Name: Retroviral transducción de células T colaboradoras como un enfoque genético para estudiar mecanismos que controlan su diferenciación y función (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Aprenda a aislar células T colaboradoras murinas primarias y transducirlas con construcciones retrovirales para analizar la función de microARN y vías regulatorias en la diferenciación celular.

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Este trabajo fue apoyado por una beca del Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas (BBSRC) (BB/H018573/1) y una beca de BD Biosciences.

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<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+regulate+T-cell+production+of+interleukin-9+and+identify+hypoxia-inducible+factor-2a+as+an+important+regulator+of+T+helper+9+and+regulatory+T-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs regulate T-cell production of interleukin-9 and identify hypoxia-inducible factor-2a as an important regulator of T helper 9 and regulatory T-cell differentiation.</a> Immunology. 149, 74-86 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen ningún interés contradictorio en la publicación de este trabajo.

Retrovirales sobreexpresión de los genes mediada es una forma poderosa para analizar la función de las células T auxiliares, ya que su desarrollo y la función es a menudo determinado por el nivel de expresión de los reguladores clave. Sin embargo, se requiere una interpretación cautelosa de los resultados, ya que los niveles de expresión significativamente superiores a los del gen endógeno pueden introducir muchos artefactos. Por lo tanto, esta técnica se debe combinar con otros para comprobar la relevancia de la función. Por ejemplo, la sobreexpresión debe complementarse con una expresión reducida mediante siRNAs gen knockouts o si está disponible. Con miRNAs, complementamos experimentos de sobreexpresión con los de bloqueo usando virus que sobreexpresan miRNA artificial orientada a sitios que actuaban como inhibidores competitivos para un miARN 15. células transducidas retrovirales también se pueden utilizar en ensayos bioquímicos que implican ARN y análisis de proteínas. Sin embargo, una limitación importante de estos experimentos es la eficiencia de transducción de resulting en una población mixta de células transducidas y no transducidas. Por lo tanto, estos ensayos lo más probable es requerir la clasificación de la GFP + población. Finalmente, en ensayos in vitro de la diferenciación se deben combinar con los experimentos in vivo, y una forma esto se puede lograr es mediante la transferencia adoptiva de las células T transducidas en ratones y después de su diferenciación y su efecto sobre la respuesta inmune. Una de las limitaciones principales de este sistema es el tamaño del genoma de ARN que puede ser empaquetado en la cápside retroviral. En nuestra experiencia, el tamaño máximo de inserción para el sistema MIG retroviral que da buena producción de virus es 3-3,5 kb. Por lo tanto, los genes de mayor tamaño no pueden ser analizados con este sistema, ya que dan pobres títulos de virus. Sin embargo, la mayoría de los genes son más pequeños que este tamaño por lo que este sistema es útil para una amplia variedad de estudios de genes. Con la transducción retroviral, varias alternativas dentro de estos protocose han utilizado ls. Muchos investigadores han utilizado líneas celulares de empaquetamiento que expresan de forma estable los genes retrovirales (para el Ejemplo de Referencia 16). Sin embargo, se han obtenido los títulos más altos utilizando células HEK 293T estándar con la co-transfección del vector del virus auxiliar PCL-Eco. Aislamiento de células T auxiliares naïve también se puede lograr a través de clasificación de células en lugar de el protocolo de la columna de talón y la separación celular magnética, pero esto requiere el acceso a un clasificador de células, y los costes de tiempo de tipo son típicamente más altos que los reactivos de talón. Por último, hay variaciones en condiciones de activación que se utilizan para diferenciar las células T auxiliares en los diferentes subconjuntos. Por ejemplo, la estimulación de TCR de las células durante demasiado tiempo antes de la exposición a condiciones de inducción de Treg puede inhibir su inducción 16. Esto puede ser un problema porque la expresión retroviral requiere la división celular inducida por la estimulación de las células. Sin