Name: Un enfoque Facile y eficiente para la producción de micelas reticuladas reversible disulfuro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprenda a sintetizar micelas reticuladas con disulfuro cargadas con fármacos para liberación dirigida en terapia oncológica. Este protocolo utiliza oxidación mediada por peróxido de hidrógeno para obtener nanoformulaciones estables y escalables.

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Los autores agradecen a la Sra. Alisha Knudson por la ayuda editorial. También les gustaría agradecer el apoyo financiero de los NIH/NCI (3R01CA115483, a K.S.L.), el Premio PRMRP del Departamento de Defensa (W81XWH-13-1-0490, a K.S.L.), el NIH/NCI (1R01CA199668, a Y.L.) y el NIH/NICHD (1R01HD086195, a Y.L.).

Ética declaración: Mujer ratones desnudos atímicos (cepa nu / nu), 6-8 semanas de edad, fueron adquiridos y después se mantuvo en condiciones libres de patógenos según las directrices de la AAALAC y se les permitió aclimatarse durante al menos 4 días antes de cualquier experimento. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales y de acuerdo con el protocolo Nº 07-13.119 y N ° 09-15584, aprobado por el Uso de Animales y el Asesor Administrativo de Atención en la Universidad de California, Davis. 1. Síntesis de TD PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 8 -CA <ol><li> En un matraz de fondo redondo, se disuelven MeO-PEG 5K -NH 2 (2 g, 0,4 mmol) en 10 a 20 ml de dimetilformamida anhidra (DMF) y se enfría en hielo. </li><li> En un vaso de precipitados de vidrio, se disuelven 3 equiv. de 1-hidroxi-6-cloro-benzotriazol (HOBt), 3 equiv. de N, N &#39;-diisopropylcarbodiimide (DIC), y 3 equiv. de (Fmoc) 2 Lys-OH en D anhidroMF (10-15 ml). Se agita durante 15-20 minutos en una placa de agitación magnética. </li><li> Añadir la mezcla al matraz de reacción que contiene el MeO-PEG 5K -NH 2. Eliminar el baño de hielo y se agita la mezcla de reacción durante la noche a temperatura ambiente. </li><li> Confirmar la finalización de la reacción con cromatografía de capa fina (TLC) 16 y 17 de prueba de Kaiser (un color amarillo indica la ausencia de libre NH 2). Precipitar el producto polimérico 1 (MeO-PEG 5K Lys (NH-Fmoc) 2) mediante la adición de aproximadamente 200 ml de éter enfriado en hielo al matraz de reacción. Separar el polímero precipitado mediante centrifugación (6 min a 6.000 xg y 4 ° C). <ol><li> Para llevar a cabo TLC, manchar las muestras en placas de TLC recubiertas con gel de sílice. Utilice diclorometano / metanol (9: 1) como fase móvil. Observar manchas bajo una lámpara UV después de desarrollar las placas de TLC. También se puede utilizar la ninhidrina reactivo de tinción para visualizar los puntos de amina en una placa caliente. </li><li> por Kaiprueba de Ser, coloque un poco de la muestra en un tubo de vidrio que contiene el reactivo de Kaiser. Calentar a 100 ° C durante 5 min y buscar el cambio de color (si el color de la solución permanece de color amarillo, a continuación, se completa la reacción). </li></ol></li><li> Re-disolver el producto en DMF anhidro (10 a 20 ml) y repetir la precipitación y centrifugación (véase el paso 1.4). </li><li> Repita el paso 1.5, y lavar el precipitado de polímero tres veces con éter enfriado con hielo. </li><li> Transferir el precipitado de polímero 1 a un matraz de reacción limpio y conectar el matraz a una fuente de vacío de alta para eliminar el éter