Un modelo murino de Grupo B Streptococcus Colonización vaginal

El objetivo general de este modelo animal es establecer la colonización por estreptococo del grupo B o GBS del tracto vaginal murino. Este método puede ayudarnos a comprender preguntas clave sobre la colonización por estreptococos del grupo B, como cuáles son los factores bacterianos que son importantes para la colonización, así como cómo las respuestas del huésped afectan la persistencia vaginal. La principal ventaja de esta técnica es que la inoculación, por lo general, da como resultado más del 90 por ciento de colonización sin el uso de anestesia, inmunosupresores o agentes espesantes.

Comience por vorexar 0,5 miligramos de beta-estradiol, por ratón, en un tubo cónico de 15 mililitros hasta que se eliminen todos los grumos y el beta-estradiol aparezca como un polvo fino. A continuación, filtre con una jeringa 100 microlitros de aceite de sésamo, por ratón, en el tubo a través de un colador de 0,45 micras y vuelva a vórtice el tubo. Cuando la hormona se distribuya como una suspensión homogénea por todo el aceite, extraiga el reactivo en una jeringa nueva de 10 mililitros y coloque una aguja de una pulgada de calibre 18.

Alícuota 100 microlitros de la suspensión en una jeringa de tuberculina de un mililitro, por ratón, y equipe cada jeringa de tuberculina con una aguja estéril de media pulgada de calibre 26. A continuación, se administran 100 microlitros de beta-estradiol en el cuadrante inferior izquierdo o derecho de la cavidad peritoneal de cada animal. El mismo día de la inyección, cultive un cultivo líquido de cinco mililitros durante la noche de la cepa GBS de interés en caldo Todd Hewitt, o THB, a 37 grados centígrados.

A la mañana siguiente, subcultive el GBS a un volumen de uno a 10 en THB fresco para una incubación de dos a tres horas a 37 grados centígrados, hasta que las bacterias alcancen la fase media de logaritmo. Luego, transfiera el subcultivo a un tubo cónico estéril de 15 mililitros y centrifugue las células bacterianas. Vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de PBS estéril.

A continuación, aumente el volumen total de la suspensión a un mililitro de PBS por cada 10 ratones, para alcanzar un OD600 de 0,4 en un nuevo tubo de cultivo de cinco mililitros. Transfiera el cultivo a un nuevo tubo de 15 mililitros y vuelva a pellet las bacterias. Luego, vuelva a suspender las celdas en PBS a una décima parte del volumen original.

Reserve 50 microlitros de la bacteria para la dilución en serie y la siembra en agar THB, para determinar la UFC exacta del inóculo. A continuación, extraiga 10 microlitros de GBS en una punta de pipeta de carga de gel de 200 microlitros y asegure manualmente la piel suelta en el pescuezo del primer animal, entre el pulgar y el índice, seguido de la inmovilización de la cola. Inserte la punta de la pipeta de 5 a 10 milímetros en la luz vaginal y dispense todo el volumen del inóculo.

Luego, suelte inmediatamente el pescuezo y levante la cola para elevar la parte trasera del animal, mientras camina con las patas delanteras sobre una superficie dura. Después de un minuto, inspeccione visualmente la abertura vaginal en busca de reflujo de inóculo. Justo antes de frotar, humedezca previamente el algodón en PBS y sujete a uno de los ratones como se acaba de demostrar.

Inserte el hisopo 10 milímetros en la luz vaginal y gírelo suavemente cuatro veces en el sentido de las agujas del reloj y cuatro veces en el sentido contrario a las agujas del reloj, mientras aplica una ligera presión sobre la pared vaginal. Coloque el hisopo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga 100 microlitros de PBS, y agite el tubo y el hisopo durante unos 15 segundos para liberar las bacterias de las fibras de algodón. Luego, diluya en serie cada muestra en PBS y coloque 20 microlitros de uno a 10 a través de uno a 10, 000 diluciones en una placa de agar medio diferencial, preparada según las instrucciones del fabricante, para la incubación a 37 grados Celsius durante 24 horas.

