligación para la detección de microARN.
- Análisis digital de datos de expresión génica utilizando una plataforma especializada.
Resultados principales
- El método demostró una alta precisión al cuantificar los niveles de microARN.
- Los réplicas técnicos mostraron reproducibilidad en los resultados.
- Se identificaron microARNs que se desvían de los perfiles de expresión sanos.
- Se detectaron de manera confiable perturbaciones sutiles en objetivos de baja expresión.
Conclusiones
- La plataforma multiplex proporciona una herramienta robusta para estudiar el microARN en sangre.
- Puede ayudar a comprender la base molecular de los trastornos digestivos.
- Este enfoque podría conducir al descubrimiento de nuevos biomarcadores para el síndrome del intestino irritable.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta plataforma multiplex de expresión génica de alto rendimiento permite una cuantificación robusta y sin amplificación de los miARN circulantes, apoyando el descubrimiento de biomarcadores en trastornos digestivos como el síndrome del intestino irritable. Al ofrecer alta sensibilidad y reproducibilidad en la detección de perturbaciones en la expresión baja de miARN, el método aumenta la confianza en la validación de dianas y reduce la ambigüedad mecanicista en las fases iniciales del descubrimiento. Su flujo de trabajo automatizado y su enfoque de conteo digital mejoran la estandarización y escalabilidad del ensayo para equipos de I+D multifuncionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas mediante la identificación de microARNs circulantes disregulados como posibles biomarcadores en el SII.
- Valor operativo: Apoya la desactivación biológica mediante una cuantificación precisa y sin amplificación que minimiza la variabilidad técnica.
- Valor predictivo: Facilita la detección de perturbaciones sutiles en los microARNs, mejorando la confianza en la relevancia del blanco y en las decisiones de selección de carteras.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera datos cuantitativos altamente reproducibles de expresión de miARN adecuados para la estandarización de ensayos y el desarrollo de paneles de biomarcadores.
- Valor operativo: Reduce los efectos del investigador mediante la preparación de muestras y el procesamiento robótico en gran parte automatizados, mejorando el rendimiento y la consistencia.
- Escalabilidad: Permite el análisis multiplexado de hasta 800 transcritos por reacción, posibilitando el cribado eficiente de firmas de miARN en cohortes.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Apoya la validación de biomarcadores de miARN circulantes descubiertos en muestras humanas para investigaciones preclínicas posteriores.
- Reducción de Riesgos Mecanísticos: Permite correlacionar los cambios en la expresión de miARN con subtipos de enfermedad, facilitando la comprensión fisiopatológica.
- Confianza Predictiva: Posibilita la detección confiable de miARN de baja abundancia, mejorando la sensibilidad del biomarcador y reduciendo el riesgo de falsos negativos en estudios traslacionales.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la selección de biomarcadores guiada por hipótesis hasta la validación de ensayos, apoyando el avance desde el descubrimiento inicial hasta la identificación de candidatos prometedores en la investigación de trastornos digestivos.
- Biología del Descubrimiento: Permite la comprobación de hipótesis mediante la cuantificación de los cambios en la expresión de miARN en sangre total, aclarando las vías moleculares reguladas de forma anómala en el SII.
- Detección: Proporciona resultados cuantitativos listos para ensayos, con alta linealidad y sensibilidad, lo que permite la evaluación fiable de compuestos o biomarcadores.
- Análisis: Ofrece conteos digitales de códigos de barras y datos de expresión normalizados que facilitan la comparación estadística entre diferentes condiciones y cohortes.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos de miARN circulantes con la relevancia de la enfermedad, apoyando la continuidad de los biomarcadores hacia la validación preclínica.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable y automatizada para el perfilado de miARN, aplicable en múltiples áreas terapéuticas más allá de los trastornos gastrointestinales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir el ruido técnico y permitir la detección de cambios en la expresión de miARN de bajo nivel.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante la automatización, minimizando los efectos por lotes y la variabilidad entre usuarios.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos robustos de biomarcadores, reduciendo el riesgo de fracaso en fases avanzadas debido a objetivos mal validados.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de biomarcadores de miARN basándose en cambios de expresión reproducibles y cuantificables en muestras clínicamente relevantes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de ácidos nucleicos, sistemas automatizados de manipulación de líquidos y análisis digital de imágenes para una cuantificación precisa de miARN.
- Depende del acceso a estaciones de preparación robóticas, analizadores digitales y conjuntos de sondas fluorescentes comerciales con códigos de barras codificados por colores.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de recolección de muestras, normalización de ARN e hibridación para garantizar la comparabilidad de los datos.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el ensayo a diferentes biofluidos o tipos de tejidos distintos de la sangre completa.
- Limitado por la necesidad de reactivos y equipos especializados, lo que puede restringir su adopción en entornos con pocos recursos, a pesar de su alta reproducibilidad.