residual. </li><li> Preparar y añadir aproximadamente 20-30 ml de 20% (v / v) de 4-metil-piperidina en DMF al polímero intermedio 1. Agitar hasta la disolución completa. Ejecutar la reacción durante 3 hr. </li><li> Realizar TLC 16 y el ensayo de Kaiser (un color azul confirma la presencia de NH libre 2) 17 (véase el paso 1.4) para confirmar la completion de la reacción. Si la reacción se ha completado, proceder a la precipitación de éter, como se ha mencionado para el producto 1 (pasos 1.4-1.6). </li><li> Se seca el producto polimérico 2 (MeO-PEG 5K Lys (NH 2) 2) bajo un vacío. </li><li> Llevar a cabo una ronda más de (Fmoc) 2-Lys-OH acoplamiento en el intermedio 2 (pasos 1,1-1,7) para generar el producto 3 (MeO-PEG 5K Lys (Lys (NH-Fmoc) 2) 2). De-proteger (pasos 1.8 a 1.10) los grupos Fmoc (4, MeO-PEG 5K Lys (Lys (NH 2) 2) 2) y par (pasos 1.1 a 1.7) la (Fmoc) Lys (Boc) -OH a generar una polilisina dendrítica tercera generación (5, MeO-PEG 5K Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (Boc)) 4) terminado con cuatro grupos Boc y Fmoc en un extremo de la cadena de PEG. </li><li> Transferir el polímero resultante intermedio 5 a un matraz de reacción. en comoSeparadas matraz de reacción, preparar 1: 1 (v / v) de ácido trifluoroacético (TFA) en diclorometano (DCM). Añadir 15-20 ml de una mezcla 1: 1 de TFA / DCM (v / v) para el polímero intermedio 5. Se agita la mezcla hasta que el polímero se disuelva por completo. Se agita durante una 3 h adicionales. </li><li> Realizar TLC 16 y la prueba de Kaiser (un color azul confirma la presencia de NH libre 2) 17 (véase el paso 1.4) para confirmar la finalización de la reacción. Si la reacción es completa, se evapora la mezcla de polímero-in-TFA / DCM con aire hasta que se obtiene una solución viscosa. Proceder a la precipitación de éter, como se ha mencionado para el producto 1 (pasos 1.4-1.6). Se seca el producto polimérico 6 (MeO-PEG 5K Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (NH 2)) 4) bajo un vacío. </li><li> Polímero de transferencia intermedia 6 en un matraz de reacción. Utilice aproximadamente 40 ml de DMF anhidra que contiene 8 equiv. de N, N -diisopropylethylamine (DIEA) para disolver el polímero intermedio 6. En un vaso de precipitados de vidrio, se disuelven 12 equiv. de HOBt, 12 equiv. de la CID, y 12 equiv. de (Fmoc) Cys (Trt) -OH en 20 a 25 ml de DMF anhidro. Agitar durante 10-15 minutos, y luego agregar la mezcla de reacción en el matraz de reacción que contenía 6. Ejecutar la reacción durante la noche. </li><li> Confirmar la finalización de la reacción con TLC 16 y el ensayo de Kaiser (véase el paso 1.4; un color amarillo indica la ausencia de NH2 libre) 17. Si la reacción es completa, proceder a la precipitación de éter, como se ha mencionado para el producto 1 (etapa 1.4 a 1.6), para aislar el producto 7 (MeO-PEG 5K Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys - ((Fmoc) Cys (Trt))) 4. </li><li> Realizar Fmoc de-protección en 7, como se indica en el paso 1.8, para obtener el producto 8 (PEG 5K Lys-Lys 2 - (Lys (NH 2) - (Cys (NH 2) (Trt))) 4). Pareja (Fmoc) PEG 2 Suc-OH ( &quot;Ebes&quot; enlazador, 24 equiv.) En un acoplamiento de polímero intermedio utilizando el procedimiento descrito anteriormente para HOBt / DIC-mediada obtener intermedio 9 (MeO-PEG 5K Lys-Lys Lys 2 4 - (Cys (Trt) ) 4 (Ebes (NH-Fmoc)) 8). </li><li> Realizar una ronda más de Fmoc desprotección (pasos 1,6-1,8) para obtener