embargo, hemos encontrado que la inducción de Treg eficiente el uso de este protocolo con S / N activación antes de la transducción retroviral. Dentro de estos protocolos, la aplicación exitosa requiere de varios factores. preparaciones de retrovirus con alta titulación necesitan transfección eficiente de las células HEK 293T ADN tan alta calidad y precisión preparado 2x HBS son importantes. Además, la densidad celular de las células HEK 293T necesita ser aproximadamente 50% en el punto de transfección debido a la buena expresión del ADN transfectado requiere que las células están creciendo activamente, y esto se inhibe si las células son demasiado escasa o densa. Las células en la densidad óptima durante la transfección deben llegar a la confluencia en algún momento durante las etapas de recolección de virus, pero seguirán produciendo reservas de virus de alto título hasta el final de la última colección. Diferenciación eficiente de las células T auxiliares requiere buena calidad celular para asegurar que las células aisladas son a la pureza se ilustra en la Figura 1. Del mismo modo, la calidad de las células depende de la fr ratonesom que se aislaron. Para estos estudios, hemos utilizado de 6-8 semanas de edad C57BL / 6 ratones. Los ratones más viejos pueden tener células menos ingenuas, y otras cepas pueden diferir en su diferenciación. Por ejemplo, los ratones BALB / c son más propensos a las respuestas Th2 que C57BL / 6 ratones 17 de manera que se ha indicado anteriormente, C57BL / 6 células T pueden ser difíciles de inducir una respuesta Th2. Además, cualquiera de las condiciones de diferenciación pueden variar ligeramente de un laboratorio a otro, y el efecto de la sobreexpresión del gen sólo se pondrá de manifiesto en condiciones subóptimas por lo concentraciones de citoquinas en las diversas condiciones de polarización pueden necesitar ser valorada. Finalmente, los efectos del gen sobreexpresado o las condiciones de polarización en la proliferación celular pueden influir en la eficacia de transducción así efectos de medición del gen de interés pueden requerir la optimización de la sincronización y la concentración de reactivos de polarización. La optimización de todos estos factores debe conducir a resultados informativos con este sistema.

La respuesta inmune debe estar altamente regulada para eliminar infecciones pero prevenir ataques al tejido propio que conducen a la autoinmunidad. Las células T colaboradoras desempeñan un papel esencial en la regulación de la respuesta inmunitaria, y se ha realizado un gran esfuerzo para comprender su desarrollo y función (ilustrado en varias revisiones recientes 1-3). Sin embargo, aún quedan muchas preguntas y se han utilizado muchos enfoques para estudiar los mecanismos que controlan el desarrollo y la función de las células T auxiliares. Estos han ido desde el uso de sistemas de cultivo celular in vitro hasta animales enteros. Los sistemas de cultivo celular, especialmente los que utilizan líneas celulares, ofrecen la ventaja de la facilidad de uso y la capacidad de generar una gran cantidad de material para realizar análisis bioquímicos sofisticados. Sin embargo, sufren de su capacidad limitada para reproducir las condiciones reales que ocurren en una respuesta inmune. Por el contrario, los experimentos con animales enteros ofrecen el beneficio de la relevancia, pero pueden sufrir dificultades en la manipulación y la capacidad de realizar controles precisos, además de sus grandes costos e implicaciones éticas. Sin embargo, la gran mayoría de los estudios de células T auxiliares en la actualidad todavía requieren el uso de experimentos con animales enteros con células T primarias debido a la incapacidad de las líneas celulares para duplicar los pasos exactos que ocurren en todo el animal. Por lo tanto, es esencial utilizar enfoques rentables que sean altamente informativos. 
La genética es una herramienta poderosa para estudiar el desarrollo y la función de las células T auxiliares, sin embargo, los métodos tradicionales que involucran eliminaciones de genes o transgenes consumen mucho tiempo y son costosos, por lo que a menudo están fuera del alcance de los pequeños laboratorios. Sin embargo, la transducción retroviral ofrece un enfoque genético potente, rápido y rentable para estudiar los mecanismos de productos genéticos específicos. Por lo tanto, se usa comúnmente en artículos que estudian el desarrollo y la función de las células T auxiliares. 
