Name: Detección de Trypanosoma brucei Variant glicoproteína de superficie de conmutación por Magnetic Activated Cell Sorting y Citometría de Flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprende a aislar Trypanosoma brucei con VSG específica mediante MACS y citometría de flujo para detectar variantes conmutadas raras. Este método acelera el estudio de la variación antigénica en tripanosomas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nos gustaría reconocer Cruz de San Jorge de asesoramiento general sobre la biología tripanosoma. Este trabajo también fue apoyado por una beca de la CME Fundación Bill y Melinda Gates para DS, un NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1325261) para MRM y un NIH / NIAID (subvención # AI085973) para FNP. Agradecemos a Galadriel Hovel-Miner para el uso de la cepa que contiene el gen y el reconocimiento del sitio I-SCEI.

NOTA: Durante todo el procedimiento, es necesario para mantener las células en hielo. medios fríos también deben utilizarse en todas partes. La recolección de la muestra 1. <ol><li> Crecer Lister 427 tripanosomas cepa del torrente sanguíneo a una densidad de 0,5 - 1 millones / ml. Lo mejor es comenzar culturas con un pequeño número de parásitos. Centrifugar 50 x 10 6 células / muestra durante 10 minutos a 1.500 x g. Asegúrese de dejar 1 x 10 6 células en cultivo para su uso posterior como controles de anticuerpos positivos y negativos. NOTA: Este protocolo también se puede utilizar en tripanosomas aisladas a partir de sangre de animales (véase la discusión para los detalles). </li><li> Pipeta o verter fuera la mayor parte del sobrenadante (dejar alrededor de 750 l). Transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Girar las células a 4 ° C durante 4 min a 5.200 xg en una microcentrífuga y eliminar el sobrenadante. </li></ol> 2. El etiquetado Magnética <ol><li> Resuspender las células en 150 l de medio de cultivo (HMI-9 wiTH suero por ejemplo) + anticuerpo anti-VSG primario a la dilución apropiada. NOTA: El anticuerpo anti-VSG está hecho en casa y se utiliza en una dilución de 1:50. Es importante usar un anticuerpo primario anti-VSG que no está marcado con un fluoróforo. </li><li> células Vortex utilizando un vórtice adaptador-60 a una velocidad de 6-8 en una habitación fría a 4 ° C durante 10 min. Se lava con 800 - 1.000 l fría HMI-9 con suero. </li><li> Giran a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg y aspirar el sobrenadante. Se lava con 1 ml de HMI-9 con suero y girar como antes. Aspirar el sobrenadante. sedimento se vuelve a suspender en 100 l de HMI-9 con suero. </li><li> Añadir 110 l de células activadas por la clasificación magnética microperlas (MSC). Utilice anti-ratón, anti-conejo, o perlas anti-biotina como apropiado para el anticuerpo anti-VSG primaria. Mezclar bien. células de vórtice en una habitación fría a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Mientras que las células se vórtex, configurar una columna de separación / muestra magnético activado en un imán separación. Asegúrese de tener una rereceptáculo (se utiliza un tubo de centrífuga de 15 ml) en la columna para recoger el flujo continuo. La instalación del equipo en una habitación fría. </li><li> Añadir 2 ml de HMI-9 con suero a la columna de primera. Después de cebar lugar un tubo de centrífuga de 15 ml en la columna para recoger flujo a través de cada muestra. </li><li> Después de los 10 minutos de incubación en el paso 2.4, añadir 800-1.000 l fría HMI-9 con suero. Giran a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg y retirar el sobrenadante para eliminar el anticuerpo no unido. Lavar con 1 ml de HMI-9 con suero y repetición dejando 100 l del sobrenadante. </li><li> Flick el tubo de centrífuga vigorosamente e inspeccione visualmente el tubo para asegurarse de que el sedimento se resuspendió completamente. Añadir 1 ml de HMI-9 con suero y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de que las células se volvieron a suspender bien. </li></ol> 3. Separación Magnética <ol><li> Asegúrese de que las columnas están preparados como se describe anteriormente. Aplicar las células a la columna. Suma de flujo continuo con las células que expresan el VS no dominanteG. 