intermedio 10 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys-Lys 2 4 - (Cys (T)) 4 (Ebes (NH 2)) 8). </li><li> Transferir el polímero intermedio 10 en un matraz de reacción y añadir DMF anhidro (aproximadamente 30-40 ml) para disolverlo. En otro matraz de reacción, se disuelven 24 equiv. de CAOSu (preparado de acuerdo con el procedimiento publicado previamente) en DMF anhidro (20 a 30 ml) 18. Añadir 48 equiv. de N, N-diisopropiletilamina y se deja agitar durante 10-15 minutos. Transferir el contenido en el matraz de reacción que contenía 10 y dejar que la ejecución de la reacción overnight. </li><li> Confirmar la finalización de la reacción con TLC 16 y la prueba de Kaiser (ver paso 1,4; un color amarillo indica la ausencia de libre NH 2) 17. Si la reacción es completa, proceder a la precipitación de éter, como se ha mencionado para el producto 1 (pasos 1/4 a 1/6) para aislar el producto 11 (MeO-PEG 5K Lys-Lys Lys 2 4 - (Cys (Trt)) 4 -Ebes 8 -CA 8). Se dializa en agua desionizada y se liofiliza la muestra para producir un polvo blanco. </li><li> Colocar el polímero intermedio 11 en un matraz de reacción. Preparar y añadir 20 ml de TFA / 1,2-etanoditiol (EDT) / trietilsilano (TIS) / H2O (94 / 2,5 / 1 / 2,5, v / v) mezcla en la solución de polímero. Se agita la mezcla hasta disolución completa. Ejecutar la reacción durante 4 hr. Confirmar la finalización de la reacción por TLC 16. </li><li> Bajo la campana de humos, soplar aire en el polímero-TFA / EDT / TIS / H 2O mezcla hasta que la solución se vuelve viscosa. Proceder a la precipitación de éter, como se ha mencionado para el producto 1 (pasos 01/04 a 01/06), para aislar el producto final, 12 (PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8). Disolver en acetonitrilo y se liofiliza para dar un polvo blanco. </li></ol> 2. Preparación de micelas cargadas-PTX <ol><li> Preparar una carga PTX-PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 de micelas utilizando el método de evaporación estándar. <ol><li> Disolver 20 mg de TD con una cantidad diferente de PTX (1-9 mg) en 1 ml de cloroformo (CHCl3). Se elimina el disolvente utilizando un evaporador rotatorio para obtener una película de polímero homogéneo, seco. Reconstituir la película con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por vórtice, seguido por sonicación durante 30 min a 40 kHz, si es necesario, para permitir la formación de micelas cargadas de fármaco. </li><li> Añadir 6 l de 3% (w w /) H 2 O 2 (1 equiv. A FRee los grupos tiol) para oxidar los grupos tiol en la TD. Use la solución de micelas para una caracterización adicional una vez que el nivel de grupos tiol libres se mantiene en valores bajos constantes, como se indica mediante la prueba 19 de Ellman. </li><li> Filtrar la solución con un filtro de 0,22-micras para esterilizar la muestra. Analizar la cantidad de fármaco cargada en las micelas en un 20 sistema de HPLC después de la liberación de los fármacos desde las micelas mediante la adición de 9 veces de acetonitrilo y la realización de 10 min de sonicación. Utilizar una columna C18 de HPLC con acetonitrilo / agua como fase móvil. </li><li> Calcular la carga de fármaco de acuerdo con la curva de calibración entre los valores de área de HPLC y las concentraciones del fármaco estándar 11. NOTA: La eficiencia de carga se define como la relación de fármaco cargado en las micelas en el contenido inicial de la droga. </li></ol></li></ol> 