Name: Análisis de SCAP N -glycosylation Y el tráfico en las células humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Aprende a analizar la N-glicosilación y el tráfico de SCAP en células humanas mediante fraccionamiento de membranas, western blot y microscopía confocal. Este método simplificado facilita el estudio del metabolismo lipídico.

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Estamos agradecidos a los Dres. Mike S. Brown y Joseph L. Goldstein por su acuerdo de publicar este método de acuerdo con los métodos descritos en sus publicaciones. Agradecemos al Dr. Peter Espenshade por compartir el plásmido GFP-SCAP. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH NS072838 y NS079701 a D.G., la beca de investigación de la Sociedad Americana Contra El Cáncer RSG-14-228-01-CSM a D.G., y la beca postdoctoral OSUCCC Pelotonia a C.C. También agradecemos el apoyo del Núcleo de Neurociencia del Estado de Ohio (P30 NS038526) y la subvención inicial del Programa Terapéutico Traslacional de OSUCCC y los fondos iniciales para D.G.

1. Proteína La detección de SCAP endógena en las células humanas <ol><li> Cultivo Celular y Tratamiento <ol><li> Células de semillas ~ 1 × 10 6 U87 en un plato de 10 cm con de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS) y se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 24 horas antes del tratamiento. </li><li> Lavar las células una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS), a continuación, cambiar las células a medio DMEM fresco con o sin glucosa (5 mM) durante 12 horas. </li></ol></li><li> Preparación de la Membrana Celular fracciones y extractos nucleares <ol><li> Lavar las células una vez con PBS, raspan en 1 ml de PBS, y se centrifuga a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender las células en un tampón enfriado con hielo que contiene 10 mM HEPES-KOH (pH 7,6), KCl 10 mM, 1,5 mM MgCl 2, ácido etilendiaminotetraacético de sodio 1 mM (EDTA), ácido etileno sodio glicol tetraacético 1 mM (EGTA), 250 mM sacarosa, y una mezcla de inhibidores de proteasa (5 μg / ml de pepstatina A, 10 mg / ml de leupeptina, 0,5 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), ditiotreitol 1 mM (DTT), y 25 mg / ml N-acetil-Leu-Leu-norLeu-al (ALLN)) durante 30 min sobre hielo. </li><li> Pasar los extractos celulares a través de un 22 G x 1 1/2 de aguja 30 veces y centrifugar a 890 xg a 4 ° C durante 5 minutos para aislar los núcleos. </li><li> Usar el sobrenadante para la separación de fracciones de membrana (etapa 1.2.7). Resuspender el sedimento nuclear en 0,1 ml de tampón C (HEPES 20 mM / KOH pH 7,6, 0,42 M NaCl, 2,5% (v /) de glicerol v, MgCl 1,5 mM 2, EDTA de sodio 1 mM, EGTA sódico 1 mM y una mezcla de inhibidores de proteasa (5 mg / ml de pepstatina A, 10 mg / ml de leupeptina, PMSF 0,5 mM, DTT 1 mM, y 25 mg / ml ALLN)). </li><li> Girar la suspensión a 4 ° C durante 60 min y se centrifuga a 20.000 xg en una microcentrífuga durante 20 min a 4 ° C. El sobrenadante se designa como &quot;extractos nucleares&quot;. </li><li> Calentar los extractos nucleares de 100 ° C durante 10 min con tampón 5x de carga (312,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% de SDS, 50% de glicerol, 12,5% β-mercaptoetanol, y 0,05% de azul de bromofenol) antes de someter a SDS-PAGE. </li><li> Centrifugar el sobrenadante de la original giro 890 xg a 20.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Para el análisis de transferencia de western posterior, disolver el precipitado en 0,1 ml de tampón SDS de lisis (Tris-HCl 10 mM pH 6,8, NaCl 100 mM, 1% (v / v) de dodecilsulfato de sodio (SDS), EDTA de sodio 1 mM, y 1 mM EGTA de sodio). Esto se denomina &quot;fracción de membrana&quot;. NOTA: Utilizamos 20.000 xg durante 20 minutos para sedimentar las membranas. 100.000 xg durante 10 - 20 min se ha utilizado en los papeles del laboratorio de Brown y Goldstein 15. </li><li> Incubar la fracción de membrana a 37 ° C durante 30 min y determinar la concentración de proteína mediante el ensayo de proteína de Bradford. Añadir 1 l de solución de azul de bromofenol 100x antes de someter las muestras a SDS-PAGE. </li><li> Carga 25 - 50 g de proteínas totales de la membrana en un gel de SDS-PAGE 10% 39. Dejar correr el gela 80 V durante 15 minutos, a continuación, cambie a 130 V y una duración de 115 min otra. Transferir a 140 mA durante 130 min 39. <ol><li> Para el análisis de transferencia de Western, utilice anticuerpo anti-SCAP para detectar la proteína total SCAP. Utilice proteína disulfuro isomerasa (PDI), una proteína de ER-residente 40, como un control interno. Utilice anti-SREBP-1 anticuerpo para detectar la banda N-terminal de SREBP-1. Utilice Lamin A como un control interno para los extractos nucleares 31. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Análisis de SCAP N -glycosylation en células humanas <ol><li> Cultivo celular, transfección, tratamiento y <ol><li> Para el análisis de la membrana, las células de semilla de ~ 1 × 10 6 HEK293T en un plato de 10 cm con DMEM suplementado con 5% de FBS y se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 24 horas antes de la transfección. </li><li> Diluir 4 - 8 g de GFP-SCAP plásmido (un regalo del doctor Peter Espenshade) 22 en 1 ml de suero reducido a medio y mezclar suavemente. </li><li> Añadir 8 - 16 de l reactivo de transfección de ADN con la pipeta directamente en los 1 ml reducidos medio que contiene suero plásmidos y mezclar suavemente. </li><li> Incubar el complejo reactivo / plásmido de transfección durante 25 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir complejo de transfección a las células con medio fresco y continuar a la cultura de 24 horas a 5% de CO2 y 37 ° C. </li><li> Lavar una vez con PBS y el tratamiento de las células durante 12 h con o sin glucosa (5 mM) en presencia o ausencia de tunicamicina (1 mg / ml), un inhibidor de la N -glycosylation. </li></ol></li><li> Preparar los sedimentos de membrana celular como se describe en los puntos 1.2.1, 1.2.2, 1.2.3, 1.2.7 y. </li><li> La detección de SCAP N -glycosylation <ol><li> La proteólisis tripsina <ol><li> Resuspender los sedimentos de membrana a partir de células que sobreexpresan GFP-SCAP en 114 l de tampón que contiene 10 mM HEPES · KOH (pH 7,4), KCl 10 mM, MgCl mM 2, EDTA de sodio 1,5 1 mM, y NaCl 100 mM. </li><li> incubar 5781; l alícuotas de proteínas de la membrana en la ausencia o presencia de 1 l de tripsina (1 mg / l), en un volumen total de 58 l, durante 30 minutos a 30 ° C. </li><li> Deja de reacciones mediante la adición de 2 l (400 unidades) de inhibidor de tripsina de soja. </li></ol></li><li> La desglicosilación por péptido N- glicosidasa F (PNGasa F) <ol><li> Para el tratamiento posterior con PNGasa F, añadir 10 l de solución que contenía 3,5% (peso / vol) SDS y 7% (vol / vol) 2-mercaptoetanol a cada muestra. </li><li> Después de calentar a 100 ° C durante 10 min, añadir secuencialmente 7 l de fosfato de sodio 0,5 M (pH 7,5), 7 l de 10% (v / v) de Nonidet P-40 con inhibidores de 12 × de la proteasa, y 2 l (0,5 U / l) de PNGasa F. </li><li> Después de incubación a 37 ° C durante 3 hr, detener las reacciones mediante la adición de tampón 5x de carga (Tris-HCl 312,5 mM, pH 6,8, 10% de SDS, 50% de glicerol, 12,5% β-mercaptoetanol, y 0,05% de azul de bromofenol). Calentar las mezclas a 100 ° C durante 10 my está sujeto a SDS-PAGE. Load 25-50 g de proteínas totales de la membrana en un gel de SDS-PAGE 10% 39. Correr el gel a 80 V durante 15 minutos, a continuación, cambie a 130 V para otro 115 min. Transferir a 140 mA durante 130 min. </li><li> Para el Western blot, utilizar anticuerpos 10 mg / ml de anti-SCAP (9D5) para detectar N -glycosylation y proteínas totales SCAP. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Detección de SCAP Trata de ER al Golgi mediante el uso de GFP-SCAP en células humanas <ol><li> Seed 2,5 × 10 5 células U87 en un plato de 60 mm con DMEM suplementado con 5% de FBS y se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 24 horas antes de la transfección. </li><li> Diluir 4 g de plásmido GFP-SCAP en 0,5 ml de suero reducido a medio y mezclar. </li><li> Añadir 8 l de reactivo de transfección de ADN con la pipeta directamente en 0,5 ml de medio de suero reducido que contiene plásmidos y mezclar suavemente. </li><li> Incubar el complejo reactivo / plásmido de transfección durante 25 min a la habitacióntemperatura. </li><li> Añadir complejo de transfección a las células con medio fresco y continuar a la cultura de 24 horas a 5% de CO2 y 37 ° C. </li><li> Reseed 5 - 10 × 10 4 células en una placa de 6 pocillos que contiene una hoja de cubierta de vidrio (22 mm x 22 mm) y seguir cultivo a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 horas. </li><li> Lavar una vez con PBS y el tratamiento de las células durante 12 h con o sin glucosa (5 mM) en presencia o ausencia de tunicamicina (1 mg / ml). </li><li> Lavar las células una vez con PBS y fijar en 4% de formaldehído durante 10 min. </li><li> Lavar las células tres veces con PBS, invertir los cubreobjetos, montar en portaobjetos junto con antifade reactivo, y sellar el cubreobjetos usando esmalte de uñas. </li><li> Compruebe el tráfico de GFP-SCAP utilizando un objetivo de inmersión en aceite 63X en un microscopio confocal de barrido láser 41. </li></ol>