Hemos optimizado un procedimiento para la transducción retroviral de células T auxiliares. Utiliza el vector de expresión retroviral pMIG (virus de células madre murinas-sitio de entrada ribosómico interno-proteína fluorescente verde), en el que se puede clonar el gen de interés y, por lo tanto, expresarlo a partir de la repetición terminal larga (LTR) del retrovirus 4. Además, aguas abajo del gen de interés insertado hay una secuencia de entrada de ribosoma interno (IRES) seguida por el gen de la proteína fluorescente verde (GFP), por lo que las células transducidas pueden ser fácilmente seguidas por su expresión de GFP. El vector se derivó originalmente de los vectores del Virus de las Células Madre Murinas (MSCV), que contienen mutaciones en los sitios de unión de los represores en los LTR, lo que los hace resistentes al silenciamiento y, por lo tanto, da una alta expresión en muchos tipos de células, incluidas las células T auxiliares 5,6. La producción de retrovirus de alto título requiere un protocolo de transfección transitoria simple de células 293T de riñón embrionario humano (HEK) con el vector MIG y un vector de virus auxiliar que expresa los genes retrovirales GAG, Pol y Env. Para esto, el vector de virus auxiliar pCL-Eco 7 funciona bien en la producción de retrovirus incompetentes de replicación de alto título. 
Aquí se describen estos protocolos para la producción retroviral y la transducción de linfocitos T murinos primarios, además de algunos de nuestros resultados utilizando este enfoque para estudiar la regulación de miARN de la expresión génica que controla la diferenciación de linfocitos T auxiliares. Los miRNAs son pequeños ARN de aproximadamente 22 nucleótidos de longitud que regulan postranscripcionalmente la expresión génica dirigiéndose a secuencias homólogas en los ARN mensajeros que codifican proteínas y suprimen la traducción e inducen Inestabilidad del mensaje 8,9. Los miARN desempeñan un papel fundamental en la regulación génica del desarrollo. Son esenciales en las etapas más tempranas del desarrollo, ya que los embriones que no pueden producir miRNAs mueren en una etapa muy temprana 10. Además, los miRNAs son importantes más adelante en el desarrollo de muchos tejidos. Se cree que funcionan afinando la expresión de los genes necesarios para los programas de desarrollo 1. En los linfocitos T colaboradores, los miARN desempeñan múltiples funciones y son necesarios para el desarrollo de los linfocitos T reguladores (Treg) 11-14. Utilizamos la transducción retroviral como medio para diseccionar los mecanismos de regulación de miRNA de la diferenciación de Treg 15. A través de estos estudios, se determinaron importantes miRNAs individuales por sobreexpresión mediada por retrovirales. Posteriormente, se identificaron genes relevantes regulados por estos miRNAs para comprender las vías moleculares reguladas por miRNAs en la diferenciación de células T auxiliares.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Solución de estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Vector</td> <td>MIGAddgene</td><td>Plásmido 9094</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco vector</td><td>Addgene</td><td>Plásmido 12371</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Cuentas magnéticas ratón CD4 kit de células&nbsp;</td><td>Invitrogen (Dynabeads)</td><td>11415D</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de estreptavidina&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-048-102</td><td></td></tr><tr><td>Columnas de separación celular MS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>LS Columnas de separación celular</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD25 Biotenilado MAb&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>85059</td><td>clon 7D4</td></tr><tr><td>CD62L Biotenilado MAb&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553149</td><td>clon MEL-14</td></tr><tr><td>Polybrene (bromuro de hexadimetrina)</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>eBiosciences</td><td>16-0031-85</td><td>clon 145-2C11&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD28</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td>clon 37.51&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-IL-4</td><td>BD Biosciences</td><td>559062</td><td>clon 11B11</td></tr><tr><td>Anti-IFN-gamma</td><td>BD Biosciences</td><td>559065</td><td>clon XMG1.2</td></tr><tr><td>Anti-IL-2</td><td>BD