Detección de Trypanosoma brucei Variant glicoproteína de superficie de conmutación por Magnetic Activated Cell Sorting y Citometría de Flujo
19 de octubre de 2016
Los tripanosomas africanos cultivados in vitro experimentan variación antigénica a una tasa baja, de modo que las poblaciones están formadas por parásitos que expresan un tipo de glicoproteína de superficie (VSG) variante dominante y una pequeña población de variantes "conmutadas". Este protocolo describe un método rápido para detectar y cuantificar estas poblaciones.
El objetivo general de este método es aislar los tripanosomas que expresan una variante particular de la glicoproteína de superficie o VSG del resto de la población e identificar los parásitos que han cambiado de la VSG dominante inicial a cualquier otra VSG. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología del tripanosoma, como cuáles son los factores o eventos que influyen en el cambio de VSG en una población de parásitos. La principal ventaja de esta técnica es que es más rápida que los métodos publicados anteriormente y permite una fácil cuantificación de las celdas de conmutación a no conmutadoras.
Cuando el laboratorio comenzó a trabajar en la variación antigénica, el primer problema fue cómo detectar los switchers raros. Este tipo de problema se había resuelto en inmunología hace varios años, mediante el uso de la clasificación de células activadas magnéticamente para enriquecer las células que eran negativas para un rasgo particular. Trasladar el proceso de no selección a la variación antigénica parecía una idea realmente prometedora.
Para empezar, los tripanosomas del torrente sanguíneo de la cepa Lister 427 deben cultivarse hasta una densidad de 0,5 a 100.000 por mililitro. Alícuota 50 por 10 a la muestra de seis células en un tubo de 15 mililitros y luego centrífuga. Guarde una vez 10 a las seis células y el cultivo para utilizarlo posteriormente como controles de anticuerpos positivos y negativos.
Pipetea la mayor parte del sobrenadante, dejando aproximadamente 750 microlitros en el tubo. Transfiera las celdas a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Finalmente, centrifugar las células a cuatro grados centígrados durante cuatro minutos a 2800 veces g.
Y luego pipetear todo el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 150 microlitros de medio de cultivo, más el anticuerpo primario anti glicoproteína de superficie antivariante o anti VSG en la dilución adecuada. A continuación, haz un vórtice de las células a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Lavar con 800 a 1000 microlitros de medio de cultivo en frío. Centrifugar las células a cuatro grados centígrados durante cuatro minutos a 5200 veces g. Después de aspirar el sobrenadante, lavar las células con un mililitro de medio de cultivo y centrifugar nuevamente.
Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 100 microlitros de medio de cultivo. Agregue 110 microlitros de microperlas de clasificación de células activadas magnéticamente del tipo apropiado para el anticuerpo primario. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo y luego en vórtice.
Mientras las células están en vórtice, configure una columna de separación activada magnéticamente. Coloque un tubo de 15 mililitros debajo para recoger el medio de cebado. Agregue dos mililitros de medio de cultivo para cebar la columna.
A continuación, retire la muestra del vórtice y agregue de 800 a 1000 microlitros de medio de cultivo en frío. Centrifugar la muestra y, a continuación, extraer el sobrenadante para eliminar el anticuerpo no unido. Lavar las células peletizadas con un mililitro de medio de cultivo y volver a centrifugar.
Esta vez aspire el sobrenadante pero deje 100 microlitros en el tubo. Agite el tubo de centrífuga vigorosamente hasta que el pellet se vuelva a suspender por completo. Agregue un mililitro de medio de cultivo y pipetee hacia arriba y hacia abajo para resuspender completamente las células.
Retire el tubo cónico de 15 milímetros utilizado para recoger el medio de cebado y sustitúyalo por uno nuevo cónico de 15 mililitros para recoger el flujo que contiene los parásitos conmutados. Aplique la suspensión de la celda a la columna cebada. Recoja el flujo en un tubo de 15 mililitros por debajo, lo que generalmente toma de seis a siete minutos para un mililitro de medio más tripanosomas.
A continuación, lave la columna dos veces con un mililitro de medio de cultivo y recoja el flujo en el mismo tubo. Divida el flujo a través, que debe totalizar aproximadamente tres mililitros, en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Luego, coloque los tubos sobre hielo.
Agregue tres mililitros de medio de cultivo a la columna y sumérjala en un tubo de centrífuga de 15 mililitros. De esta forma se obtendrán las celdas que expresan la VSG dominante inicial. Retire 300 microlitros de este material eluido y manténgalo en hielo, el resto se puede desechar.
Para crear un control positivo, tome aproximadamente 100.000 células del cultivo inicial de células y pipetelas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Repita esto para crear un control negativo. Centrifugar las muestras de flujo continuo y la muestra de control positivo.