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<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-Mediated+N-glycosylation+of+SCAP+Is+Essential+for+SREBP-1+Activation+and+Tumor+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Glucose-Mediated N-glycosylation of SCAP Is Essential for SREBP-1 Activation and Tumor Growth.</a> Cancer Cell. 28, 569-581 (2015).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este estudio, se describe un protocolo para el aislamiento de fracciones de membrana en las células humanas y para la preparación de las muestras para la detección de -glycosylation SCAP N y la proteína total mediante el uso de transferencia Western. Se proporciona además un método para controlar el tráfico de SCAP mediante el uso de GFP-etiquetado y microscopía confocal. El método se utiliza específicamente para analizar las proteínas de membrana y es una herramienta importante para investigar SCAP N</e...

La desregulación del metabolismo de los lípidos es una característica común de cáncer y enfermedades metabólicas 1-6. En estos procesos, las proteínas reguladoras de unión al elemento de esterol-(SREBPs), una familia de factores de transcripción, juegan un papel crítico en el control de la expresión de genes importantes para la absorción y síntesis de colesterol, ácidos grasos, fosfolípidos y 7-10. SREBPs, incluyendo SREBP-1a, SREBP-1c, y SREBP-2, se sintetizan como precursores inactivos que se unen a la membrana del retículo endoplásmico (ER) en virtud de dos dominios transmembrana 7. La N-terminal de SREBPs contiene un dominio de unión a ADN para la transactivación de genes diana 11. El C-terminal de los precursores de SREBP une a la proteína SREBP escisión activadora (SCAP) 12,13, una proteína de membrana politópica que juega un papel fundamental en la regulación de la estabilidad y la activación SREBP 14-16. la eje-tación de la función de la transcripción requiere la translocación del complejo SCAP / SREBP desde el RE al aparato de Golgi, donde dos proteasas escinden secuencialmente SREBP y liberan su fragmento N-terminal, que entra entonces en el núcleo para la transactivación de genes lipogénicos 7. En estos procesos, los niveles de esteroles en la membrana del ER controlan la salida del complejo SCAP / SREBP del ER 7,17. Bajo condiciones de alta esterol, esterol se une a SCAP o ER-residente inducida por insulina gen de la proteína-1 (Insig-1) o -2 (Insig-2), la mejora de la asociación de SCAP con Insigs que mantengan el complejo SCAP / SREBP en el ER 18-20. Cuando los niveles de esteroles disminuyen, SCAP se disocia con Insigs. Esto conduce a un cambio conformacional SCAP, que permite la interacción con proteínas de la cubierta SCAP comunes complejo (COP) II. El complejo media la incorporación del SCAP / SREBP en las vesículas en ciernes y dirige su transporte desde el ER al Golgi 21,22. Al TransLocación al Golgi, SREBPs se escinden secuencialmente por Site-1 y Site-2 proteasas, lo que conduce a la liberación de la N-terminal 7,23-29. Proteína SCAP lleva tres oligosacáridos N -vinculada a asparagina (N) posiciona N263, N590, N641 y 15. Recientemente hemos revelado que la glucosa mediada por N -glycosylation de SCAP en estos sitios es una condición previa para el tráfico de SCAP / SREBP desde el RE hasta el aparato de Golgi en condiciones de esterol bajas 30-32. La pérdida de la glicosilación SCAP a través de la mutación de los tres asparagina a glutamina (NNN a QQQ) desactiva el tráfico del complejo SCAP / SREBP y los resultados en la inestabilidad de la proteína SCAP y la reducción de la activación de SREBP 31. Nuestros datos recientes también demuestran