Biosciences</td><td>554425</td><td>clonJES6-5H4</td></tr><tr><td>IL-12 recombinante p70</td><td>eBiosciences</td><td>14-8121</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 recombinante</td><td>BD Biosciences</td><td>550067</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta recombinante</td><td>eBiosciences</td><td>14-8342-62</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 recombinante</td><td>eBiosciences</td><td>14-8061</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 recombinante</td><td>eBiosciences</td><td>14-8021</td><td></td></tr><tr><td>PMA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>eBiosciences</td><td>00-4506</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>16005</td><td>El paraformaldehído es tóxico, por lo que debe tener la precaución adecuada al manipularlo...</td></tr><tr><td>Juego de tampones de tinción Foxp3</td><td>eBiosciences</td><td>00-5523</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4&nbsp; FITC</td><td>eBiosciences</td><td>11-0041</td><td>clon GK1.5&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD8a perCP-cy5.5</td><td>eBiosciences</td><td>45-0081-80</td><td>clon 53-6.7&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-MHCII PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0920</td><td>&nbsp; clon HIS19</td></tr><tr><td>Anti-CD25 PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0251-82</td><td>&nbsp; clon PC61.5&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD62L PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-0621-82</td><td>clon MEL-14&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD44 APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-0441</td><td>clon IM7&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-IFN-gamma FITC&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>11-7311-81</td><td>clon XMG1.2</td></tr><tr><td>Anti-IL-4 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554435</td><td>clon 11B11</td></tr><tr><td>Anti-IL-9 PE o APC</td><td>eBiosciences/Biolegend</td><td>50-8091-82/514104</td><td>clon RM9A4</td></tr><tr><td>Anti-IL-17a PE</td><td>BD Biosciences</td><td>559502</td><td>clon TC11-18H10</td></tr><tr><td>Anti-Foxp3&nbsp; APC o PE</td><td>eBiosciences</td><td>17-5773-82/12-5773-80&nbsp;</td><td>clon FJK-16s</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4-2H2O</td><td>Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Dextrosa/Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, ácido libre</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disódico</td><td>Sigma D2900000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>237205</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr></tbody></table>

retroviral transducción de células t colaboradoras como un enfoque genético para estudiar mecanismos que controlan su diferenciación y función

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

El desarrollo y la función de las células T auxiliares deben estar estrictamente regulados para inducir una respuesta inmunitaria adecuada que elimine patógenos específicos y al mismo tiempo evite la autoinmunidad. Se han utilizado muchos enfoques que involucran a diferentes organismos modelo para comprender los mecanismos que controlan el desarrollo y la función de las células T auxiliares. Sin embargo, los estudios con modelos de ratón han demostrado ser muy informativos debido a la disponibilidad de sistemas genéticos, celulares y bioquímicos. Un enfoque genético en ratones utilizado por muchos laboratorios implica la transducción retroviral de células T auxiliares primarias. Este es un enfoque poderoso debido a su relativa facilidad, lo que lo hace accesible a casi cualquier laboratorio con habilidades básicas en biología molecular e inmunología. Por lo tanto, se puede probar fácilmente la función de múltiples genes en formas salvajes o mutantes en las células T auxiliares para comprender su importancia y mecanismos de acción. Hemos optimizado este enfoque y describimos aquí los protocolos para la producción de retrovirus de alto título, el aislamiento de linfocitos T auxiliares murinos primarios y su transducción por retrovirus y la diferenciación hacia los diferentes subconjuntos auxiliares. Finalmente, el uso de este enfoque se describe en el descubrimiento de los mecanismos utilizados por los microARN (miARN) para regular las vías que controlan el desarrollo y la función de las células T auxiliares.