1 ml de medio + tripanosomas típicamente se lleva a 6 - 7 min a fluir a través de la columna. </li><li> Lavar 2 veces con 1 ml de HMI-9 con suero y recoger de flujo continuo en el mismo tubo como en el paso 3.1. </li><li> flujo a través Divide (3 ml) en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. NOTA: Estas se pueden combinar más tarde o medio se pueden utilizar para aislar el ARN, etc. </li><li> Retirar la columna del imán. Añadir 3 ml de HMI-9 con suero a la columna y hundir la columna en un tubo de centrífuga de 15 ml para obtener células que expresan la partida, dominante VSG. Eliminar 300 l de material eluido para su posterior análisis. Mantener estas células en hielo. </li><li> Para su uso como un positivo y un control negativo, una duración aproximada de 1 millón de células del cultivo a partir de células de control cada vez mayor a 37 ° C (los que no se espera que cambie con frecuencia) y pipeta de ellos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. NOTA: Las células de control positivo se tiñeron con anticuerpo marcado con fluoróforo en el paso 4.1. Negativo células de control remaen sin teñir en el resto del protocolo. </li><li> muestras de giro de flujo continuo y positivo muestra de control de anticuerpos a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg y eliminar el sobrenadante. NOTA: Otra alícuota 300 l de células eluidas se puede utilizar como un control positivo para la tinción de anti-VSG. </li></ol> 4. La tinción para identificar los contaminantes y de Conmutación <ol><li> muestras de flujo a través de Resuspender las células de control positivo y en 100 l de HMI-9 con suero +, anticuerpo primario, marcada con fluoróforo anti-VSG a la dilución apropiada. NOTA: El anticuerpo anti-VSG marcado está hecho en casa y se utiliza en una dilución de 1: 1000. El fluoróforo marcado, anti-VSG puede ser de la misma fuente que el anticuerpo no marcado en la separación MACS step.There debe ser de 3 ml de muestra de flujo a través de dos tubos de microcentrífuga siguientes paso 3.5. </li><li> Para analizar todo el flujo de paso por citometría de flujo, se combinan las bolitas en los dos tubos de microcentrífuga mientras que re-susen espera de las muestras en 100 l de HMI-9 con el anticuerpo anti-VSG + suero. Mezclar bien. </li><li> células de vórtice en una habitación fría a 4 ° C durante 10 min. Añadir 800 - 1000 l fría HMI-9 con suero. muestras de giro a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg y eliminar el sobrenadante para eliminar el anticuerpo no unido. </li><li> Lavar las células con 1 ml de HMI-9 con suero. muestras de giro a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg y eliminar el sobrenadante. Durante este último giro, centrifugar las muestras eluidas-desde el paso 3.4 y la muestra de control negativo. </li><li> Volver a suspender todo el filtrado y muestras eluidas en: 148,5 l HMI-9 con suero, 25 l contar bolas absoluto y 1,5 l solución yoduro de propidio (175 l en total) tinción. Volver a suspender las muestras de control positivas y negativas de anticuerpos en 175 l HMI-9 con suero. Asegúrese de registrar el número de contar bolas absolutos / 25 l para el lote particular usado. </li><li> Ejecutar todas las muestras a través de un citómetro de flujo y recoger datos. Las células muertas manchar como PI <sup&gt; +. Los contaminantes se tiñen como PI - VSG +. Sensores, se tiñen como PI - VSG - 8. </li><li> Calcular las frecuencias de conmutación utilizando citometría de flujo de datos. NOTA: Para obtener instrucciones sobre cómo calcular las frecuencias de conmutación, por favor consulte el archivo suplementario <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">Citometría de Flujo Calculations.docx</a> y en la Tabla 1. </li></ol>