que SREBP-1 es muy activa en el glioblastoma y regulada por SCAP N -glycosylation 4,31,33,34. Orientación / SREBP-1 de señalización SCAP está emergiendo como una nueva estrategia para el tratamiento de tumores malignos y s metabólicosyndromes 1,3,35-38. Por lo tanto, es importante desarrollar un método eficaz para analizar los niveles de proteína SCAP y N -glycosylation y supervisar su tráfico de células y tejidos humanos de pacientes. La región luminal de proteínas SCAP (aminoácidos 540-707) en el RE contiene dos sitios -glycosylation N (N590 y N641) que están protegidas de proteólisis cuando las membranas intactas se tratan con tripsina 15. Este fragmento luminal tiene un peso molecular de ~ 30 kDa que es lo suficientemente pequeño como para permitir la resolución de las variantes glicosiladas individuales de SCAP por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) 15,31. A continuación, se proporciona un método para detectar N -glycosylation de SCAP y la proteína total en las células humanas. Este protocolo se deriva del método descrito en las publicaciones del laboratorio de Brown y Goldstein 15 y nuestra reciente publicación 31. El protocolo puede ser utilizado en tél estudio de la proteína SCAP a partir de células de mamíferos.

<table><tbody><tr><td>Reactivo de transfección de ADN X-treme GENE HP Roche</td><td>6366236001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>medio Opti-MEMI</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>tripsina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T6567</td><td></td></tr><tr><td>inhibidor de tripsina de soja</td><td>Sigma</td><td>T9777</td><td></td></tr><tr><td>PNGasa F&nbsp;</td><td>Anticuerpo Sigma</td><td>P7367</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SCAP (9D5)&nbsp; &nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-13553</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo GFP&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo SREBP-1 (IgG-2A4)</td><td>BD Pharmingen</td><td>557036</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo PDI (H-17)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-30932</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Lamin A (H-102)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20680</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo SCAP (a.a 450-500)</td><td>Bethyl Laboratories, Inc.</td><td>A303-554A</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM) sin glucosa, piruvato y glutamina&nbsp; &nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>17-207-CV</td><td>Añadir 1 mM de piravato y 4 mM de glutamina antes de usar</td></tr><tr><td>22 G x 1 1/2 aguja</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>pepstatina A</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>leupeptina</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>ALLN</td><td>Sigma</td><td>A6185</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa</td><td>GE</td><td>RPN3032D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Solución 0,5 M pH 8,5 100 ml</td><td>VWR</td><td>82023-102</td><td></td></tr><tr><td>EGTA 0,5 M estéril (pH 8,0) 50 ml</td><td>Fisher Scentific</td><td>50255956</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS</td><td>Thermo scientific</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>azul de bromofenol</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>reactivo antidecoloración de oro prolongado con dapi</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>piruvato de sodio</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de scap<em&gt; n</em&gt; -glycosylation y el tráfico en las células humanas

