Un simple ensayo de fluorescencia para la cuantificación de los neutrófilos extracelular canina Trampa de lanzamiento
21 de noviembre de 2016
trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) son redes de ADN, histonas y proteínas de neutrófilos. Aunque un componente de la respuesta inmune innata, redes están implicados en la autoinmunidad y la trombosis. Este protocolo describe un método simple para el aislamiento de neutrófilos canino y cuantificación de los TNE utilizando un ensayo de fluorescencia de microplacas.
El objetivo general de este experimento es aislar neutrófilos en estado de quiescencia y medir su liberación de ADN en respuesta a agonistas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en inmunología y medicina veterinaria, como, ¿cuál es la respuesta de los neutrófilos a diversos agonistas de la inducción de trampas extracelulares de neutrófilos o de la muerte celular? La principal ventaja de esta técnica es que permite la evaluación rápida de diversos agonistas e inhibidores de la formación de trampas extracelulares de neutrófilos.
Comience insertando una aguja tipo mariposa de 21 gauge en la vena cefálica de un donante canino sano, luego conecte una jeringa de tres mililitros y obtenga tres muestras de sangre de tres mililitros, transfiriendo inmediatamente las muestras a tubos de sangre sin tapón que contengan EDTA. Tenga cuidado de que la punción venosa sea atraumática y de que el flujo sanguíneo sea adecuado, ya que una extracción deficiente dará como resultado un bajo rendimiento de neutrófilos. Después de llenar cada tubo, inviértalos para asegurar una mezcla adecuada de la sangre y el anticoagulante.
Reúna la sangre en un tubo cónico de 50 mililitros. Mezcle las muestras con un volumen igual de Dextran 500 estéril al 3% a temperatura ambiente mediante inversión suave y deje el tubo en posición vertical durante 18 a 20 minutos a temperatura ambiente. Luego, transfiera la capa superior de color amarillo pálido a un tubo nuevo hasta que ya no se pueda recolectar sin contaminación por la capa roja inferior.
Centrifugar la capa superior. Desechar el sobrenadante, resuspendiendo manualmente el sedimento en 10 mililitros de PBS estéril a temperatura ambiente. A continuación, añadir 10 mililitros de una solución de separación celular de polisacárido en diatrizoato de sodio a temperatura ambiente a un tubo cónico de 50 mililitros.
Coloque cuidadosamente las células sobre la solución de separación. Separe las células mediante centrifugación. Deseche las tres capas superiores de plasma, plaquetas, células mononucleares y gradiente de densidad.
Lise cualquier eritrocito restante con 10 mililitros de agua a temperatura ambiente. Después de 30 segundos, agregue 10 mililitros de cloruro de sodio estéril al 1,8 % a temperatura ambiente para restablecer la tonicidad. Mezcle las células mediante inversión suave.
Ahora, recupere las células mediante centrifugación. Reuspenda suavemente el sedimento blanco en 10 mililitros de PBS estéril. Después de contarlas, centrifugue las células nuevamente y resuspenda el sedimento a una concentración de cinco por 10 a la sexta células por mililitro en PBS estéril a temperatura ambiente.
Si procede, seque al aire un pequeño volumen de células sobre un portaobjetos de vidrio, seguido de tinción con un kit de fijación y tinción rápida según las instrucciones del fabricante. Si el aislamiento de neutrófilos ha sido exitoso, al menos el 95 % de las células nucleadas deberían ser granulocitos con contaminación mínima de eritrocitos, tal como se observa mediante microscopía de luz. Inmediatamente después del aislamiento de neutrófilos, pase la suspensión celular a través de un filtro estéril de 70 micrones y añada cinco veces 10 a la cuarta células a los pocillos de prueba de una placa de 96 pocillos que contenga medio de cultivo, para una incubación de 30 minutos a 39 grados celsius y 4 % de dióxido de carbono.
Una vez que las células se hayan adherido, agregue hasta un volumen final de 100-200 microlitros del agonista de interés en RPMI sin rojo fenol y suplementado con SFC inactivado por calor a los pocillos de prueba, así como a dos pocillos en blanco que contengan solo PBS. Luego, agregue un colorante adecuado de ácidos nucleicos impermeable a las células y regrese la placa al incubador. Después del período de incubación adecuado, mida la fluorescencia en un lector de microplacas.
Una estimulación de una hora de neutrófilos caninos con factor activador de plaquetas provoca un aumento medio de cuatro veces en la fluorescencia en comparación con las células de control no estimuladas. Sin embargo, la PMA es un agonista más lento que no muestra un incremento en la fluorescencia de los neutrófilos antes de dos horas de activación, aunque con el tiempo produce un aumento similar en términos de magnitud. La fluorescencia del colorante de ácidos nucleicos no es específica de la formación de trampas extracelulares de neutrófilos, ya que también puede ocurrir si hay muerte celular por otros mecanismos o si los reactivos están contaminados con ADN.
Por ejemplo, en este experimento representativo, una preparación comercial de LPS produjo una fluorescencia muy alta en ausencia de neutrófilos, presumiblemente debido a contaminación con ADN bacteriano. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en aproximadamente seis horas si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular los neutrófilos con cuidado.