El éxito de este sistema experimental requiere poblaciones altamente puras de células T y de las preparaciones de retrovirus de alto título. Los resultados representativos se muestran aquí como ejemplos de experimentos exitosos. La figura 1 muestra la pureza típica de las poblaciones de pre y seleccionado enviar-en cada etapa del protocolo de aislamiento de células helper T naïve. Figura 2 y 3 ilustran el análisis de la producción de retrovirus a través de la expresión de GFP en las células HEK 293T transfectadas (Figura 2) y las células T transducidas (Figura 3). Las eficacias de transfección de las células HEK 293T pueden variar significativamente con diferentes construcciones retrovirales, pero esto a menudo no se correlaciona con el nivel de producción observado retrovirus con el número de células T + GFP. Además, el número de células GFP + T puede variar dependiendo de las condiciones de polarización. Además, el mnivel de expresión de GFP ean y el gen insertado puede variar en función del número de copias de virus integrado, el efecto del sitio de integración en la transcripción, y los mecanismos de regulación post-transcripcional que afectan a la transcripción viral. Por último, la figura 4 muestra algunos resultados típicos que hemos observado con la diferenciación de células T ayudantes cuando el miARN miR-15b / 16 se sobreexpresa. Estos resultados muestran algunas de las variables que puede ocurrir dentro de un experimento individual efectos tan verdaderos deben justificarse mediante un análisis estadístico de múltiples experimentos repetidos utilizando diferentes preparaciones de células T auxiliares. En estos experimentos las respuestas Th2 pueden ser difíciles de observar en la línea C57BL / 6 se utiliza aquí, ya que son propensos a las respuestas Th1. Asimismo, IL-9 tinción puede ser difícil de detectar por encima del fondo. Por lo tanto, es imperativo que hacer controles de isotipo y establecer una compensación adecuada para garantizar la correcta gating de expresión de citoquinas. En nuestros resultados hemos encontrado que miR-15b / 16 aumenta la inducción iTreg mediante la inhibición de la vía de señalización a través de la supresión de la expresión de la Rictor componentes y mTOR 15 mTOR. miR-15b / 16 veces puede influir Th0, Th1, y la diferenciación Th17 en experimentos individuales, pero no hay ningún efecto significativo cuando se examinó en varios experimentos repetidos. En contraste miR-15b / 16 sobreexpresión no suprimir significativamente la diferenciación Th9 (véase la referencia 18). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig1.jpg" /> Figura 1. pureza típica de las células T colaboradoras en cada etapa de aislamiento. Citometría de flujo Representante resultados de los antígenos indicados se muestran desde la puerta de células vivas designadas en la dispersión frontal (FSC) y parcelas de dispersión lateral (SSC). Selección negativa (A) pre y post-CD4. perfiles de expresión de CD4,CD8a, y MHCII se muestran. Estos ilustran el enriquecimiento de células T auxiliares y la pérdida de las células T citotóxicas y de MHC de clase II de las células que expresan. Una buena purificación debe resultar en ~ células T CD4 + 90% en esta etapa. (B) Selección de CD25. A la izquierda están los perfiles de expresión de CD4, CD8a, y MHCII, ya la derecha son la expresión de CD4 y CD25 perfiles de pre y selección posterior. En este punto&gt; 95% de CD25 células seleccionadas negativamente debe ser CD4 + CD25 -. (C) CD62L selección. CD4, CD8a, y MHCII perfiles de expresión se muestran a la izquierda. A la derecha de los perfiles de expresión de CD62L y CD44 se comunican para las celdas seleccionadas pre y post-CD62L junto con CD4 y CD62L perfil de expresión de células de correos seleccionado. Después de la selección CD62L se eliminan virtualmente todas las células de memoria (CD44 +) dejando una población altamente enriquecida de células T colaboradoras ingenuas que contiene 10-15% de células efectoras (CD62L baja). Para todosperfiles de FACS, configuraciones equivalentes y escalas de un parámetro específico se mantuvieron a lo largo. Los números representan el porcentaje de células dentro de una población cerrada. La ligera disminución en el tamaño de las células después de la selección inicial es presumiblemente debido a la tensión mecánica durante el protocolo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig2.jpg" /> Figura 2. Análisis de células HEK 293T transfectadas de retrovirus. Expresión de GFP se muestra en las células HEK 293T que eran o no transfectadas o transfectadas y se analizaron después de la recogida de los sobrenadantes de cultivo virales. análisis de GFP se realiza en células vivas de la puerta en el FSC y SSC trama en el primer panel. Los números representan el porcentaje de células GFP + dentro de la región acotada. t típicaeficiencias ransfection oscilan entre 30-90%. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig3.jpg" /> Figura 3. Análisis de células T auxiliares de retrovirus transducidas. Expresión de GFP se muestra en las células T helper-retrovirales transducidas después de la diferenciación en Th0, Th1, Th2, Th9, Th17, y las condiciones de polarización Treg durante tres días. El análisis fue cerrada en células vivas y activos indicados en el panel de FSC / SSC. Las eficacias de transducción pueden variar entre 10-75% dependiendo de la construcción y de las condiciones de polarización. Del mismo modo, la intensidad media de fluorescencia de la expresión de GFP puede variar. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 4. Efecto de miR-15b / 16 sobreexpresión de ayudante de diferenciación de células T en diferentes condiciones de polarización. Perfiles de citoquinas representativos se muestran en la GFP + población de células a partir de la figura 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Tabla 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698table1.jpg" /> Tabla 1:. Los tampones utilizados en estos protocolos <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar la tabla como una hoja de cálculo de Excel.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Ayudantecondiciones de polarización de las células T </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th0 </td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th1 </td><td> recombinante-IL-12 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th2 </td><td> IL-4 recombinante </td><td> 40 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th9 </td><td> TGF-β recombinante </td><td> 2,5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> IL-4 recombinante </td><td> 40 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 10 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th17 </td><td> TGF-β recombinante </td><td> 2,5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> IL-6 recombinante </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-2 </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tregs </td><td> TGF-β recombinante </td><td> 2,5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> IL-2 recombinante </td><td> 5 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tabla 2: T colaboradoras subconjunto de células condiciones de polarización.

Muchos sistemas experimentales se han utilizado para entender los mecanismos que regulan el desarrollo de células T y la función en una respuesta inmune. Aquí se describe un enfoque genético usando la transducción retroviral, que es económico, eficiente en tiempo, y lo más importante, muy informativos en la identificación de las vías de regulación.

Retroviral transducción de células T colaboradoras como un enfoque genético para estudiar mecanismos que controlan su diferenciación y función

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

El objetivo general de este protocolo es aislar linfocitos T auxiliares primarios de ratón y transducirlos con constructos de expresión retrovirales para un gen de interés. Muchos sistemas experimentales han sido utilizados para comprender los mecanismos que regulan el desarrollo y la función de los linfocitos T en una respuesta inmunitaria. Aquí describimos un enfoque genético que utiliza la transducción retroviral, el cual es económico, eficiente en tiempo y altamente informativo para identificar vías reguladoras.Hemos utilizado esta técnica para analizar la función de los microARN, que son reguladores importantes de la expresión génica. Mediante la transducción retroviral, hemos podido evaluar la función de microARN individuales y la diferenciación de linfocitos T auxiliares. Mi colaborador, Oliver Garden, demostrará el aislamiento de linfocitos T primarios, y yo demostraré la transducción retroviral.24 horas antes de la transfección, siembre una placa de células confluentes en una relación de 1:10 en una placa de 10 centímetros, de modo que las células tengan aproximadamente un 50 % de confluencia al día siguiente. Aproximadamente una hora antes de la transfección, retire el medio de las células y agregue cuidadosamente 9 mililitros de medio fresco para HEK293 T, para evitar que las células se desprendan de la placa. En un tubo cónico de fondo redondo de seis mililitros o en un tubo cónico de 15 