3. Caracterizaciones de micelas <ol><li> Medir el tamaño y distribución por tamaño de la micelles con un instrumento de dispersión de luz dinámica (DLS) 29. Llevar a cabo las mediciones a temperatura ambiente y mantener la concentración micelar en 1 mg / ml. NOTA: Para realizar el análisis de tamaño de partícula, utilice PBS como blanco, y luego grabar el tamaño de partícula de las muestras reales. Tome las lecturas por triplicado para muestras, y luego promediar las lecturas. </li><li> Utilice espectros de fluorescencia para medir la concentración micelar crítica (CMC) de PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 antes y después de la reticulación con pireno como sonda fluorescente hidrófobo, como se describe previamente 13,21. NOTA: Por lo general, la concentración micelar oscila entre 5 x 10 -7 a 5 x 10 -4 M. </li></ol> 4. Estabilidad de las micelas en SDS con o sin agentes de reducción <ol><li> Preparar soluciones madre de dodecil sulfato de sodio solución (SDS) (7,5 mg / ml) y disulfuro de micelas reticuladas (1,5 mg / ml) en PBS. A continuación, ucantar las soluciones madre, hacer una mezcla solución en la que la concentración final de SDS está en 2,5 mg / ml y la concentración micelar está en 1,0 mg / ml. </li><li> Medir el tamaño y distribución por tamaño (como se menciona en el paso 3.1) de las soluciones de micelas en intervalos de tiempo predeterminados, con o sin la presencia de glutatión 10 mM (GSH). </li></ol> 5. Ensayo de hemólisis <ol><li> Evaluar el potencial hemolítico de las micelas cargadas con PTX,-no reticulados (PTX-NCMs) preparado de acuerdo con el procedimiento publicado previamente 11 y micelas reticuladas cargados-PTX (PTX-MCD) utilizando la sangre con citrato fresco de ratones desnudos recogido de la velo cola. <ol><li> Recoger las células rojas de la sangre por centrifugación de la muestra de sangre (1,0 ml) a 1000 xg durante 10 min, a lavar tres veces con PBS, y luego volver a suspender los sedimentos celulares con PBS a una concentración final de 2%. </li></ol></li><li> Mezclar 200 l de suspensión de eritrocitos con diferentes concentraciones (0,2 y 1,0mg / ml) de PTX-NCMs y PTX-MCDs, respectivamente, y se incuba durante 4 horas a 37 ° C en un agitador incubador. </li><li> Centrifugar las mezclas de micelas de eritrocitos a 3000 xg durante 5 min. Transferir 100 l del sobrenadante de todas las muestras a una placa de 96 pocillos. Medir la absorbancia de la hemoglobina libre en el sobrenadante a 540 nm utilizando un lector de micro-placa. NOTA: Los eritrocitos incubados con Triton-100 (2%) y PBS se van a utilizar como los controles positivos y negativos, respectivamente. El porcentaje de hemólisis de los hematíes se calcula con la siguiente fórmula: RBC hemólisis = (muestra OD - OD control negativo) / (control positivo OD - control negativo OD) x 100%. </li></ol>

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 <a target="_blank" href="http://www.vahitech.com/Assets/Nano(US)Web.pdf">http://www.vahitech.com/Assets/Nano(US)Web.pdf</a> (2006).</li>
</ol>

Y. Li y K.S.L. son los inventores de una patente pendiente sobre sistemas de micelas reticulados de forma reversible (solicitud de patente estadounidense 61/485.774). K.S.L. es el científico fundador de LamnoTherapeutics Inc., que planea desarrollar la nanoterapéutica descrita en el manuscrito. Los autores restantes declaran no tener intereses financieros contrapuestos.