Las colonias de GBS aparecerán de color rosa brillante o malva. Para recoger el lavado vaginal, utilice una punta de pipeta con carga de gel de 200 microlitros para dispensar 20 microlitros de PBS en el lumen vaginal. Pipetea suavemente todo el volumen hacia arriba y hacia abajo cuatro veces dentro del lúmene.

Luego, con la misma punta, retire todo el volumen. Para el análisis del fluido de lavado aguas abajo, dispense el lavado en un tubo de microcentrífuga de 0,7 mililitros. Para la homogeneización de la disección de tejidos, rocíe el abdomen ventral de un animal sacrificado con etanol al 70 por ciento y use tijeras estériles para abrir la cavidad abdominopélvica.

Desplazar los intestinos para que el tracto reproductivo quede expuesto. A continuación, corta ambos cuernos uterinos, a la mitad, entre el cuerpo uterino y los ovarios. Con tijeras y fórceps, separe la grasa visceral, las membranas y la vejiga urinaria del tracto reproductivo, moviendo los tejidos caudalmente.

Luego, corte transversalmente la vagina lo más cerca posible de la vulva, para separar el tracto reproductivo del cuerpo. Transfiera el tracto reproductivo intacto a una placa de Petri estéril y use una nueva hoja de afeitar para separar el útero del cuello uterino en un solo corte transversal. Separe el cuello uterino de la vagina con otra incisión transversal.

A continuación, utilice pinzas estériles para transferir cada uno de los tejidos a dos tubos individuales, prepesados, de dos mililitros que contengan 500 microlitros de PBS y perlas homogeneizadoras. Pesa cada tubo de 2 mililitros para determinar el peso de los tejidos. A continuación, selle herméticamente los tubos con tapón de rosca y homogeneice los tejidos, durante un minuto, a la máxima velocidad, en un homogeneizador de tejidos.

Para cuantificar la carga bacteriana, diluir en serie 25 microlitros de homogeneizado de tejido y placar de uno a 10 a 10.000 diluciones en placas de agar medio diferencial, para una incubación de 24 horas, a 37 grados centígrados. Para almacenar muestras para la cuantificación de citoquinas, congele los homogeneizados a menos 20 grados Celsius. En estas imágenes, se muestran las cuatro etapas del ciclo estral del ratón, determinadas por el líquido de lavado vaginal de montaje húmedo.

Los ratones inoculados en la etapa de proestro fueron colonizados con GBS durante más tiempo que cualquier otra etapa de celo, particularmente aquellos en diestro en el momento de la inoculación. El celo sostenido promueve la persistencia de GBS A909 en ratones CD-1 con una colonización del 90 por ciento observada dos semanas después de la inoculación. En un experimento típico con una dosis de beta-estradiol antes de la inoculación, solo entre el 40 y el 50 por ciento de los ratones fueron colonizados una semana después de la inoculación, con un GBS medio recuperado que imita el porcentaje de colonización.

Lo que demuestra que mantener un celo continuo promueve la persistencia vaginal del SGB en la mayoría de los ratones CD-1. El GBS A909 persiste en el tracto vaginal en ratones CD-1 endogámicos y ratones FVB endogámicos durante, aproximadamente, una semana. Mientras que la mayoría de los ratones endogámicos BALB/c y C57BL/6 se colonizan a la semana durante un mes o más.

La visualización de SGB positivo para GFP en animales inoculados demuestra la presencia de SGB adherido al epitelio vaginal murino y en estrecha proximidad con otra flora vaginal nativa. Es importante evitar el reflujo, durante la inoculación, para asegurar que todos los ratones sean colonizados. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en una o dos horas, dependiendo del número de animales.

Este modelo permite a los investigadores en el campo de las interacciones huésped/patógeno explorar la capacidad de las bacterias, como el estreptococo del grupo B, para colonizar el tracto reproductivo femenino. Este procedimiento se puede utilizar para probar compuestos novedosos o tratamientos probióticos para responder preguntas adicionales sobre intervenciones terapéuticas.