mililitros, agregue cinco microgramos de ADN retroviral, cinco microgramos de ADN del virus auxiliar y agua hasta un volumen de 420 microlitros.Luego, agregue 80 µL de cloruro de calcio 2,5 M para llevar el volumen final a 500 µL. Después, agregue lentamente 500 µL de HBS 2x gota a gota a la mezcla de ADN, mientras se agita suavemente en vórtex, de modo que la solución se mezcle continuamente y los precipitados de fosfato de calcio se formen en cristales de tamaño uniforme. Posteriormente, transfiera la mezcla de ADN con fosfato de calcio a una cabina de cultivo celular.Agregue lentamente la mezcla a las células, agitando constantemente y suavemente la placa, antes de colocar las células de nuevo en el incubador. Para recolectar el virus al día siguiente, retire el medio y agregue 10 mililitros de medio fresco para HEK293 T, teniendo cuidado de no despegar las células de la placa. Por la tarde, agregue 3,5 mililitros de medio fresco para HEK293 T y mantenga las células en incubación a cuatro grados Celsius durante 12 horas.Después de aproximadamente 12 horas, recolecte el medio y alimente las células con 3,5 mililitros de medio fresco HEK293 T nuevamente. Repita la recolección del medio otras dos veces, a intervalos de aproximadamente 12 horas, lo que resulta en la recolección de unos 10 mililitros de stock vírico. En este procedimiento, agregue el bazo y los ganglios linfáticos al filtro celular y macérelos utilizando el extremo del émbolo de una jeringa de cinco mililitros.A continuación, enjuáguelos con uno a dos mililitros de medio R10. Luego transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros y complete el volumen hasta 14 mililitros con R10. Centrifugue las células a 600 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.A continuación, deseche el sobrenadante vertiéndolo con un solo movimiento limpio, para evitar perturbar el sedimento celular. Luego, agregue dos mililitros de tampón frío de lisis de glóbulos rojos a las células. Mezcle y coloque las células en hielo durante 3,5 minutos, mezclando suavemente durante todo el periodo.Luego, agregue 12 mililitros de medio R10 y centrifugue inmediatamente a 600 × g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Realice los pasos de lavado otras dos veces con medio R10 para eliminar cualquier resto de tampón de lisis de glóbulos rojos de las células y evite la muerte de los linfocitos. En este paso, alícuote de ocho a diez × 10⁷ células por tubo cónico y centrifugue a 600 × g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.Vierta el sobrenadante con un solo movimiento limpio, para evitar perturbar el sedimento celular. A continuación, re-suspenda las células en 100 microlitros de suero bovino fetal inactivado por calor. Después, agregue 100 microlitros de la mezcla de anticuerpos a las células e incube durante 30 minutos a cuatro grados centígrados, con mezcla suave en un agitador rotatorio.A continuación, volver a suspender las perlas en el vial, agitándolas en vórtex durante más de 30 segundos. Luego transferir las perlas a un tubo cónico de 15 mililitros y agregar 2 mililitros de medio R10 por cada mililitro de perlas. Colocar el tubo en el imán durante un minuto.Luego deseche el sobrenadante y resuspenda las perlas en cuatro mililitros de medio R10. Lave las células al final de la incubación con el anticuerpo, añadiendo 10 mililitros de medio R10 por tubo y centrifugando a 600 × g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Vierta el sobrenadante con un solo movimiento limpio para evitar perturbar el botón celular y luego resuspenda las células en 1 mililitro de medio R10.Posteriormente, agregue 2 mililitros de las perlas lavadas al tubo de células tratadas con anticuerpo e incube durante 30 minutos a cuatro grados celsius, con mezcla suave en un agitador rotatorio. Luego, re-suspenda la mezcla de células y perlas mediante pipeteo suave cinco veces antes de colocar el tubo en el imán de perlas durante dos minutos. Transfiera el sobrenadante que contiene las células seleccionadas negativamente a un tubo nuevo y repita la selección negativa una vez más.En este procedimiento, centrifugue las células T positivas para CD4 a 600 × g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y re-suspenda en 150 a 200 microlitros de medio R10 por cada diez a la octava potencia de células. A continuación, agregue dos microlitros de anticuerpos monoclonales biotinilados anti-CD25 en concentración stock a las células e incube durante 30 minutos a cuatro grados Celsius con mezcla suave en un agitador rotatorio. Posteriormente, lave las células añadiendo 10 mililitros