Análisis de la importación de proteínas en cloroplastos aislados de las plantas estresadas

El objetivo general de esta metodología es estudiar la importación de proteínas codificadas por el núcleo en los cloroplastos, con un enfoque particular en los efectos del estrés. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cloroplasto, como cómo se regula la importación de proteínas del cloroplasto. Una ventaja particular de esta técnica es que permite evaluar los efectos del estrés en la importación de proteínas del cloroplasto.

Aunque este método ha sido desarrollado para su uso con la planta modelo Arabidopsis thaliana, podría modificarse y adaptarse para su uso con otros sistemas, como las plantas de cultivo. El encargado de demostrar el procedimiento será Qihua Ling, un postdoc de mi laboratorio. Para comenzar, primero cultive las plantas Arabidopsis como se describe en el protocolo de texto adjunto.

Luego, cuando las plantas tengan ocho días, realice un tratamiento de estrés. Raspe suavemente las plantas de la placa de agar con la mano y colóquelas en un matraz esterilizado de medio MS líquido que contenga el factor estresante. Dependiendo de la naturaleza del experimento, también podría ser necesario colocar plantas adicionales en un matraz similar sin estresor como control.

Cubra la boca de los matraces con papel de aluminio esterilizado y deje que las plantas crezcan durante dos días más en un agitador orbital con una agitación suave. Prepare un gradiente de densidad continuo mezclando primero 13 mililitros de Percoll, 13 mililitros de dos tampones de aislamiento de cloroplastos y cinco miligramos de glutatión en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. A continuación, centrifuga la mezcla.

Después de la centrifugación, manipule el tubo con cuidado para evitar alterar el gradiente y manténgalo en hielo para usarlo más tarde. A continuación, transfiera 100 mililitros de tampón de aislamiento de cloroplastos por condición a un vaso de precipitados de un litro. Retire las plántulas del medio líquido volcándolas en un colador.

A continuación, transfiéralos al vaso de precipitados que contiene tampón de aislamiento de cloroplastos. Enjuague el pañuelo con el tampón para eliminar cualquier medio residual y luego reemplace el tampón con 100 mililitros de tampón de aislamiento fresco. Para la primera ronda de homogeneización, transfiera el tejido vegetal a un vaso de precipitados de 50 mililitros con la mano, permitiendo que el tampón anterior se escurra a través de los dedos.

A continuación, coloque la sonda del homogeneizador de tejidos en el tejido y homogeneice con dos pulsos de uno a dos segundos cada uno. Filtre el homogeneizado a través de dos capas de tela de filtración en un tubo de centrífuga de 250 mililitros. Termina apretando suavemente el paño.

Retenga el filtrado y transfiera el tejido vegetal de vuelta al vaso de precipitados de 50 mililitros. A continuación, coloque un segundo tampón de aislamiento de cloroplastos de 20 mililitros en el vaso de precipitados de 50 mililitros y añada el tejido restante que no se haya utilizado en la primera ronda de homogeneización. Repita los pasos de homogeneización y filtración cuatro veces más.

Centrifugar el homogeneizado agrupado a 1.000 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Vierta el sobrenadante inmediatamente después de la centrifugación, teniendo cuidado de no alterar el pellet. Coloque el tubo sobre hielo y vuelva a suspender el pellet en el sobrenadante residual agitando suavemente el tubo.

A continuación, utilice una pipeta Pasteur para transferir suavemente el homogeneizado a la parte superior del gradiente de densidad continuo prefabricado a través de la pared del tubo receptor. A continuación, centrifugar la muestra y el gradiente en un rotor de cangilón oscilante a 7.800 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados con el freno apagado. Cuando termine, observe las dos bandas verdes que se pueden ver en el degradado.

Deseche la banda superior, que contiene cloroplastos rotos, y use una pipeta Pasteur para transferir la banda inferior que contiene cloroplastos intactos a un tubo de centrífuga nuevo de 50 mililitros. A continuación, agregue 25 mililitros de tampón HMS en el tubo e invierta el tubo dos veces para lavar el Percoll de los cloroplastos. A continuación, vuelva a colocar el tubo en el rotor del cubo oscilante y repele los cloroplastos.

Vierta el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en el tampón residual agitando suavemente el tubo sobre hielo. Agregue de 100 a 300 microlitros adicionales del tampón HMS si es necesario, pero trate de no diluir demasiado la muestra. Almacene los cloroplastos resuspendidos en hielo.