No vortexe las células y aspire los sobrenadantes en lugar de verterlos. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la microscopía de inmunofluorescencia, para confirmar que el ADN liberado se correlaciona con la NETosis. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la hematología exploraran la interacción del ADN liberado con la coagulación y el efecto de nuevos agonistas de NET, incluido el plasma de pacientes.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar neutrófilos caninos y medir su respuesta a agonistas.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para aislar neutrófilos en estado de quiescencia a partir de sangre canina y cuantificar la formación de sus trampas extracelulares. Las trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) desempeñan un papel importante en la respuesta inmune innata y están asociadas con diversas patologías.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Medicina Veterinaria
Antecedentes
- Los neutrófilos son actores clave en la respuesta inmunitaria.
- Las NET consisten en ADN, histonas y proteínas liberadas por neutrófilos.
- Se ha implicado a las NET en enfermedades autoinmunitarias y trombosis.
- Comprender la formación de NET puede proporcionar información sobre las respuestas inmunitarias.
Objetivo del estudio
- Aislar neutrófilos y medir la liberación de su ADN en respuesta a diversos agonistas.
- Investigar la respuesta de los neutrófilos a agentes inductores de trampas extracelulares de neutrófilos (NET).
- Facilitar la detección rápida de agonistas e inhibidores que afectan la formación de NET.
Métodos Utilizados
- Se recolectan muestras de sangre de un donante canino sano utilizando una aguja tipo mariposa de calibre 21.
- Las muestras se transfieren a tubos que contienen EDTA para el aislamiento de neutrófilos.
- Se tiene cuidado para garantizar una venopunción indolora y obtener un rendimiento óptimo de neutrófilos.
- La inversión de los tubos asegura una mezcla adecuada de la sangre y el anticoagulante.
Resultados principales
- El método permite el aislamiento eficaz de neutrófilos.
- La cuantificación de las NETs puede lograrse mediante un ensayo de fluorescencia en microplaca.
- El protocolo facilita la investigación de las respuestas de los neutrófilos a diversos estímulos.
- Es posible realizar un cribado rápido de la formación de NETs en respuesta a diferentes agonistas.
Conclusiones
- Este protocolo proporciona un método confiable para estudiar el comportamiento de los neutrófilos.
- Los conocimientos obtenidos pueden contribuir a comprender las respuestas inmunitarias tanto en estado de salud como en enfermedad.
- La técnica es beneficiosa tanto para aplicaciones de investigación como clínicas en medicina veterinaria.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este ensayo de cuantificación de redes extracelulares de neutrófilos basado en fluorescencia permite la detección rápida de agonistas e inhibidores que afectan la formación de trampas extracelulares de neutrófilos en modelos caninos. El método apoya la validación de dianas en investigación inmunológica y de enfermedades inflamatorias al proporcionar lecturas cuantitativas y reproducibles de la liberación de ADN. Facilita la desviación mecanicista en programas preclínicos que investigan vías mediadas por redes extracelulares de neutrófilos en modelos de autoinmunidad, trombosis y enfermedades infecciosas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la respuesta de los neutrófilos a agonistas como PMA y PAF para aclarar la vía diana.
- Valor operativo: Facilita la criba rápida de bibliotecas de compuestos para identificar moduladores de la NETosis.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Utiliza un colorante de ácidos nucleicos impermeable a las células para cuantificar la liberación de ADN extracelular como indicador de la formación de NET.
- Valor operativo: Compatible con lectores de microplacas de 96 pocillos para perfiles de agonistas/inhibidores de alto rendimiento.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Proporciona un sistema relevante para la enfermedad para estudiar la participación de las NET en la trombosis y la autoinmunidad.
- Valor operativo: Permite el análisis de respuesta a la dosis y del curso temporal para apoyar la confianza predictiva en la optimización de compuestos líderes.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos líderes, apoyando la reducción de riesgos del blanco inmunológico antes de la inversión preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Mide la cinética de liberación de ADN para aclarar las vías de activación de neutrófilos y la especificidad de agonistas.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos de fluorescencia que permiten comparar la potencia de agonistas y la eficacia de inhibidores.
- Análisis: Genera datos de cambio relativo (por ejemplo, un aumento de 4 veces con PAF) para clasificar la actividad de compuestos y evaluar su relevancia biológica.
- Investigación Traducional: Relaciona la cuantificación de NET con procesos fisiopatológicos como la coagulación y la inflamación cuando se combina con validación ortogonal.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada y reutilizable para la validación de dianas en inmunología y enfermedades inflamatorias en diversos proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al aislar señales específicas de NET de la citotoxicidad general cuando se confirma mediante microscopía.
- Valor operativo: Utiliza reactivos económicos y accesibles, así como equipos de laboratorio estándar, para una implementación escalable.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir la evaluación temprana de los efectos del compuesto en la patología inducida por NET.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de dianas en áreas de enfermedades inflamatorias y autoinmunes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el aislamiento de células primarias y en técnicas estériles de cultivo de tejidos.
- Depende del acceso a lectores de microplacas con capacidad de detección de fluorescencia.
- Necesita la estandarización de la densidad de siembra celular y de las condiciones de incubación entre experimentos.
- Debe combinarse con métodos ortogonales (por ejemplo, inmunofluorescencia) para distinguir la NETosis de otros mecanismos de muerte celular.
- Limitado por la especificidad del colorante, ya que la fluorescencia puede deberse a ADN extracelular procedente de necrosis o contaminación del reactivo.
