Name: Un simple ensayo de fluorescencia para la cuantificación de los neutrófilos extracelular canina Trampa de lanzamiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Aprenda a aislar neutrófilos caninos y cuantificar su formación de trampas extracelulares mediante un ensayo de fluorescencia simple. Este método permite el cribado rápido de agonistas e inhibidores en medicina veterinaria.

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Los autores agradecen a los Dres. James Roth, William Nauseef y Kayoko Kimura y al Sr. Tom Skadow por su ayuda en el desarrollo de los protocolos de neutrófilos caninos. RDG cuenta con el apoyo de una beca de Wellcome Trust ref: WT093767MA.

Todos los experimentos se llevaron a cabo con el permiso del Comité de ética de la Universidad Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Estado de Iowa. 1. Recolección de Sangre <ol><li> Dibuje 9 ml de sangre de un safena, la vena cefálica o yugular directamente en anticoagulante (por ejemplo, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 1,8 mg K 2 EDTA / ml de sangre) vacutainers, o en una jeringa con transferencia inmediata a tubos de sangre que contenían EDTA. rodar suavemente o invertir los tubos de sangre para asegurar una mezcla adecuada de la sangre y anti-coagulante. </li></ol> 2. Aislamiento de neutrófilos <ol><li> En un tubo cónico de 50 ml, mezclar la sangre con un volumen igual de la temperatura ambiente estéril 3% de dextrano-500 (hecho en 0,9% de solución salina estéril) por inversión suave. Dejar reposar en posición vertical durante 18-20 minutos a temperatura ambiente. La transferencia de la capa superior de color paja a un tubo fresco hasta que ya no puede ser recogido sin contaminación por la capa roja inferior. Los eritrocitos en THtubo original, e puede ser desechada. </li><li> Centrifugar el sobrenadante a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar y descartar el sobrenadante. Manualmente volver a suspender el sedimento celular en 10 ml de solución salina tamponada temperatura ambiente estéril de fosfato (PBS). Tenga en cuenta que vórtex no se debe utilizar para volver a suspender los neutrófilos en cualquier etapa de este protocolo. dibujo manualmente, en lugar de verter fuera sobrenadantes también se recomienda durante todo el protocolo para maximizar el rendimiento celular. </li><li> Añadir 10 ml de una solución de separación de células polisucrosa temperatura ambiente y diatrizoato de sodio (por ejemplo, Histopaque 1077) a un tubo cónico de 50 ml. capa cuidadosamente la solución que contiene células sobre la solución de separación de células. Tenga en cuenta que la solución de separación celular mediante el cual no se haya equilibrado a temperatura ambiente pueden reducir el rendimiento de la célula. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 30 min a temperatura ambiente con el freno. </li><li> A medida que los neutrófilos se encuentran en la capa más baja de la pendiente, extraer y desechar la upper 3 capas, compuestas de una capa superior de plasma y plaquetas, una banda blanca estrecha de células mononucleares y una capa clara del medio de gradiente de densidad. </li><li> Para lisar los eritrocitos ningún restantes, vuelva a suspender el sedimento de neutrófilos en 10 ml de agua a temperatura ambiente. </li><li> Después de 30 segundos, restaurar la tonicidad mediante la adición de 10 ml de cloruro de sodio 1,8% estéril temperatura ambiente y mezclar suavemente por inversión. </li><li> Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Trasvasar el sobrenadante y desechar. </li><li> Si la pastilla es todavía roja, repetir la etapa de lisis. Si la pastilla es de color blanco (o si la lisis ya se ha