Varios nanopartículas han sido investigados para su uso potencial en la administración de fármacos. doxorrubicina liposomal y paclitaxel (PTX) RESORTE humanos albúmina sérica nano-agregados son algunos de los nanotherapeutics aprobados por la FDA para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, aunque clínicamente eficaz, tanto de estos nanotherapeutics son relativamente &quot;grandes&quot; en tamaño, y que tienden a acumularse en el hígado y los pulmones. Las micelas poliméricas con tamaños de partículas de menor tamaño re...

La nanotecnología es un campo de rápido emergente que ha beneficiado a un número de áreas biomédicas 1. Las nanopartículas ofrecen oportunidades para el diseño y puesta a punto propiedades que no son factibles con otros tipos de terapias convencionales. Nano-portadoras mejoran la estabilidad de los medicamentos contra la biodegradación, prolongar el tiempo de circulación de drogas, superar los problemas de solubilidad de drogas, y pueden ser puesto a punto para la administración dirigida de fármacos y agentes de imagen para co-entrega de 1,2. sistemas de entrega basados ​​en nanopartículas son prometedores en formación de imágenes y tratamiento del cáncer. Vasculaturas de tumores son fugas a macromoléculas y pueden conducir a la acumulación preferencial de circulación de las nanopartículas en los sitios del tumor a través de la permeabilidad mejorada y retención (EPR) efecto 3. Entre los varios nano-portadores (por ejemplo, liposomas, hidrogeles, y micelas poliméricas) que se persiguen activamente como vehículos para fármacos contra el cáncer, micelas poliméricas han ganado una amplia popularidad en THe última década 4,5. Las micelas poliméricas son un sistema termodinámico que, en la administración intravenosa, potencialmente puede ser diluido por debajo de la concentración micelar crítica (CMC), que conduce a su disociación en unimers. Se han empleado estrategias de reticulación para minimizar la disociación micelar en unimers. Sin embargo, las micelas excesivamente estabilizadas pueden impedir que el medicamento de liberación en los sitios diana, lo que reduce la eficacia terapéutica global. Varios enfoques químicos se han explorado para hacer que el reticulante degradable en respuesta a redox o a los estímulos externos, tales como enlaces disulfuro reducibles 6,7 y pH escindible 8 o éster hidrolizable bonos 9,10. Hemos informado anteriormente el diseño y síntesis de las nanopartículas micelares consiste en ácido cólico dendríticas (CA) bloques y polietilenglicol (PEG) lineal copolímeros, referido como telodendrimers (TD) 11-15 </sup&gt;. Estas anotaciones se representan como PEG nK -CAy (donde n = peso molecular en kilodaltons (K), y = número de ácido cólico (CA) unidades). Se caracterizan por su pequeño tamaño, larga vida útil, y alta eficiencia de encapsulación de drogas tales como paclitaxel (PTX) y la doxorrubicina (DOX) en el núcleo hidrofóbico. Los bloques de construcción de TD, tales como PEG, lisina, y CA, son biocompatibles, y la presencia de una corona PEG pueden impartir un carácter de nanopartículas &quot;stealth&quot;, la prevención de la absorción no específica de las nanopartículas micelares por los sistemas reticuloendoteliales. polímeros lineales dendríticas tiolada pueden ser fácilmente generados mediante la introducción de cisteínas en la cadena principal oligo-lisina dendríticas de nuestra TDs estándar. Este artículo presenta un protocolo fácil para la producción de un sistema de suministro de fármaco micelar reversiblemente reticulado mediante la introducción de disulfuro enlaces cruzados en el núcleo hidrofóbico de anotaciones (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>MeO-PEG5K-NH2</td><td>Rapp Polymere</td><td>125000-2</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Fmoc)-OH</td><td>Aaptec</td><td>AFK107</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Anaspec</td><td>AS-20132</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Aapptec</td><td>AAC105</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilformamida</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td><td></td></tr><tr><td>Éter etílico</td><td>Fisher Scientific</td><td>E134-20</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diisopropiletilamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td>Corrosivo, maneje con cuidado</td></tr><tr><td>4-metil piperidina</td><td>Alfa-Aesar</td><td>L-02709</td><td></td></tr><tr><td>Enlazador Ebes</td><td>Anaspec</td><td>AS-61924</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cólico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1129</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>02390</td><td>Mango interior de la campana extractora. Guantes blanqueadores después de su uso.