Y luego retire y deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender las células de control positivo en 100 microlitros de medio de cultivo con anticuerpo primario anti VSG marcado con fluoróforos en la dilución adecuada. A continuación, vuelva a suspender un gránulo de flujo continuo en 100 microlitros de medio de cultivo con anticuerpo anti VSG primario marcado con fluoróforos en la dilución adecuada.
Use la suspensión para luego resuspender el pellet en el segundo tubo de flujo, lo que da como resultado un tubo de piscina. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Agite las células y luego agregue de 800 a 1000 microlitros de medio de cultivo en frío.
Centrifugar las muestras a cuatro grados centígrados durante cuatro minutos a 5200 veces g y luego desechar el sobrenadante para eliminar cualquier anticuerpo no unido. Lave las células con un mililitro de medio de cultivo, luego centrifugue las células. Los controles positivos y negativos y las células eluidas previamente almacenadas en hielo.
Deseche el sobrenadante. Después de eso, agregue 148,5 microlitros de medio de cultivo a las muestras. A continuación, agregue 25 microlitros de perlas de conteo absoluto, seguidas de 1,5 microlitros de solución de tinción de yoduro de propidio.
Resuspender los pellets de control positivo y negativo con 175 microlitros de medio de cultivo. Las muestras ahora se pueden ejecutar en el citómetro de flujo. Estos gráficos de citometría de flujo muestran los resultados de la separación celular de las poblaciones de tripanosomas inducidos para crear una rotura de ADN de doble cadena frente a las células no inducidas.
Los paneles de la izquierda muestran la dispersión frontal frente a la lateral, lo que permite dilucidar las células vivas frente a las muertas y las perlas añadidas a la muestra. A continuación, se pueden generar puertas que las determinen en función de las características de dispersión. Los paneles de la derecha muestran solo las celdas que podrían clasificarse como activas en función de las puertas de dispersión generadas en los paneles de la izquierda.
El VSG inicial dominante en este caso fue el VSG dos. Las células que se tiñen positivamente para el yoduro de propidio son células muertas. Y estos se ven en las regiones Q uno y Q dos de la gráfica.
Las células que se tiñen positivamente para el VSG dominante y negativamente para el PI pertenecen a la región Q tres y son contaminantes. Por último, las células de Q 4 son células vivas que se tiñen negativamente para el VSG dominante, que se consideran conmutadores. Este gráfico muestra las frecuencias de conmutación observadas calculadas de las poblaciones de tripanosomas con frente a sin interrupciones inducidas.
El nivel de conmutación estocástica in vitro es bastante bajo. Si bien la inducción de una ruptura da como resultado un número significativamente mayor de células, el cambio a la VSG no dominante. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unas tres horas.
Al intentar este procedimiento, es importante mantener las muestras frías en todo momento y resuspender adecuadamente los gránulos, especialmente antes del aislamiento en la columna. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como la secuenciación de ARN, para responder a preguntas adicionales, como qué VSG se expresan en una población switch. Estos métodos se utilizan normalmente para medir la conmutación de VSG, también se pueden utilizar para el aislamiento y la cuantificación de parásitos que expresan cualquier proteína de superficie de interés.
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Descripción general
Este protocolo describe un método rápido para aislar tripanosomas africanos que expresan glicoproteínas de superficie variantes (VSG) específicas e identificar variantes cambiados dentro de poblaciones. La técnica mejora la detección de variantes poco frecuentes, facilitando el estudio de la variación antigénica en estos parásitos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Microbiología
- Inmunología
Antecedentes
- Los tripanosomas africanos presentan variación antigénica, lo que afecta su supervivencia e infectividad.
- Comprender el cambio de VSG es fundamental para desarrollar estrategias contra la tripanosomiasis.
- Los métodos anteriores para detectar los mutantes eran lentos y menos eficientes.
- Este estudio utiliza la clasificación magnética de células activada por campos magnéticos para mejorar la detección.
Objetivo del estudio
- Aislar tripanosomas que expresan VSG específicas a partir de poblaciones mixtas.
- Identificar parásitos que han cambiado desde el tipo dominante de VSG.
- Investigar los factores que influyen en el cambio de VSG.
Métodos Utilizados
- Ordenación de células activada por imán para enriquecer tipos celulares específicos.
- Análisis cuantitativo de la expresión de VSG en poblaciones de tripanosomas.
- Aislamiento de variantes de conmutación raros a partir de poblaciones dominantes.
- Comparación de tasas de conmutación entre diferentes tipos de VSG.
Resultados Principales
- El método aísla y cuantifica con éxito tripanosomas que expresan VSG.
- Demuestra una detección más rápida de los conmutadores raros en comparación con técnicas previas.
- Se obtuvieron conocimientos sobre la dinámica del cambio de VSG en poblaciones de tripanosomas.