realizado dos veces), suavemente las células volver a suspender en 10 ml de PBS estéril. </li><li> Recuento de células utilizando un contador automatizado o un hemocitómetro. Los rendimientos típicos son al menos 10 6 células por ml de sangre. </li><li> Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Trasvasar el sobrenadante y desechar. </li><li> células a la concentración deseada en la temperatura ambiente PBS estéril resuspender. for el ensayo de liberación de ADN descrita en la sección 2, se vuelve a suspender en 5 x 10 6 células por ml. </li><li> Si se desea, la transferencia de un pequeño volumen de células directamente o usando una citocentrífuga a un portaobjetos de vidrio. Permiten que las células se sequen y las manchas utilizando un kit de fijación y la tinción rápida de acuerdo con la fabrica &#39;instrucciones. Si el aislamiento de neutrófilos ha sido exitosa, cuando se examinan bajo el microscopio al menos 95% de las células nucleadas debe ser granulocitos (neutrófilos, basófilos, eosinófilos) con mínima contaminación de eritrocitos. </li></ol> 3. Ensayo de liberación de ADN <ol><li> Configurar el ensayo de liberación de ADN inmediatamente después del aislamiento de neutrófilos. </li><li> Si la aglutinación de células está presente en el examen de la solución madre por microscopía de luz, pasar la suspensión celular a través de un filtro estéril de 70 micras estéril inmediatamente antes de establecer el ensayo. </li><li> A cada pocillo de ensayo de una placa estéril 96, añadir 5 x 10 4 células / pocillo; agonista y Memo Roswell Parkrial Institute-1640 (RPMI) medio sin rojo fenol y suplementado con suero de ternera fetal inactivado por calor al 0,5% para un volumen final de 100 a 200 l. Incluir al menos dos pocillos de blanco por agonista en la que la solución de neutrófilos de stock se sustituye por un volumen igual de PBS. Tenga en cuenta que la creación de pozos en blanco para cada agonista es importante para descartar la contaminación del ADN del agonista o interferencia por parte del agonista con el ensayo de fluorescencia. </li><li> Incubar a 39 ° C durante 30 min en un incubador de dióxido de carbono (4%). </li><li> Añadir agonistas a concentraciones deseadas y un colorante de ácido nucleico impermeable a las células. Tenga en cuenta la concentración óptima de colorante impermeable a las células variará entre diferentes tintes de ácidos nucleicos. controles no estimuladas con agonistas en el que se sustituyen por un volumen igual de medios de comunicación deben ser incluidos en cada experimento. NOTA: Es deseable diluir agonistas en volúmenes similares de medio de cultivo para mantener condiciones consistentes entre los pozos. así volúmenes finales de 200 y# 181; l se han utilizado con éxito y si esto se altera, así volúmenes debe permanecer idéntica para todas las condiciones. Forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) (concentración final ≥0.1 M) o factor activador de plaquetas (PAF) (concentración final ≥31 M) se puede utilizar como controles positivos. Agonistas deben medirse al menos por duplicado. </li><li> Se incuba a 39 ° C. Medir la fluorescencia usando un lector de microplacas después de 2 horas o a intervalos deseados. Tenga en cuenta que los intervalos de tiempo óptimos variarán con agonistas utilizados. NOTA: Longitud de onda dependerá de colorante empleada. </li><li> Restar la fluorescencia en blanco antes de calcular la fluorescencia media. </li><li> Para permitir la comparación entre los individuos y entre las placas, calcular un factor de cambio en la fluorescencia dividiendo la fluorescencia media de los pocillos estimulados por la fluorescencia media de los pocillos no estimulados. </li></ol>