<ol><li>Horn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+in+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation in African trypanosomes.</a> Molecular & Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).</li>
<li>Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigen+switching+rates+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).</li>
<li>Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+exchange+can+be+an+important+mechanism+of+variant+surface+glycoprotein+gene+switching+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).</li>
<li>Turner, C. M., Barry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei+rhodesiense+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections.</a> Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).</li>
<li>Miller, E. N., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigenic+types+appearing+in+first+relapse+populations+of+clones+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).</li>
<li>Horn, D., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Trypanosoma+brucei+vsg+expression+site+switching+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro.</a> Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).</li>
<li>Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histone+methyltransferase+modulates+antigenic+variation+in+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes.</a> PLoS Biol. 6 (7), e161(2008).</li>
<li>Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast-endonuclease-generated+DNA+break+induces+antigenic+switching+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).</li>
<li>Engstler, M., Pfohl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Flow-Mediated+Protein+Sorting+on+the+Cell+Surface+of+Trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes.</a> Cell. 131 (3), 505-515 (2007).</li>
<li>Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+dynamics+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei.</a> Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Con respecto a la técnica experimental, el componente más crítico del protocolo es mantener todas las muestras frío. Los tripanosomas internalizan muy rápidamente anticuerpo unido a su superficie 9, pero este proceso es dependiente de la motilidad, y no influye en el ensayo, siempre y cuando las células se mantienen a 4 ° C. Todas las muestras deben mantenerse siempre en hielo, y pipeteo debe hacerse rápidamente para minimizar la exposición al ambiente de laboratorio C 25 °. Fría HMI-9 con suero debe estar di...

El parásito protozoario Trypanosoma brucei, es un agente causal de las enfermedades que afectan a los seres humanos (a través de brucei gambiense y Trypanosoma rhodesiense Trypanosoma brucei) y animales (a través de Trypanosoma brucei brucei) en toda el África subsahariana. Se transmite al huésped de mamífero a través de la saliva de la mosca tsé-tsé vector. Tanto humanos como la tripanosomiasis africana animales causan una carga económica grave en las regiones endémicas, y pocos fármacos están disponibles o en desarrollo para tratar cualquiera de las enfermedades. La comprensión de los mecanismos de evasión inmune es crítico para el desarrollo de fármacos para la tripanosomiasis. La variación antigénica de la densa, la variante glicoproteína de superficie (VSG) la capa que cubre el parásito es uno de los principales medios por los cuales T. brucei evade la respuesta de anticuerpos de los mamíferos. Existen aproximadamente 2000 variantes del gen VSG en el genoma tripanosoma, pero sólo uno se transcribe en un momento dado de una de ~ 15 expressitios de Sión. &#39;Cambio&#39; de la VSG expresada puede ocurrir ya sea mediante la copia de un gen VSG en el sitio de expresión activa, o por la activación transcripcional de un sitio de expresión previamente silenciosa (revisado en 1). Aunque mucho trabajo se ha dedicado a la comprensión de la variación antigénica en T. brucei, los factores que influyen en la frecuencia de conmutación son aún poco conocidos. Los estudios realizados hasta la fecha se han visto obstaculizados por el hecho de que mientras que la conmutación se produce estocásticamente in vitro, frecuencias de conmutación son muy bajos, del orden de 1 a unos 10 6 células 2. Esto hace que sea difícil de medir si un determinado factor aumenta o disminuye la frecuencia de conmutación, ya que el cambio es difícil de detectar en el primer lugar. Antes de 2009, los métodos para el aislamiento de los conmutadores en una población dada eran muy largo y laborioso. Estas células pases a través de tripanosomas ratones inmunizados contra la VSG dominante y luego, la cosecha incluidosun día más tarde 3, o contar cientos de células por inmunofluorescencia 4,5. Otra estrategia se basa en la selección para la resistencia a los medicamentos para aislar conmutadores 6. Debido a que los tripanosomas africanos cultivadas in vitro se hacen típicamente de una gran población que expresa una variante importante, y una población mucho más pequeña de conmutadores que expresan variantes alternativas, nos referimos a la variante importante en todo este documento como la VSG dominante, de partida. Al hacerlo, que de ninguna manera deseamos dar a entender que esta importante variante tiene una mayor aptitud que otras variantes en la población. Aquí se describe un método que se puede medir de manera fiable el número de tripanosomas que expresa un VSG no dominante en una población dada en 3-4 horas. Este método es particularmente útil para cuando se quiere determinar si una manipulación genética dado o tratamiento con fármacos aumenta el número de células de conmutación en una población. En lugar de liberar a la población de células que expresan el dominante, a partir VSG través de las drogas o por medios inmunológicos, estas células son eliminadas por primera recubrimiento con perlas magnéticas acopladas al anticuerpo contra la VSG dominante y luego aislarlos en una columna magnética. La población de conmutación se recoge entonces en el flujo a través y se tiñó otra vez con un anticuerpo marcado anti-VSG fluoróforo para identificar contaminantes. La cuantificación se logra mediante la adición de un número definido de contar bolas absolutas para cada muestra de manera que la relación de perlas a células se puede determinar y se usa para cuantificar el número de conmutadores en la población 7.