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

La lipogénesis elevada es una característica común del cáncer y las enfermedades metabólicas. Las proteínas de unión a elementos reguladores de esteroles (SREBP), una familia de factores de transcripción unidos a la membrana que controlan la expresión de genes importantes para la síntesis de colesterol, ácidos grasos y fosfolípidos, se regulan frecuentemente al alza en estas enfermedades. En el proceso de translocación nuclear de SREBP, la proteína activadora de la escisión de SREBP (SCAP) desempeña un papel central en el tráfico de SREBP desde el retículo endoplásmico (RE) hasta el Golgi y en la posterior activación de la proteólisis. Recientemente, descubrimos que la N-glicosilación mediada por glucosa de SCAP es una condición previa para la salida de SCAP/SREBP del RE y el movimiento al Golgi. La N-glicosilación estabiliza el SCAP y dirige el tráfico de SCAP/SREBP. En este trabajo se describe un protocolo para el aislamiento de fracciones de membrana en células humanas y para la preparación de las muestras para la detección de N-glicosilación de SCAP y proteína total mediante el uso de Western blot. Además, proporcionamos un método para monitorear el tráfico de SCAP mediante el uso de microscopía confocal. Este protocolo es apropiado para la investigación de la N-glicosilación y el tráfico de SCAP en células de mamíferos.

La Figura 1 muestra la detección de proteína SCAP endógeno y SREBP-1 forma nuclear en las células de glioblastoma U87 humanos en respuesta a la estimulación de glucosa mediante el uso de transferencia Western. El SCAP proteína de membrana se detecta en la &quot;fracción de membrana&quot;. La forma de núcleo (N-terminal) de SREBP-1 se detecta en los &quot;extractos nucleares&quot;. El nivel de proteína SCAP (PDI sirve como un control interno de las proteínas de memb...

Se describe un método modificado para el aislamiento de la fracción de membrana a partir de células humanas y de preparación de muestras para la detección de -glycosylation SCAP N y la proteína total mediante el uso de transferencia Western. Se introduce además un método de GFP-etiquetado para monitorear el tráfico de SCAP mediante microscopía confocal. Este protocolo se puede utilizar en los laboratorios de biología regulares.

Análisis de SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation Y el tráfico en las células humanas

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

El objetivo general de este protocolo es proporcionar un enfoque sencillo para analizar la N-glicosilación de SCAP y su tráfico en células humanas. Este método se utiliza para analizar la N-glicosilación de SCAP, que es indispensable para el tráfico de SCAP y la activación del metabolismo lipídico mediado por SREBP en células de mamífero. En comparación con el método convencional que utiliza lectinas, nuestro método ofrece un procedimiento simple para identificar la N-glicosilación de SCAP, detectando su cambio de movilidad tras la eliminación de la N-glicano mediante PNGasa.Aunque este método puede proporcionar una visión del cáncer, también se puede aplicar a otros sistemas, como enfermedades cardiovasculares y síndromes metabólicos. Para comenzar este procedimiento, siembre una vez 10⁶ células U87 en un recipiente de 10 centímetros con DMEM suplementado con 5% FBS, e incube las células a 37 grados Celsius y 5% CO₂ durante 24 horas antes del tratamiento. A continuación, lave las células una vez con PBS.A continuación, cambie el PBS al medio DMEM fresco con o sin glucosa durante 12 horas. Para preparar fracciones de membrana celular y extractos nucleares, lave las células una vez

analysis-of-scap-n-glycosylation-and-trafficking-in-human-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se describe un método para el análisis de la alteración de la N-glicanos ligados a través de los primeros años de vida de las glicoproteínas después de su biosíntesis en células de mamíferos. Esto se logra mediante pulso-caza análisis de glicanos metabólicamente etiquetados, liberación enzimática de las glicoproteínas y análisis por HPLC.