de tampón para columna de separación celular y centrifugue a 600 × g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.Luego, retire tanto sobrenadante como sea posible y re-suspenda las células en un volumen final de aproximadamente 90 microlitros por cada 10 a la séptima células. Posteriormente, agregue 20 microlitros de perlas de estreptavidina por cada 10 a la séptima células y mezcle con golpecitos suaves. A continuación, incube durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.Mientras se incubarán las células, prepare las columnas MS. Al final de la incubación, lave las células agregando 10 mililitros de tampón para columna de separación de células y centrifugando a 600 × g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Re-suspenda las células en 500 microlitros de tampón para columna de separación de células por cada 10⁸ células.A continuación, aplique 500 microlitros de la suspensión celular a la columna y recoja el flujo que pasa. Páselo nuevamente por la columna y vuelva a recolectar el flujo que pasa. Luego, enjuague la columna tres veces con 500 microlitros de tampón para columna de separación celular, y añada cada flujo que pasa al frasco que contiene las células negativas para CD25.Realice el lavado, la unión de las perlas de estreptavidina y la preparación de la columna de separación celular como se mencionó anteriormente, pero utilice la columna LS. En esta ocasión, deseche el flujo que atraviesa la columna y expulse las células de la columna con el émbolo suministrado. Mientras aísla los linfocitos T naïve, recubra una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 diluidos en DPBS, e incube durante dos horas a 37 grados Celsius.Inmediatamente antes de cultivar las células, lave la placa con 250 microlitros de DPBS por pocillo para eliminar el anticuerpo no unido. Luego, retire el DPBS y agregue 1 mililitro de linfocitos T positivos para CD4 naïve en medio R10 durante la noche. Al día siguiente, centrifugue las células a 900 × g durante 10 minutos a 30 grados Celsius.Luego, recolecte el medio y agregue 1 mililitro de sobrenadante de cultivo viral, preparado a partir del protocolo de producción de virus. Posteriormente, agregue 1 microlitro de polibreno al ocho miligramos por mililitro y 10 microlitros de HEPES uno molar, para favorecer la incorporación del virus antes de centrifugar las células a 900 ×g durante 90 minutos a 30 grados celsius. Para diferenciar las células, retire cuidadosamente el sobrenadante de cultivo viral y agregue 1 mililitro del medio recolectado previamente, ya que contiene IL2 y otros factores de crecimiento de linfocitos T.Luego agregue los reactivos indicados en la Tabla 2 del manuscrito adjunto y cultive las células durante tres a cuatro días para diferenciarlas en subconjuntos específicos. Esta figura muestra la pureza típica de las poblaciones antes y después de la selección en cada etapa del protocolo de aislamiento de linfocitos T auxiliares naïve. Los perfiles de expresión de CD4, CD8A, MHC II, CD25, CD62L y CD44 ilustran la pérdida de células MHC clase 2, además de células T citotóxicas, reguladoras y de memoria.Esto da como resultado una población que es mayor al 95 % de linfocitos T positivos para CD4, con aproximadamente del 85 % al 90 % siendo células naïve y el resto del 10 % al 15 % siendo células efectoras. En esta figura, se muestra la expresión de GFP en células HEC293 T, que fueron o no transfectadas, y analizadas tras la recogida de los sobrenadantes de cultivo viral. El análisis de GFP se realizó en células viables a partir de la puerta en el gráfico FSE y SSE.Las eficiencias típicas de transfección oscilan entre 30% y 90%. Aquí se muestra la expresión de GFP en células T auxiliares transducidas con retrovirus tras la diferenciación en condiciones de polarización Th0, Th1, Th2, Th9, Th17 y Treg durante tres días. Las eficiencias de transducción varían entre 10% y 75%, dependiendo del constructo y de las condiciones de polarización. A continuación se presentan los perfiles representativos de citocinas en la diferenciación de células T auxiliares bajo distintas condiciones de polarización.Una vez dominadas, estas técnicas pueden ser una herramienta poderosa para analizar la función génica y el desarrollo y funcionamiento de los linfocitos T auxiliares. Tenga en cuenta que los resultados informativos dependen de la calidad de las células y los reactantes. Por lo tanto, es importante optimizar los protocolos de transducción, así como el aislamiento y la diferenciación de los linfocitos T auxiliares.

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