<table><tbody><tr><td>anticuerpo anti-VSG no marcado</td><td>n/a</td><td>n/a</td> El <td>anticuerpo VSG se fabrica internamente</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-VSG marcado con fluoróforo</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>El anticuerpo VSG se fabrica internamente</td></tr><tr><td>Medios HMI-9</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>HMI-9 se fabrica</td></tr><tr><td>internamente Yoduro de propidio</td><td>BD Pharmingen</td><td>556463</td><td></td></tr><tr><td>CountBrillantes perlas de conteo absolutas</td><td>Thermofisher Columnas Scientific</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>LD</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Imán MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Separador magnético MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>adaptador de vórtice-60</td><td>ThermoFisher científico</td><td>AM10014</td><td></td></tr><tr><td>citómetro de flujo</td><td>Coulter</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>software de análisis para citómetros de flujo</td><td>FloJo</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

detección de<em&gt; trypanosoma brucei</em&gt; variant glicoproteína de superficie de conmutación por magnetic activated cell sorting y citometría de flujo

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, un parásito protozoario que causa tripanosomiasis africana humana y animal (conocida como enfermedad del sueño y nagana, respectivamente) circula entre un vector tse-tsé y un huésped mamífero. Evade el sistema inmunitario del huésped de los mamíferos cambiando periódicamente la glicoproteína de superficie densa y variante (VSG) que cubre su superficie. La detección de la variación antigénica en Trypanosoma brucei puede ser engorrosa y laboriosa. Aquí, presentamos un método para cuantificar el número de parásitos que se han "cambiado" para expresar un nuevo VSG en una población dada. Los parásitos se tiñen primero con un anticuerpo contra el VSG inicial y luego se tiñen con un anticuerpo secundario unido a una perla magnética. A continuación, los parásitos que expresan la VSG inicial se separan del resto de la población haciendo pasar los parásitos por una columna unida a un imán. Los parásitos que expresan el VSG dominante de inicio se retienen en la columna, mientras que el flujo contiene parásitos que expresan un nuevo VSG, así como algunos contaminantes que expresan el VSG de inicio. Esta población de flujo se tiñe de nuevo con un anticuerpo marcado con fluorescencia contra el VSG inicial para marcar contaminantes, y yoduro de propidio (PI), que marca las células muertas. Un número conocido de perlas de recuento absolutas que son visibles por citometría de flujo se agregan a la población de flujo continuo. La relación entre las perlas y el número de células recogidas se puede utilizar para extrapolar el número de células de toda la muestra. La citometría de flujo se utiliza para cuantificar la población de conmutadores mediante el recuento del número de células PI negativas que no se tiñen positivamente para el VSG inicial y dominante. A continuación, se puede calcular la proporción de conmutadores en la población utilizando los datos de citometría de flujo.

El método aquí descrito se utilizó para demostrar que las roturas de doble hebra dentro del sitio de expresión VSG aumentado el número de conmutadores en una población 8. Aquí, mostramos los resultados representativos de una población de tripanosomas que han sido inducidos de manera similar para generar una rotura de doble cadena en el lugar de expresión. Comparamos estos tripanosomas a aquellos que no han sido inducidos para generar una rotura de doble cadena. La figu...

Los tripanosomas africanos cultivados in vitro experimentan variación antigénica a una tasa baja, de modo que las poblaciones están formadas por parásitos que expresan un tipo de glicoproteína de superficie (VSG) variante dominante y una pequeña población de variantes "conmutadas". Este protocolo describe un método rápido para detectar y cuantificar estas poblaciones.