</td></tr><tr><td>Triisopropilsilano</td><td>Sigma Aldrich 233781</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo (anhidro)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>Solución de peróxido de hidrógeno 30%</td><td>Aaron Industries</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>HoBt-Cl</td><td>Aaptec</td><td>CXZ096</td><td></td></tr><tr><td>DIC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125407</td><td></td></tr><tr><td>Ratones desnudos atímicos hembra (cepa Nu/Nu), 6&ndash; 8 semanas de edad</td><td>Harlan (Livermore, CA)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un enfoque facile y eficiente para la producción de micelas reticuladas reversible disulfuro

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicina es una forma emergente de la terapia que aprovecha las propiedades únicas de las partículas que son nanómetros de escala para la aplicación biomédica. La mejora de la administración de fármacos para maximizar los resultados terapéuticos y reducir los efectos secundarios asociados con las drogas son algunos de los pilares de la actual nanomedicina. Las nanopartículas en particular, han encontrado una amplia aplicación en el tratamiento del cáncer. Las nanopartículas que ofrecen un alto grado de flexibilidad en el diseño, la aplicación y la producción basada en el microambiente tumoral se prevé que sea más eficaz con la traducción rápida en la práctica clínica. El micelar nano-vehículo polimérico es una opción popular para aplicaciones de administración de fármacos. En este artículo, se describe un protocolo simple y eficaz para la síntesis de micelas reticuladas cargados con el fármaco, disulfuro sobre la base de la auto-ensamblaje de un copolímero anfífilo bien definido lineal-dendrítica (telodendrimer, TD). TD se compone de polietileno glycol (PEG) como el segmento hidrófilo y un grupo ácido cólico tiolado como el resto hidrófobo unido por etapas de formación del núcleo a un PEG terminado en amina utilizando la química de péptidos a base de solución. Los medicamentos de quimioterapia, tales como paclitaxel (PTX), se pueden cargar utilizando un método de evaporación de disolvente estándar. La oxidación mediada por O2 se utilizó previamente para formar disulfuro intra-micelares entrecruzamientos de los grupos tiol libres en los TD. Sin embargo, la reacción era lenta y no es factible para la producción a gran escala. Recientemente, un método de oxidación de H 2 O 2 mediada fue explorada como un enfoque más viable y eficiente, y fue 96 veces más rápido que el método se informó anteriormente. Usando este enfoque, 50 g de nanopartículas reticuladas cargadas con PTX, disulfuro se han producido con éxito con la distribución del tamaño de partícula estrecha y la eficiencia alta carga de fármaco. La estabilidad de la solución de micela resultante se analiza usando condiciones de alteración tales como co-incubación wITH un detergente dodecil sulfato, sodio, con o sin un agente reductor. Los, micelas reticuladas disulfuro cargadas con fármaco mostraron menos actividad hemolítica en comparación con sus contrapartes de no reticulados.

Preparación y caracterización de, micelas reticuladas disulfuro cargadas con fármaco- Anfifílicos polímero de PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 es un polímero dendrítico capaz de formar un sistema micelar reticulado disulfuro para la administración de fármacos cáncer. Estructuralmente, se define como un oligómero dendríticas de ácidos cólicos (dominio hidrófobo) unido a un extremo de la molécula lineal PEG...

Para administrar fármacos contra el cáncer a sitios tumorales con alta especificidad y efectos secundarios reducidos, se requieren nuevos métodos basados en nanopartículas. Aquí, describimos micelas reticuladas de disulfuro que se pueden preparar fácilmente mediante oxidación mediada por peróxido de hidrógeno y son capaces de disociarse de manera eficiente en un entorno tumoral reductor para liberar cargas útiles.