Pulso-caza de análisis de cadenas de azúcares unidos a N de glicoproteínas en células de mamífero

Un método específico y sensible para profundizar en el perfil de expresión de los antígenos de glucoesfingolípidos en órganos y células inmunes se describe. El método se aprovecha de la espectrometría de masas de iones trampa permitiendo paso a paso fragmentación de las moléculas de glucoesfingolípidos para el análisis estructural, en comparación con los estándares de síntesis química.

Análisis espectrométrico de masas de Antígenos glicoesfingolípido

Se describe un protocolo de tinción estándar de anticuerpos para su uso en la microscopía para determinar la expresión en la membrana y la localización de los gangliósidos en reposo y células T CD4 + vírgenes humanos activados. También se describen en tiempo real PCR experimentos usando &lt;40.000 células que no requieren kits adicionales bajos de ARN de entrada.

Preparación de CD4<sup&gt; +</sup&gt; Las células T para el Análisis de GD3 y GD2 gangliósidos membrana Expresión mediante microscopía

Presentamos los enfoques para la caracterización Biofísica y estructural de las glicoproteínas con el doblez de la inmunoglobulina por interferometría de biocapa, calorimetría isotérmica de titulación y Cristalografía de rayos x.

Caracterización de las glicoproteínas con el doblez de la inmunoglobulina por cristalografía de rayos x y técnicas biofísicas

Aquí se presenta un protocolo que combina un sistema de cocultivo endotelial neuronal in vitro e incorporación metabólica de sialoglicano con grupos funcionales bioortogonales para expandir las células primarias del tallo neural y del progenitor y etiquetar su superficie sialoglycoproteínas para el análisis de imágenes o espectrometría de masas de marcadores de superficie celular.

Identificación de marcadores de superficie celular de células madre neuronales primarias y células progenitoras por etiquetado metabólico de sialoglicano

Transporte retrógrado de proteínas de la superficie de la célula al Golgi es esencial para mantener la homeostasis de la membrana. Aquí, describimos un método para analizar bioquímicamente transporte de superficie de Golgi de la célula de proteínas recombinantes utilizando nanobodies funcionalizados en células HeLa.

Análisis de absorción endocíticas y transporte retrógrado a la red Trans-Golgi en células cultivadas de Nanobodies funcionalizados

Las modificaciones post-traduccionales (PTM) cambian las estructuras y funciones de las proteínas. Los métodos para el enriquecimiento simultáneo de múltiples tipos de PTM pueden maximizar la cobertura en los análisis. Presentamos un protocolo que utiliza cromatografía de afinidad metálica inmovilizada ti(IV) de doble funcionalidad seguida de espectrometría de masas para el enriquecimiento y análisis simultáneo de la proteína N-glicosilación y fosforilación en tejidos pancreáticos.

Una estrategia de enriquecimiento de spin-tip para el análisis simultáneo de N-glicopéptidos y fosfopéptidos de tejidos pancreáticos humanos

Este protocolo describe varios métodos que pueden ayudar en el estudio de la biología de ATG9A, incluida la inmunofluorescencia seguida del análisis de imágenes, las consideraciones de sobreexpresión transitoria y la investigación del estado de glicosilación de ATG9A mediante Western blot.

Obtención de imágenes de ATG9A, una proteína de membrana de expansión múltiple

Este protocolo detalla el método de glicoproteómica guiada por glucómicos, una tecnología ómica integrada que ofrece información completa sobre el glicoproteoma heterogéneo en microambientes tumorales complejos necesarios para comprender mejor la glicobiología de los cánceres.

La glicoproteómica guiada por glucómica facilita el perfil completo del glicoproteoma en microambientes tumorales complejos 

Aquí, proponemos un protocolo simple que combina ingeniería de oligosacáridos metabólicos, química de clic y microscopía de expansión que permite la obtención de imágenes de N-glicoproteínas sialiladas intracelulares con resolución mejorada utilizando equipos de microscopía de rutina.

Visualización de la sialilación intracelular con química de clic y microscopía de expansión

Aprende a analizar la N-glicosilación y el tráfico de SCAP en células humanas mediante fraccionamiento de membranas, western blot y microscopía confocal. Este método simplificado facilita el estudio del metabolismo lipídico.

Análisis de SCAP

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