Detección de<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant glicoproteína de superficie de conmutación por Magnetic Activated Cell Sorting y Citometría de Flujo

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

El objetivo general de este método es aislar tripanosomas que expresan una glicoproteína de superficie variable particular, o VSG, del resto de la población e identificar parásitos que han cambiado desde la VSG dominante inicial a cualquier otra VSG. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología de los tripanosomas, como, cuáles son los factores o eventos que influyen en el cambio de VSG en una población de parásitos. La principal ventaja de esta técnica es que es más rápida que los métodos publicados anteriormente y permite una cuantificación sencilla de las células que cambian frente a las que no cambian.Cuando el laboratorio comenzó por primera vez a trabajar en la variación antigénica, el primer problema fue cómo detectar los eventos raros de conmutación. Este tipo de problema ya había sido resuelto en inmunología varios años atrás, mediante el uso de clasificación magnética activada de células para enriquecer células que eran negativas para un rasgo particular. Adaptar este proceso de no selección a la variación antigénica parecía una idea realmente prometedora.Para comenzar, los tripanosomas sanguíneos de la cepa Lister 427 deben cultivarse hasta una densidad de 0,5 a 100.000 por mililitro. Aliquotar una muestra de 50 × 10⁶ células en un tubo de 15 mL y luego centrifugar. Guardar 1 × 10⁶ células y el cultivo para usar posteriormente como controles positivo y negativo de anticuerpos.Aspire la mayor parte del sobrenadante, dejando aproximadamente 750 microlitros en el tubo. Transfiera las células a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Finalmente, centrifugue las células a cuatro grados Celsius durante cuatro minutos a 2800 ×g.Luego, aspire y retire todo el sobrenadante. Reuspenda las células en 150 microlitros de medio de cultivo, más el anticuerpo primario antivariante de la glicoproteína de superficie o anti VSG en la dilución adecuada. A continuación, vortexee las células a cuatro grados Celsius durante 10 minutos.Lave con 800 a 1000 microlitros de medio de cultivo frío. Centrifugue las células a cuatro grados Celsius durante cuatro minutos a 5200 veces g. Después de aspirar el sobrenadante, lave las células con un mililitro de medio de cultivo y centrifugue nuevamente.Elimine el sobrenadante y resuspenda el precipitado en 100 microlitros de medio de cultivo. Añada 110 microlitros de microesferas magnéticas de separación celular del tipo adecuado para el anticuerpo primario. Mezcle bien pipeteando arriba y abajo y luego mediante vortex.Mientras las células se agitan en vórtice, prepare una columna de separación activada por imán. Coloque un tubo de 15 mililitros debajo para recoger el medio de cebado. Añada dos mililitros de medio de cultivo para cebado de la columna.A continuación, retire la muestra del vórtex y agregue de 800 a 1000 microlitros de medio de cultivo frío. Centrifugue la muestra y luego retire el sobrenadante para eliminar el anticuerpo no unido. Lave las células del sedimento con un mililitro de medio de cultivo y centrifugue nuevamente.En este paso, aspire el sobrenadante pero deje 100 microlitros en el tubo. Agite vigorosamente el tubo de centrífuga hasta que el precipitado se resuspenda completamente. Añada un mililitro de medio de cultivo y pipetee hacia arriba y hacia abajo para resuspender completamente las células.Retire el tubo cónico de 15 milímetros utilizado para recoger el medio de cebado y sustitúyalo por un tubo cónico nuevo de 15 mililitros para recoger el flujo que contiene los parásitos cambiados. Aplique la suspensión celular a la columna cebada. Recoja el flujo en un tubo de 15 mililitros colocado debajo, lo cual normalmente toma entre seis y siete minutos para un mililitro de medio más los tripanosomas.A continuación, lave la columna dos veces con un mililitro de medio de cultivo y recoja el flujo de paso en el mismo tubo. Divida el flujo de paso, que debe sumar aproximadamente tres mililitros, en dos tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros. Luego, coloque