Un enfoque Facile y eficiente para la producción de micelas reticuladas reversible disulfuro

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un protocolo simple y eficaz para sintetizar micelas reticuladas de disulfuro cargadas de fármacos para la administración dirigida de fármacos. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de la nanomedicina. Por ejemplo, cómo producir de manera efectiva nanoformulaciones estables.

La principal ventaja de esta técnica es que nos permite sintetizar fácilmente micelas reticuladas de disulfuro a gran escala, lo cual es extremadamente deseable para estudios clínicos en pacientes. Para comenzar este procedimiento, agregue dos gramos de monoamina de polietilenglicol terminado en monometilo a un matraz de fondo redondo. Añade diez mililitros de DMF anhidro para disolverlo.

Enfríe con hielo. Agregue tres equivalentes de hidroxibenzotriazol, tres equivalentes de DIC y tres equivalentes de lisina protegida con di-eth-moc a un matraz de fondo redondo. A continuación, agregue diez mililitros de DMF anhidro.

Revuelva la mezcla durante 20 minutos en una placa magnética para remover. A continuación, añada la mezcla al matraz de fondo redondo que contenga polietilenglicol monometiloterminado. Retire el matraz de fondo redondo del baño de hielo, luego revuelva durante la noche a temperatura ambiente.

Una vez que se complete la agitación, confirme la finalización de la reacción como se detalla en el protocolo de texto. Agregue 200 mililitros de éter helado al matraz de reacción. Centrifugar a 6.000 x g durante seis minutos a cuatro grados centígrados para separar el polímero precipitado.

Repita el proceso de precipitación y centrifugación dos veces, redisolviendo el producto en 10 mililitros de DMF cada vez antes de la precipitación. A continuación, lave el polímero tres veces con éter helado. Conecte el tubo a una fuente de alto vacío para eliminar el éter residual.

Después de esto, agregue 20 mililitros de 20%4-Metilpiperidina en DMF al polímero. Revuelva hasta que se complete la disolución. Permita la reacción a la diversión durante tres horas.

Después de confirmar la finalización de la reacción, seque el producto polimérico. Ahora, el polímero intermedio número dos bajo vacío, luego realice pasos adicionales de síntesis de polímero como se describe en el protocolo de texto. Una vez que se produce el polímero intermedio número 10, transfiéralo a un matraz de reacción.

Agregue 30 mililitros de DMF anhidro. En un matraz nuevo, disuelva 24 equivalentes de ácido cólico activado en 20 mililitros de DMF. A continuación, añada 48 equivalentes de N, N-diisopropiletilamina.

Revuelva durante 10 minutos. Una vez finalizada la agitación, transfiera la mezcla al matraz de reacción que contiene el polímero intermedio número 10. Deja que la reacción se prolongue durante toda la noche.

Al día siguiente confirme la finalización de la reacción y precipite el polímero intermedio número 11, como se describe en el protocolo de texto. A continuación, marque el polímero intermedio en agua desionizada. Liofilizar la muestra produciendo un polvo blanco.

Después de preparar la micela, disuelva 20 miligramos de telodendrimer y cinco miligramos de PTX en un mililitro de cloroformo. Elimine el disolvente mediante un evaporador rotativo para obtener una película de polímero seco homogénea. Reconstituya la película con un mililitro de PBS por vórtice.

A continuación, sonicar durante 30 minutos a 40 kilohercios. Agregue peróxido de hidrógeno al 3% para oxidar los grupos tiol en el telodendrimmer. Realice pasos adicionales de preparación y verificación como se describe en el protocolo de texto.

Una vez completada la preparación de las micelas, mida el tamaño y la distribución del tamaño de las micelas con un instrumento de dispersión de luz dinámica. Realice las mediciones a temperatura ambiente y mantenga la concentración de micelas en un miligramo por mililitro. A continuación, prepare una solución madre de 7,5 miligramos por mililitro de dodecil sulfato de sodio en PBS.

A continuación, prepare una solución madre de 1,5 miligramos por mililitro de micelitas reticuladas de disulfuro en PBS. Con el uso de estas soluciones madre se crea una mezcla en la que la concentración final de SDS es de 2,5 miligramos por mililitro. Y la concentración de micelas es de 1,0 miligramos por mililitro.

Cargue la muestra y mida el tamaño y la distribución del tamaño de la solución micelar a intervalos de dos minutos. Después de recolectar sangre citrato fresca de ratones desnudos, centrifugar una muestra de sangre de un mililitro a 1.000 x g durante 10 minutos para recolectar glóbulos rojos. Lávelos tres veces con PBS y luego vuelva a suspender el pellet celular con PBS hasta una concentración final de 2%Mezcle 200 microlitros de suspensión de eritrocitos con una solución de 1,0 miligramo por mililitro de PTX NCM.

A continuación, mezcle 200 microlitros de suspensión de eritrocitos con una solución de 1,0 miligramo por mililitro de DCM PTX. Incube estas mezclas en un agitador de incubadora durante cuatro horas a 37 grados centígrados. Una vez completada la incubación, centrifugar las mezclas a 3.000 x g durante cinco minutos.

Transfiera 100 microlitros del sobrenadante de cada muestra a una placa de 96 pocillos. Después de esto, use un lector de microplacas para medir la absorbancia de la hemoglobina libre a 540 nanómetros. Según lo medido por la prueba de Ellman, la tasa de conversión de grupos tiol libres a enlaces disulfuro alcanzó el 85% después de 48 horas de oxidación mediada por oxígeno.

Aquí se emplea un método de oxidación mediado por peróxido de hidrógeno como método alternativo. La tasa de conversión alcanza el 88% en 30 minutos. Lo cual es 96 veces más rápido que el enfoque mediado por oxígeno.

Utilizando este enfoque más eficiente, se han producido más de 50 gramos de nanopartículas, con un tamaño de partícula medido de 27 nanómetros, con una distribución de tamaño estrecha. También se investiga la estabilidad de las micelas reticuladas de disúfido cargadas en PTX en condiciones severas de alteración de micelas. El tamaño de partícula de las micelas se mantuvo estable a lo largo del tiempo, lo que indica que se mantuvieron intactas.

Después de la introducción de GSH a una concentración intracelular, el tamaño de las micelas reticuladas de disulfuro cargado con fármaco permanece intacto durante 30 minutos, luego disminuye abruptamente a un nanómetro. Esto significa la reducción de un número crítico de enlaces disulfuro, un requisito previo para la rápida disociación de las micelas. Aquí se muestran los resultados representativos de la actividad hemolítica de las micelas cargadas con PTX.

Los NCM PTX tienen un recuento de lisis de glóbulos rojos dependiente de la dosis. Sin embargo, los DCM PTX que tienen reticulación de disulfuro no muestran actividades hemolíticas observables. Una vez dominada esta técnica se puede realizar en otro si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar agregar una cantidad igual de peróxido de hidrógeno al 3% para la formación de disulfuro. Después de este procedimiento, se puede realizar el ensayo de hemólisis para evaluar la compatibilidad sanguínea de las micelas reticuladas con disulfuro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar de manera efectiva micelas reticuladas de disulfuro cargadas con fármacos.

No olvide que algunos de estos productos químicos pueden ser extremadamente peligrosos y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal, al realizar este procedimiento.