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<li>Pratesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+from+patients+with+rheumatoid+arthritis+target+citrullinated+histone+4+contained+in+neutrophils+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps.</a> Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).</li>
<li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).</li>
<li>Gray, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+conventional+protein+kinase+C+%28PKC%29+is+critical+in+the+generation+of+human+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inflamm+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps.</a> J Inflamm (Lond). 10 (1), 12(2013).</li>
<li>Jeffery, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dogs+cast+NETs+too%3A+Canine+neutrophil+extracellular+traps+in+health+and+immune-mediated+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia.</a> Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).</li>
<li>McCracken, J. M., Allen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neutrophil+apoptosis+and+lifespan+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease.</a> J Cell Death. 7, 15-23 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El ensayo de liberación de ADN presentada es un ensayo fácilmente cuantificables para el ADN extracelular. El método fue adaptado de técnicas similares que se utilizan para evaluar la formación neta de otras especies, pero la velocidad de centrifugación, las concentraciones de agonistas y los tiempos de incubación han sido alterados para optimizar el método para su uso con los neutrófilos caninos 8,17,18. ajustes similares podrían hacerse para adaptar el método para otras especies. El ensayo es sencillo y de ...

Hay más de 70 millones de perros en los EE.UU. solamente 1. Como miembros de la familia valorados, estos animales a menudo reciben la atención médica de corte borde. Del mismo modo, ya que comparten nuestro medio ambiente, los perros pueden ayudar a comprender la patogénesis y el tratamiento de las enfermedades humanas 1. Sin embargo, si la traducción de los descubrimientos en la medicina humana en tratamientos veterinarios o viceversa, es importante para caracterizar completamente las variaciones de especies incluso en sistemas altamente conservadas tales como la respuesta inmune innata. Ejemplos de diferencias entre el canino y el sistema inmune innato humano incluyen una alta expresión de CD4 en perros neutrófilos 2; la ausencia de un homólogo funcional del sensor flagelina citoplásmica IPAF en perros 3 y la expresión de un híbrido de la caspasa 1/4 en los carnívoros 4. Trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) son un componente relativamente reciente descubrimiento de la inmunidad innata 5. Las redes son la reds de ADN, las proteínas nucleares y granulares libera en respuesta a una amplia gama de estímulos inflamatorios o infecciosos 6. Estructuras en forma de red se han demostrado en muchas especies incluyendo pollos 7, peces, moluscos 8 9 y 10 acoelomates, pero hay variaciones de especies. Por ejemplo, los neutrófilos murinos responden más lentamente a los estímulos NETosis que los neutrófilos humanos, y forman TNE menos difusas 11. Hay una gran cantidad de evidencia de múltiples especies que las redes atrapan los microbios, y más polémica puede estar directamente involucrados en la eliminación de patógenos 12,13. Sin embargo, los componentes de red también aumentan el daño tisular, promueven la trombosis y actúan como autoantígenos 14,15. El equilibrio entre los efectos beneficiosos y perjudiciales de redes pueden variar entre diferentes enfermedades y las diferentes especies, lo que sugiere que es importante investigar TNE tanto en la especie y condición de interés. Aquí nosotrosdescribir un protocolo sencillo para inducir y medir la liberación de los TNE por los neutrófilos caninos. Este método es similar a los utilizados para aislar los neutrófilos 16 e inducir NETosis en otras especies, pero las condiciones tales como la concentración de agonista y tiempo de incubación han sido optimizados para los neutrófilos caninos. Un ensayo de liberación de ADN cuantificación NET similares también se ha descrito en otras especies, pero el método que aquí se presenta también está optimizado para perros 8,17,18.

<table><tbody><tr><td>Tubo de plástico de sangre entera con recubrimiento en aerosol K2EDTA</td><td>BD</td><td>367835</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Dextran-500</td><td>Corporación química y científica precisa.</td><td></td><td></td>AN228410</tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>20012043</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal para terneros bovinos, inactivado por calor</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>10100139</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Media 1640, sin rojo fenol ni L-glutamina</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>32404-014</td><td>Debe estar libre de rojo fenol</td></tr><tr><td>Placa de poliestireno estéril de fondo plano 96 pozos</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>353072</tr><tr><td>Forbol 12-miristato 13-acetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Factor activador de plaquetas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4904</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Tinción de ácido nucleico verde</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 Lector multimodo</td><td>BioTek</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

un simple ensayo de fluorescencia para la cuantificación de los neutrófilos extracelular canina trampa de lanzamiento