Un enfoque Facile y eficiente para la producción de micelas reticuladas reversible disulfuro

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un protocolo simple y eficaz para sintetizar micelas reticuladas de disulfuro cargadas de fármacos para la administración dirigida de fármacos. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de la nanomedicina. Por ejemplo, cómo producir de manera efectiva nanoformulaciones estables.La principal ventaja de esta técnica es que nos permite sintetizar fácilmente micelas reticuladas de disulfuro a gran escala, lo cual es extremadamente deseable para estudios clínicos en pacientes. Para comenzar este procedimiento, agregue dos gramos de monoamina de polietilenglicol terminado en monometilo a un matraz de fondo redondo. Añade diez mililitros de DMF anhidro para disolverlo.Enfríe con hielo. Agregue tres equivalentes de hidroxibenzotriazol, tres equivalentes de DIC y tres equivalentes de lisina protegida con di-eth-moc a un matraz de fondo redondo. A continuación, agregue diez mililitros de DMF anhidro.Revuelva la mezcla durante 20 minutos en una placa magnética para remover. A continuación, añada la mezcla al matraz de fondo redondo que contenga polietilenglicol monometiloterminado. Retire el matraz de fondo redondo del baño de hielo, luego revuelva durante la noche a temperatura ambiente.Una vez que se complete la agitación, confirme la finalización de la reacción como se detalla en el protocolo de texto. Agregue 200 mililitros de éter helado al matraz de reacción. Centrifugar a 6.000 x g durante seis minutos a cuatro grados centígrados para separar el polímero precipitado.Repita el proceso de precipitación y centrifugación dos veces, redisolviendo el producto en 10 mililitros de DMF cada vez antes de la precipitación. A continuación, lave el polímero tres veces con éter helado. Conecte el tubo a una fuente de alto vacío para eliminar el éter residual.Después de esto, agregue 20 mililitros de 20%4-Metilpiperidina en DMF al polímero. Revuelva hasta que se complete la disolución. Permita la reacción a la diversión durante tres horas.Después de confirmar la finalización de la reacción, seque el producto polimérico. Ahora, el polímero intermedio número dos bajo vacío, luego realice pasos adicionales de síntesis de polímero como se describe en el protocolo de texto. Una vez que se produce el polímero intermedio número 10, transfiéralo a un matraz de reacción.Agregue 30 mililitros de DMF anhidro. En un matraz nuevo, disuelva 24 equivalentes de ácido cólico activado en 20 mililitros de DMF. A continuación, añada 48 equivalentes de N, N-diisopropiletilamina.Revuelva durante 10 minutos. Una vez finalizada la agitación, transfiera la mezcla al matraz de reacción que contiene el polímero intermedio número 10. Deja que la reacción se prolongue durante toda la noche.Al día siguiente confirme la finalización de la reacción y precipite el polímero intermedio número 11, como se describe en el protocolo de texto. A continuación, marque el polímero intermedio en agua desionizada. Liofilizar la muestra produciendo un polvo blanco.Después de preparar la micela, disuelva 20 miligramos de telodendrimer y cinco miligramos de PTX en un mililitro de cloroformo. Elimine el disolvente mediante un evaporador rotativo para obtener una película de polímero seco homogénea. Reconstituya la película con un mililitro de PBS por vórtice.A continuación, sonicar durante 30 minutos a 40 kilohercios. Agregue peróxido de hidrógeno al 3% para oxidar los grupos tiol en el telodendrimmer. Realice pasos adicionales de preparación y verificación como se describe en el protocolo de texto.Una vez completada la preparación de las micelas, mida el tamaño y la distribución del tamaño de las micelas con un instrumento de dispersión de luz dinámica. Realice las mediciones a temperatura ambiente y mantenga la concentración de micelas en un miligramo por mililitro. A continuación, prepare una solución madre de 7,5 miligramos por