Comience agregando cinco microlitros de los cloroplastos aislados a 495 microlitros de tampón HMS en un tubo de 1,5 mililitros. Invierta el tubo para mezclar suavemente la solución. A continuación, coloque un cubreobjetos encima de la cámara de recuento de un hemacitómetro.

Pipetee lentamente de 40 a 60 microlitros de la suspensión de cloroplasto diluida en el espacio entre el cubreobjetos y la cámara de conteo. Usando un microscopio de contraste de fase, tome imágenes de los cloroplastos con un objetivo de 20x. Los cloroplastos intactos tienen un aspecto redondo y brillante y están rodeados por un halo de luz.

A continuación, utiliza el objetivo 10x por el número de cloroplastos en 10 cuadrados grandes. El número de cloroplastos por cuadrado grande debe promediar entre 10 y 30. Si hay muy pocos o demasiados cloroplastos, ajuste el factor de dilución y repita el procedimiento.

Una vez dentro del rango adecuado, calcule el número de cloroplastos por mililitro como se describe en el protocolo de texto adjunto. Para ejecutar un curso de tiempo con tres puntos de tiempo, prepare tres tubos, cada uno de los cuales contenga una alícuota de 130 microlitros de tampón de parada de importación, y déjelos en hielo. En un tubo de dos mililitros, prepare la reacción de importación que contiene el tampón de reacción y la proteína precursora radiomarcada.

Tenga en cuenta que debe haber una reacción para cada condición que se va a probar. Utilice aproximadamente 10 millones de cloroplastos por punto de tiempo. Incubar el tubo de reacción a 25 grados centígrados en un baño de agua bajo una cantidad limitada de luz.

De vez en cuando mueve los tubos para volver a suspender los cloroplastos. Para realizar un curso de tiempo, con alícuotas de 130 mililitros de la reacción en los puntos de tiempo requeridos dentro del rango lineal de importación. Inmediatamente después de la extracción, transfiera cada alícuota de 130 microlitros a un tubo de tampón de parada de importación helado mezclado golpeando suavemente el tubo, y coloque los tubos en hielo hasta que se haya completado el curso de tiempo.

Una vez extraída la última muestra, centrifugar todas las muestras durante 30 segundos a 12.000 veces g en un microfuge. A continuación, deseche los sobrenadantes y vuelva a suspender los pellets en 15 microlitros de dos x tampón de carga de proteína. A continuación, mezcle las muestras mediante vórtice.

Por último, analice todas las muestras, además de un control de entrada de precursores, utilizando SDS-PAGE estándar y autorradiografía, fluorografía o imágenes de fósforo. PsaD es un componente de 18 kilodalton del fotosistema I que se sintetiza como un precursor más grande de 23 kilodaltons. El procesamiento a la forma madura de 18 kilodalton indica que se ha producido la importación a los cloroplastos.

El mutante sp1 de Arabidopsis estudiado aquí tiene un defecto en un importante regulador de la maquinaria de importación de proteínas del cloroplasto, la proteína sp1. En condiciones de estrés, la cantidad de importación de la proteína PsaD en los cloroplastos mutantes sp1 aumenta en relación con el tipo salvaje, pero no en condiciones normales no estresantes. Si bien la forma proteica madura de PsaD se acumuló de manera dependiente del tiempo con los cloroplastos de ambos genotipos de plantas, la tasa de importación fue significativamente mayor para los cloroplastos mutantes sp1 que para los cloroplastos de tipo salvaje.

Estos resultados implican un papel importante de la proteína sp1 en la regulación de la importación de proteínas del cloroplasto en condiciones de estrés. Una vez dominado, este método, desde el aislamiento del cloroplasto hasta la finalización del ensayo de importación, puede completarse en cinco o seis horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar todos los pasos de aislamiento de cloroplastos a cuatro grados centígrados para garantizar que los cloroplastos conserven la máxima actividad.

Después de su desarrollo inicial hace varias décadas, el ensayo de importación de proteínas de cloroplasto in vitro allanó el camino para que los investigadores en el campo exploraran muchos aspectos diferentes del mecanismo de importación de proteínas de cloroplasto. El refinamiento presentado aquí permite investigar los efectos de las condiciones de estrés en la importación de proteínas. No olvide que trabajar con material radiactivo requiere un cuidado especial.

Siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes, una bata de laboratorio y gafas de seguridad al realizar este procedimiento.