los tubos sobre hielo.Agregue tres mililitros de medio de cultivo a la columna e introduzca la columna en un tubo cónico de 15 mililitros. Esto permitirá obtener las células que expresan el VSG dominante inicial. Retire 300 microlitros de este material eluido y manténgalo en hielo; el resto puede descartarse.Para crear un control positivo, tome aproximadamente 100,000 células de la cultura inicial de células y pipetéelas en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Repita este procedimiento para crear un control negativo. Centrifugue las muestras de flujo directo y la muestra de control positivo.Luego, retire y deseche el sobrenadante. Re_suspenda las células del control positivo en 100 microlitros de medio de cultivo con el anticuerpo primario marcado con fluoróforo anti-VSG en la dilución adecuada. A continuación, re_suspenda un precipitado del flujo directo en 100 microlitros de medio de cultivo con el anticuerpo primario marcado con fluoróforo anti-VSG en la dilución adecuada.Utilice la suspensión para resuspender luego el sedimento en el segundo tubo de flujo directo, obteniendo un tubo de muestra combinada. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Vortexee las células y luego añada de 800 a 1000 microlitros de medio de cultivo frío.Centrifugar las muestras a cuatro grados Celsius durante cuatro minutos a 5200 ×g y luego desechar el sobrenadante para eliminar cualquier anticuerpo no unido. Lavar las células con un mililitro de medio de cultivo, luego centrifugar las células. Los controles positivo y negativo y las células eluidas almacenadas previamente en hielo.Descarte el sobrenadante. A continuación, agregue 148,5 microlitros de medio de cultivo a las muestras. Luego, agregue 25 microlitros de perlas de conteo absoluto, seguidos de 1,5 microlitros de solución de tinción con yoduro de propidio.Re-suspender los pellet de control positivo y negativo con 175 microlitros de medio de cultivo. Ahora se pueden analizar las muestras en el citómetro de flujo. Estos gráficos de citometría de flujo muestran los resultados de la separación celular de poblaciones de tripanosomas inducidos para generar una rotura de doble cadena en el ADN frente a células no inducidas.Los paneles izquierdos muestran la dispersión directa frente a la dispersión lateral, lo que permite distinguir entre células vivas y muertas, así como las perlas agregadas a la muestra. Luego se pueden generar compuertas que determinen estas poblaciones según las características de dispersión. Los paneles derechos muestran únicamente aquellas células que pueden clasificarse como vivas en función de las compuertas de dispersión generadas en los paneles izquierdos.El VSG inicial dominante en este caso fue VSG dos. Las células que se tiñen positivamente con yoduro de propidio son células muertas. Y estas se observan en las regiones Q uno y Q dos del gráfico.Las células que se tiñen positivamente para el VSG dominante y negativamente para el yoduro de propidio se ubican en la región Q tres y son contaminantes. Finalmente, las células en Q cuatro son células viables que se tiñen negativamente para el VSG dominante, las cuales se consideran cambiadoras. Este gráfico muestra las frecuencias de cambio observadas calculadas de las poblaciones de tripanosomas con y sin roturas inducidas.El nivel de conmutación estocástica in vitro es bastante bajo. Aunque inducir una rotura da como resultado un número significativamente mayor de células que cambian al VSG no dominante. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente tres horas.mientras se realiza este procedimiento, es importante mantener las muestras frías en todo momento y resuspender adecuadamente los pellet, especialmente antes del aislamiento en la columna. Tras seguir este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos como la secuenciación de ARN para responder preguntas adicionales, como qué VSG se están expresando en una población en proceso de cambio. Aunque este método se utiliza normalmente para medir el intercambio de VSG, también puede emplearse para el aislamiento y la cuantificación de parásitos que expresan cualquier proteína de superficie de interés.