mililitro de dodecil sulfato de sodio en PBS.A continuación, prepare una solución madre de 1,5 miligramos por mililitro de micelitas reticuladas de disulfuro en PBS. Con el uso de estas soluciones madre se crea una mezcla en la que la concentración final de SDS es de 2,5 miligramos por mililitro. Y la concentración de micelas es de 1,0 miligramos por mililitro.Cargue la muestra y mida el tamaño y la distribución del tamaño de la solución micelar a intervalos de dos minutos. Después de recolectar sangre citrato fresca de ratones desnudos, centrifugar una muestra de sangre de un mililitro a 1.000 x g durante 10 minutos para recolectar glóbulos rojos. Lávelos tres veces con PBS y luego vuelva a suspender el pellet celular con PBS hasta una concentración final de 2%Mezcle 200 microlitros de suspensión de eritrocitos con una solución de 1,0 miligramo por mililitro de PTX NCM.A continuación, mezcle 200 microlitros de suspensión de eritrocitos con una solución de 1,0 miligramo por mililitro de DCM PTX. Incube estas mezclas en un agitador de incubadora durante cuatro horas a 37 grados centígrados. Una vez completada la incubación, centrifugar las mezclas a 3.000 x g durante cinco minutos.Transfiera 100 microlitros del sobrenadante de cada muestra a una placa de 96 pocillos. Después de esto, use un lector de microplacas para medir la absorbancia de la hemoglobina libre a 540 nanómetros. Según lo medido por la prueba de Ellman, la tasa de conversión de grupos tiol libres a enlaces disulfuro alcanzó el 85% después de 48 horas de oxidación mediada por oxígeno.Aquí se emplea un método de oxidación mediado por peróxido de hidrógeno como método alternativo. La tasa de conversión alcanza el 88% en 30 minutos. Lo cual es 96 veces más rápido que el enfoque mediado por oxígeno.Utilizando este enfoque más eficiente, se han producido más de 50 gramos de nanopartículas, con un tamaño de partícula medido de 27 nanómetros, con una distribución de tamaño estrecha. También se investiga la estabilidad de las micelas reticuladas de disúfido cargadas en PTX en condiciones severas de alteración de micelas. El tamaño de partícula de las micelas se mantuvo estable a lo largo del tiempo, lo que indica que se mantuvieron intactas.Después de la introducción de GSH a una concentración intracelular, el tamaño de las micelas reticuladas de disulfuro cargado con fármaco permanece intacto durante 30 minutos, luego disminuye abruptamente a un nanómetro. Esto significa la reducción de un número crítico de enlaces disulfuro, un requisito previo para la rápida disociación de las micelas. Aquí se muestran los resultados representativos de la actividad hemolítica de las micelas cargadas con PTX.Los NCM PTX tienen un recuento de lisis de glóbulos rojos dependiente de la dosis. Sin embargo, los DCM PTX que tienen reticulación de disulfuro no muestran actividades hemolíticas observables. Una vez dominada esta técnica se puede realizar en otro si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar agregar una cantidad igual de peróxido de hidrógeno al 3% para la formación de disulfuro. Después de este procedimiento, se puede realizar el ensayo de hemólisis para evaluar la compatibilidad sanguínea de las micelas reticuladas con disulfuro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar de manera efectiva micelas reticuladas de disulfuro cargadas con fármacos.No olvide que algunos de estos productos químicos pueden ser extremadamente peligrosos y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal, al realizar este procedimiento.

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Aprenda a sintetizar micelas reticuladas con disulfuro cargadas con fármacos para liberación dirigida en terapia oncológica. Este protocolo utiliza oxidación mediada por peróxido de hidrógeno para obtener nanoformulaciones estables y escalables.

Un enfoque Facile y eficiente para la producción de micelas reticuladas reversible disulfuro

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