- Implicaciones potenciales para comprender la tripanosomiasis y desarrollar tratamientos.
Conclusiones
- Este método proporciona un avance significativo en el estudio de la variación antigénica en tripanosomas.
- Abre nuevas vías para la investigación de los mecanismos de conmutación de VSG.
- La eficiencia de la técnica podría mejorar futuros estudios en la biología de los tripanosomas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Detectar variantes antigénicas raras en poblaciones de patógenos es fundamental para comprender los mecanismos de evasión inmune y orientar las estrategias terapéuticas. Este método permite la cuantificación rápida de parásitos que cambian la glucoproteína de superficie en poblaciones de tripanosomas, lo que apoya la desactivación de riesgos del blanco en el descubrimiento de fármacos antiparasitarios. El enfoque proporciona un flujo de trabajo escalable y reproducible para monitorear el cambio fenotípico relacionado con la validación preclínica de blancos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la variación antigénica como mecanismo de evasión inmunitaria en poblaciones de patógenos.
- Valor operativo: Proporciona una lectura rápida y cuantitativa de la frecuencia de conmutación para apoyar la comprobación de hipótesis sobre influencias genéticas o ambientales.
- Valor predictivo: Facilita la evaluación temprana de la estabilidad del blanco y de los mecanismos de resistencia en el cribado de compuestos antiparasitarios.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Genera una población purificada en el flujo directo enriquecida en fenotipos cambiadores, adecuada para análisis funcional o genómico posterior.
- Resultado cuantitativo: Utiliza cuentas de conteo absoluto y citometría de flujo para permitir la cuantificación absoluta de la frecuencia de cambiadores por muestra.
- Reproducibilidad: La separación magnética y la tinción estandarizada reducen la variabilidad al aislar variantes raras de poblaciones dominantes.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela directamente un mecanismo clave de virulencia en la tripanosomiasis africana, lo que respalda la validez del modelo preclínico.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Permite correlacionar tasas de conmutación con perturbaciones genéticas inducidas (por ejemplo, roturas de ADN) para validar relaciones causales.
- Continuidad traslacional: Las poblaciones de conmutadores aisladas pueden utilizarse para RNA-seq o proteómica con el fin de identificar los VSG expresados, vinculando así el fenotipo con el genotipo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, al proporcionar una lectura fenotípica de la modulación del blanco y la aparición de resistencia.
- Biología de Descubrimiento: Apoya la investigación basada en hipótesis sobre factores que influyen en el intercambio de VSG, como el daño en el ADN o las respuestas al estrés.
- Selección: Permite la preparación de poblaciones enriquecidas en células cambiadoras para pruebas de sensibilidad a compuestos o análisis de resistencia.
- Análisis: La citometría de flujo con tinción de PI y anti-VSG proporciona datos cuantitativos y multiparamétricos sobre el estado de viabilidad y la expresión de antígenos.
- Investigación Traslacional: Las fracciones de células cambiadoras aisladas permiten estudios omicas de seguimiento para caracterizar el repertorio antigénico en subpoblaciones resistentes.
- Reutilización Empresarial: El protocolo de separación magnética y citometría de flujo puede adaptarse para monitorear el intercambio en otros patógenos con variabilidad antigénica o en sistemas de expresión de proteínas recombinantes.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en el intercambio de antígenos al permitir la medición directa y cuantitativa de variantes fenotípicas raras.
- Valor operativo: Estandariza el aislamiento y la cuantificación de los intercambiadores, mejorando el rendimiento en comparación con métodos basados en clonación o secuenciación, que son intensivos en mano de obra.
- Valor estratégico: Informa decisiones de continuar o descartar al revelar tempranamente inestabilidad del blanco o mecanismos de resistencia durante el descubrimiento.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de blancos con baja frecuencia de intercambio o alta barrera genética a la resistencia.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de parásitos, tinción con anticuerpos y clasificación magnética de células activada por anticuerpos.
- Depende del acceso a citómetros de flujo con capacidades de detección de fluorescencia y dispersión.
- Necesita reactivos de anticuerpos estandarizados y titulación para isoformas específicas de VSG para evitar reacciones cruzadas.
- La adaptación a otros sistemas requiere validación de la eficiencia de separación con microesferas magnéticas y la accesibilidad del anticuerpo a los blancos superficiales.
- Las limitaciones prácticas incluyen la posible contaminación por separación incompleta y la necesidad de tinción de viabilidad para excluir células muertas.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
Sample Harvesting
2:05
Magnetic Labeling
4:05
Magnetic Separation
5:45
Staining and Identification of Contaminants and Switchers
7:32
Results: Induced Double-strand DNA Breaks Increase the Frequency of Switchers in a Population
9:01
Conclusion