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Las trampas extracelulares de neutrófilos son redes de ADN, histonas y proteínas de neutrófilos liberadas en respuesta a estímulos infecciosos e inflamatorios. Aunque son un componente de la respuesta inmunitaria innata, los TNE están implicados en una serie de procesos patológicos, como la autoinmunidad y la trombosis. Este protocolo describe un método sencillo para el aislamiento de neutrófilos caninos y la cuantificación de NETs mediante un ensayo de fluorescencia en microplaca. La sangre se extrae mediante técnicas convencionales de venopunción. Los neutrófilos se aíslan mediante sedimentación de dextrano y un gradiente de densidad utilizando condiciones optimizadas para la sangre de perro. Después de dejar tiempo para la unión a los pocillos de una placa de 96 pocillos, los neutrófilos se tratan con agonistas inductores de NET como el forbol-12-miristato-13-acetato o el factor activador de plaquetas. La liberación de ADN se mide por la fluorescencia de un tinte de ácido nucleico impermeable a las células. Este ensayo es un método sencillo y barato para cuantificar la liberación de NET, pero la formación de NET, más que otras causas de muerte celular, debe confirmarse con métodos alternativos.

Usando este protocolo, debería haber un cambio veces fuerte en la fluorescencia después de la estimulación de los neutrófilos con los controles positivos, PMA y PAF. Como se ilustra en la Figura 1B, la estimulación de los neutrófilos caninos con 31 mM de PAF para 1 hr resultados en un aumento de 4,0 veces en la fluorescencia media en comparación con las células no estimuladas (rango 2,0 a 5,8, n = 5 perros) 18. PMA a 0.1 M (Figura 1A) es un ag...

trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) son redes de ADN, histonas y proteínas de neutrófilos. Aunque un componente de la respuesta inmune innata, redes están implicados en la autoinmunidad y la trombosis. Este protocolo describe un método simple para el aislamiento de neutrófilos canino y cuantificación de los TNE utilizando un ensayo de fluorescencia de microplacas.

Un simple ensayo de fluorescencia para la cuantificación de los neutrófilos extracelular canina Trampa de lanzamiento

