La detección de la actividad endocrina en Uso de Agua comercialmente disponibles In Vitro Transactivación bioensayos

El objetivo general de este procedimiento estandarizado es analizar muestras de agua en busca de sustancias químicas activas endocrinas, utilizando ensayos celulares basados en receptores disponibles en el mercado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del monitoreo de la calidad del agua, tales como, ¿están realmente presentes en la muestra sustancias químicas endocrinas? La principal ventaja de esta técnica es que puede analizar un grupo de compuestos activos endocrinos mucho más rápido que los métodos químicos actuales.

Esta técnica puede ayudar a diagnosticar los problemas de calidad del agua que surgen de la presencia de sustancias químicas disruptoras endocrinas. Este método proporciona información sobre los contaminantes en el agua, pero también se puede aplicar a otras matrices ambientales, como sedimentos y tejidos. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica pueden tener dificultades, ya que requiere una alta precisión cuando se utilizan técnicas de pipeteo.

Para comenzar este procedimiento, prepare la muestra de agua en soluciones madre de medio específico para el ensayo y producto químico de referencia, como se detalla en el protocolo de texto. Almacene el medio específico del ensayo a cuatro grados centígrados para su almacenamiento a largo plazo. A continuación, añada 15 microlitros del stock químico de referencia adecuado a 285 microlitros de medio de ensayo en un tubo estéril.

Mezcle la muestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, añada 200 microlitros de DMSO al 5% en el medio de ensayo a ocho tubos adicionales. Transfiera una alícuota de 100 microlitros del tubo uno al tubo dos, para comenzar una serie de diluciones triples.

Mezcle bien la muestra diluida en el tubo dos con una pipeta. Luego, transfiera una alícuota de 100 microlitros del tubo dos al tubo tres. Continúe este proceso para cada tubo.

A continuación, prepare una muestra de control de disolvente mezclando 10 microlitros de DMSO en 190 microlitros de medio de ensayo. A continuación, recoja y etiquete cuatro tubos nuevos. Agregue 95 microlitros de medio de ensayo al primer tubo.

A continuación, añade cinco microlitros de extracto de agua y mezcla bien. Agregue 50 microlitros de DMSO al 5% en el medio de ensayo a los otros tres tubos. A continuación, realice una dilución doble transfiriendo 50 microlitros de solución de un tubo al siguiente.

Comience sacando un frasco de células detenidas por división ER o GR del congelador criogénico. Descongele las células rápidamente colocando el vial en un baño de agua a 37 grados centígrados, con una agitación suave durante dos minutos. A continuación, descontamine el vial con etanol al 70%.

Colóquelo en un gabinete de seguridad biológica de clase dos. Abra el vial mediante técnicas asépticas y transfiera las células a 10 mililitros de medio de ensayo. Centrifugar a 200 veces g durante cinco minutos.

Una vez finalizada la centrifugación, utilice una pipeta de vidrio estéril para aspirar el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender el pellet de la célula en seis mililitros de medio de ensayo. Mezcle cinco microlitros de suspensión celular con cinco microlitros de solución vital para manchas.

Luego, agregue una alícuota en una cámara de conteo. Cuente el número de células vivas con un microscopio óptico o un contador de células automatizado. A continuación, estime la densidad de células vivas en la suspensión celular.

Diluir si es necesario, para obtener una densidad final de 550.000 células vivas por mililitro de medio de ensayo. Comience por crear un diseño de placa que incluya una curva de calibración específica del ensayo de nueve puntos, muestras de QA/QC y múltiples diluciones para cada extracto de agua. Agregue 90 microlitros de medio de ensayo a los pocillos de control libre de células replicadas.

Vierta la suspensión celular en un depósito de pipeteo estéril. A continuación, con una pipeta multicanal, añada 90 microlitros de suspensión celular a los demás pocillos. Agregue 10 microlitros de las muestras diluidas a los pocillos apropiados.

Cubra el plato con una tapa. Luego, coloque la placa en una incubadora de 5%C02 a 37 grados centígrados durante 16 horas. Una vez completada la incubación, deje que la placa se equilibre a temperatura ambiente.

Luego, los siguientes pasos deben realizarse en ausencia de luz directa. Prepare una solución de carga de seis veces de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego, agregue 20 microlitros de la solución de carga a cada pocillo.

Añadir 10 microlitros de reactivo de viabilidad celular a cada pocillo, para evaluar la citotoxicidad del extracto de agua diluido. Selle la placa con una película adhesiva de aluminio. Luego, incube la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante dos horas.

Una vez completada la incubación, agregue la placa al lector de microplacas con capacidades de lectura inferior. Mida la fluorescencia y analice los datos como se detalla en el protocolo de texto. En este estudio, se analizaron cuatro muestras compuestas de 24 horas de efluentes de aguas residuales municipales tratadas, seis muestras de agua superficial de sistemas de agua dulce en el sur de California y un campo en blanco que consistía en agua ultrapura.

Se detectó actividad de RE en siete de las 10 muestras de agua representativas, mientras que la actividad de GR se detectó en cuatro. Las pautas de rendimiento de QA/QC para los ensayos de receptores de estrógeno y receptores de glucocorticoides se pueden ver aquí. Los resultados del estudio en cuanto a citotoxicidad y precisión de la muestra se ajustaron a los criterios de aceptación, validando las mediciones de la muestra de agua.

Las concentraciones equivalentes de bioensayo más altas se encontraron en los efluentes secundarios, mientras que la actividad GR del efluente terciario se encontró por debajo del límite de detección del bioensayo. Del mismo modo, la mayoría de las muestras de agua superficial no mostraron actividad de GR por encima del límite de detección y tuvieron niveles mucho más bajos de actividad de ER que los efluentes secundarios. La mayoría de las muestras de efluentes de las plantas de tratamiento de aguas residuales mostraron una respuesta a la dosis por encima del límite de detección para los bioensayos de ER y GR.

Los resultados representativos de la relación media de fluorescencia azul/verde de estas muestras, trazados contra el factor de enriquecimiento relativo, se pueden ver aquí. Esta técnica se puede realizar en 24 horas, si se realiza correctamente. Al intentarlo, es importante seguir todas las pautas de QA/QC.

Esta técnica allanó el camino para que los gerentes exploraran enfoques alternativos para monitorear los productos químicos disruptores endocrinos en el agua. No olvide que trabajar con azida de sodio puede ser peligroso. Se deben tomar precauciones, como trabajar en una campana extractora que funcione correctamente.