detection-trypanosoma-brucei-variant-surface-glycoprotein-switching

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Magnética modulación del sistema de biosensores se utiliza a la rápida, sensible y simplemente detectar ensayos biológicos, como las moléculas de ADN y las proteínas.

Detección rápida homogénea de Ensayos Biológicos Usando el Sistema de modulación magnética biosensores

Un método para el aislamiento de los leucocitos inflamatorios adherentes de los vasos sanguíneos cerebrales de...

Aislamiento y análisis de Brain-secuestrados Los leucocitos de<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA de ratones infectados

Los invade parásito de la malaria y se replica dentro de las células rojas de la sangre. La evaluación precisa de la invasión merozoite y parasitemia es por lo tanto crucial para evaluar el curso de la infección por malaria. Aquí se describe un protocolo basado en citometría de flujo para la medición de estos parámetros en un modelo de ratón de la malaria.

En la Evaluación in vivo de roedores Plasmodium parasitemia y Merozoite Invasión por Citometría de Flujo

Este manuscrito describe el uso de una cepa bioluminiscente de tripanosomas africanos para permitir el seguimiento de la infección en etapa tardía y demuestra cómo se pueden usar imágenes en vivo in vivo para visualizar infecciones dentro del sistema nervioso central en tiempo real.

Imágenes de bioluminiscencia para detectar la infección en fase tardía de la tripanosomiasis africana

La adición de una etiqueta a una proteína es una forma poderosa de obtener información sobre su función. Aquí, describimos un protocolo para marcar endógenamente cientos de proteínas de Trypanosoma brucei en paralelo, de modo que se pueda lograr el marcaje a escala del genoma.

De Alto Rendimiento de genes de marcado en las<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Los virus o vesículas extracelulares fueron inmunocapturados con nanopartículas magnéticas de 15 nm acopladas a anticuerpos que reconocen antígenos de superficie. Los viriones o vesículas capturadas se marcaron con anticuerpos fluorescentes contra otros antígenos de superficie. Los complejos resultantes se separaron en un campo magnético alto y se analizaron con citómetros de flujo convencionales activados por fluorescencia.

Flujo Virometry para analizar antigénica Spectra de viriones y extracelular Vesículas

Este método de separación de tripanosoma de sangre depende de su carga superficial ser menos negativa que mamífero las células de la sangre. Sangre infectada es colocada y tratada en una columna de intercambiador de aniones. Este método, más apropiado diagnóstico de la tripanosomiasis africana, proporciona parásitos purificados para las investigaciones inmunológicas, biológicas, bioquímicas, farmacéutica y biología molecular.

Purificación de tripanosomas extracelulares, incluyendo a africano, de la sangre por intercambiadores de aniones (celulosa Diethylaminoethyl columnas)

La aspiración de aguja fina es una técnica, mediante la que las células se obtienen de una lesión u órgano utilizando una aguja delgada. El material aspirado se frota, se tiñe y se examina bajo un microscopio para su diagnóstico o se utiliza para biología molecular, citometría o análisis in vitro. Es barato, simple, rápido y causa un trauma mínimo.

Detección de parásitos de tripanosoma extravascular por aspiración de aguja fina

El objetivo general de este protocolo es proporcionar instrucciones sobre cómo medir la capacidad de los anticuerpos presentes en los sueros o plasma de individuos, expuestos naturalmente a la infección por Plasmodium falciparum, para opsonizar e inducir la fagocitosis de los eritrocitos infectados por parásitos (IE).

Medición de anticuerpos que inducen la fagocitosis adquirida naturalmente a los parásitos plasmodium falciparum mediante un ensayo basado en citometría de flujo

Los parásitos sanguíneos médicos de todo el mundo se examinaron automáticamente mediante sencillos pasos en una plataforma de IA de bajo código. El diagnóstico prospectivo de los frotis sanguíneos se mejoró mediante el uso de un método de detección y clasificación de objetos en un modelo híbrido de aprendizaje profundo. La colaboración de la monitorización activa y los modelos bien entrenados ayuda a identificar los puntos críticos de transmisión de tripanosomas.

Identificación automática superior de parásitos tripanosomas mediante el uso de un modelo híbrido de aprendizaje profundo

Describimos un método para estudiar cómo responde el pH a las señales ambientales en los glicosomas del torrente sanguíneo de los tripanosomas africanos. Este enfoque implica un sensor de proteínas hereditarias sensible al pH en combinación con citometría de flujo para medir la dinámica del pH, tanto como un ensayo de curso temporal como en un formato de pantalla de alto rendimiento.

Medición de los cambios dinámicos del pH glusómico en el Trypanosoma brucei vivo

Aprende a aislar Trypanosoma brucei con VSG específica mediante MACS y citometría de flujo para detectar variantes conmutadas raras. Este método acelera el estudio de la variación antigénica en tripanosomas.

Detección de Trypanosoma brucei Variant glicoproteína de superficie de conmutación por Magnetic Activated Cell Sorting y Citometría de Flujo (Video) | JoVE Journal

Detección de

Explorar más videos