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

El objetivo general de este experimento es aislar neutrófilos en estado de quiescencia y medir su liberación de ADN en respuesta a agonistas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en inmunología y medicina veterinaria, como, ¿cuál es la respuesta de los neutrófilos a diversos agonistas de la inducción de trampas extracelulares de neutrófilos o de la muerte celular? La principal ventaja de esta técnica es que permite la evaluación rápida de diversos agonistas e inhibidores de la formación de trampas extracelulares de neutrófilos.Comience insertando una aguja tipo mariposa de 21 gauge en la vena cefálica de un donante canino sano, luego conecte una jeringa de tres mililitros y obtenga tres muestras de sangre de tres mililitros, transfiriendo inmediatamente las muestras a tubos de sangre sin tapón que contengan EDTA. Tenga cuidado de que la punción venosa sea atraumática y de que el flujo sanguíneo sea adecuado, ya que una extracción deficiente dará como resultado un bajo rendimiento de neutrófilos. Después de llenar cada tubo, inviértalos para asegurar una mezcla adecuada de la sangre y el anticoagulante.Reúna la sangre en un tubo cónico de 50 mililitros. Mezcle las muestras con un volumen igual de Dextran 500 estéril al 3% a temperatura ambiente mediante inversión suave y deje el tubo en posición vertical durante 18 a 20 minutos a temperatura ambiente. Luego, transfiera la capa superior de color amarillo pálido a un tubo nuevo hasta que ya no se pueda recolectar sin contaminación por la capa roja inferior.Centrifugar la capa superior. Desechar el sobrenadante, resuspendiendo manualmente el sedimento en 10 mililitros de PBS estéril a temperatura ambiente. A continuación, añadir 10 mililitros de una solución de separación celular de polisacárido en diatrizoato de sodio a temperatura ambiente a un tubo cónico de 50 mililitros.Coloque cuidadosamente las células sobre la solución de separación. Separe las células mediante centrifugación. Deseche las tres capas superiores de plasma, plaquetas, células mononucleares y gradiente de densidad.Lise cualquier eritrocito restante con 10 mililitros de agua a temperatura ambiente. Después de 30 segundos, agregue 10 mililitros de cloruro de sodio estéril al 1,8 % a temperatura ambiente para restablecer la tonicidad. Mezcle las células mediante inversión suave.Ahora, recupere las células mediante centrifugación. Reuspenda suavemente el sedimento blanco en 10 mililitros de PBS estéril. Después de contarlas, centrifugue las células nuevamente y resuspenda el sedimento a una concentración de cinco por 10 a la sexta células por mililitro en PBS estéril a temperatura ambiente.Si procede, seque al aire un pequeño volumen de células sobre un portaobjetos de vidrio, seguido de tinción con un kit de fijación y tinción rápida según las instrucciones del fabricante. Si el aislamiento de neutrófilos ha sido exitoso, al menos el 95 % de las células nucleadas deberían ser granulocitos con contaminación mínima de eritrocitos, tal como se observa mediante microscopía de luz. Inmediatamente después del aislamiento de neutrófilos, pase la suspensión celular a través de un filtro estéril de 70 micrones y añada cinco veces 10 a la cuarta células a los pocillos de prueba de una placa de 96 pocillos que contenga medio de cultivo, para una incubación de 30 minutos a 39 grados celsius y 4 % de dióxido de carbono.Una vez que las células se hayan adherido, agregue hasta un volumen final de 100-200 microlitros del agonista de interés en RPMI sin rojo fenol y suplementado con SFC inactivado por calor a los pocillos de prueba, así como a dos pocillos en blanco que contengan solo PBS. Luego, agregue un colorante adecuado de ácidos nucleicos impermeable a las células y regrese la placa al incubador. Después del período de incubación adecuado, mida la fluorescencia en un lector de microplacas.Una estimulación de una hora de neutrófilos caninos con factor activador de plaquetas provoca un aumento medio de cuatro veces en la fluorescencia en comparación con las células de control no estimuladas. Sin embargo, la PMA es un agonista más lento que no muestra un incremento en la fluorescencia de los neutrófilos antes de dos horas de activación, aunque con el tiempo produce un aumento similar en términos de magnitud. La fluorescencia del colorante de ácidos nucleicos no es específica de la formación de trampas extracelulares de neutrófilos, ya que también puede ocurrir si hay muerte celular por otros mecanismos o si los reactivos están contaminados con ADN.Por ejemplo, en este experimento representativo, una preparación comercial de LPS produjo una fluorescencia muy alta en ausencia de neutrófilos, presumiblemente debido a contaminación con ADN bacteriano. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en aproximadamente seis horas si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular los neutrófilos con cuidado.No vortexe las células y aspire los sobrenadantes en lugar de verterlos. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la microscopía de inmunofluorescencia, para confirmar que el ADN liberado se correlaciona con la NETosis. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la hematología exploraran la interacción del ADN liberado con la coagulación y el efecto de nuevos agonistas de NET, incluido el plasma de pacientes.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar neutrófilos caninos y medir su respuesta a agonistas.

a-simple-fluorescence-assay-for-quantification-canine-neutrophil

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video demuestra la inducción y visualización de trampas extracelulares de neutrófilos o NETs en neutrófilos premarcados utilizando suero del paciente que contiene anticuerpos anti-citoplasma de neutrófilos. Además, el uso de un tinte de ADN impermeable y la microscopía de fluorescencia permite la visualización de los NET.

Inducción y visualización de trampas extracelulares de neutrófilos en neutrófilos premarcados

Se describen métodos para aislar caninas neutrófilos de la sangre entera y visualizar la formación neta en vivo neutrófilos mediante microscopía de fluorescencia. También se describe son protocolos para cuantificar la formación neta y citrulinado histona H3 (citH3) expresión usando microscopia de la inmunofluorescencia.

In Vitro Formación de la trampa extracelular neutrófilo canino: Análisis dinámico y cuantitativo por microscopía de fluorescencia

Aquí, presentamos un protocolo para generar trampas extracelulares de neutrófilos (NET) y operar NETQUANT, una opción de software totalmente automática para la cuantificación de NETs en imágenes de inmunofluorescencia.

Cuantificación automatizada basada en imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos mediante NETQUANT

Este protocolo describe un ensayo de neutrófilos trampa extracelular (red) altamente sensible y de alto rendimiento para la cuantificación semiautomática de ex vivo red formación por microscopia confocal tridimensional de la inmunofluorescencia. Este protocolo puede utilizarse para evaluar la red formación y degradación después de diferentes estímulos y se puede utilizar para estudiar terapias potenciales orientada en la red.

Un análisis de alto rendimiento para evaluar y cuantificar la formación de neutrófilos trampa extracelular

Presentamos un protocolo para una técnica modificada de ensayo de inmunoadsorción enzimática sándwich para medir cuantitativamente dos componentes de los remanentes de trampas extracelulares de neutrófilos, los complejos de ADN conjugado con mieloperoxidasa y ADN conjugado con elastasa de neutrófilos, derivados de neutrófilos activados.

Cuantificación de complejos mieloperoxidasa-ADN y neutrófilos elastasa-ADN a partir de trampas extracelulares de neutrófilos mediante el uso de un ELISA sándwich modificado

Este protocolo presenta un conjunto de ensayos funcionales de neutrófilos que se utilizarán como método de cribado para cubrir las funciones de diferentes vías de señalización. El protocolo incluye una evaluación inicial y sencilla de la viabilidad celular, la pureza, la producción de especies reactivas de oxígeno, la migración en tiempo real, la fagocitosis y una sugerencia preliminar de trampas extracelulares de neutrófilos.

Un conjunto de técnicas de cribado para una visión general rápida de la función de los neutrófilos

Presentamos un método automatizado de alto rendimiento para cuantificar las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) utilizando el sistema de análisis de células vivas, junto con un enfoque de doble colorante dependiente de la permeabilidad de la membrana.

Técnica de alto rendimiento en tiempo real para cuantificar la formación de trampas extracelulares de neutrófilos en neutrófilos humanos

Este protocolo definido describe un enfoque de microscopía de alto rendimiento en tiempo real para visualizar y cuantificar la liberación de trampas extracelulares (NET) de neutrófilos humanos in vitro. El método reproducible permite la investigación de las características y la cinética de la liberación de NET tras la estimulación con distintos inductores de NETosis y permite la evaluación de la farmacología de los antagonistas de NETosis.

Cuantificación microscópica en tiempo real y de alto rendimiento de la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos humanos y evaluación de la farmacología de los antagonistas

Las trampas de neutrófilos extracelular (TNE) es un importante mecanismo de inmunidad innata para luchar contra las bacterias patógenas, hongos y parásitos. A continuación se describen los métodos para aislar a los granulocitos neutrófilos de la sangre humana y para activarlos para formar NET. Se presentan las técnicas de preparación para visualizar NET en la microscopía óptica y electrónica.

Las trampas de neutrófilos extracelular: Cómo generar y visualizarlas

Se presenta un protocolo para la cuantificación y comparación concurrente de tres componentes celulares y extracelulares dentro de biofilms. La metodología implica el uso de microscopía de escaneo láser confocal, software de análisis y visualización estructural de biopelículas y software de análisis estadístico.

Cuantificación concurrente de componentes celulares y extracelulares de biofilms

Aprenda a aislar neutrófilos caninos y cuantificar su formación de trampas extracelulares mediante un ensayo de fluorescencia simple. Este método permite el cribado rápido de agonistas e inhibidores en medicina veterinaria.

Un simple ensayo de fluorescencia para la cuantificación de los neutrófilos extracelular canina Trampa de lanzamiento

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