Producción simple y eficiente y purificación de ratón mielina de oligodendrocitos de la glucoproteína de la encefalomielitis autoinmune experimental Estudios

El objetivo general de este protocolo es generar proteínas basadas en el dominio extracelular de la glicoproteína de los oligodendrocitos de mielina o MOG, que puedan utilizarse para inducir encefalomielitis autoinmune experimental o EAE. Este protocolo hace posible que cualquier laboratorio pueda producir proteína MOG con el fin de utilizarla como antígeno para inducir EAE. La principal ventaja de este protocolo es que no depende de un equipo especializado en el manejo de proteínas, sino que puede utilizar el equipo estándar que se encuentra en casi cualquier laboratorio de inmunología.

Bueno, este protocolo fue optimizado para la proteína de etiqueta MOG basada en la versión de ratón, debería funcionar para otros sistemas de expresión de proteína MOG que incorporan un hestato para la purificación. Inocular cinco mililitros de caldo esterilizado con el caldo de glicerol BL 21 MOG tag e incubarlo durante la noche a 37 grados centígrados y 200 RPM. Añadir 500 microlitros de 100 miligramos por mililitro de ampicilina a cada uno de los matraces de 500 mililitros que contengan 500 mililitros de LB estéril. Transfiera un mililitro del cultivo durante la noche a cada uno de los dos frascos de caldo LB.

Incubar a 37 grados Celsius y 200 RPM durante cinco horas o hasta una densidad óptica de 0,6. Una vez alcanzada la densidad celular deseada, se añadan 0,5 mililitros de un molar de IPTG a cada matraz de cultivo. Incubar el matraz, poner a 37 grados centígrados y 200 RPM durante cuatro horas y luego a temperatura ambiente y 75 RPM durante la noche.

Distribuya los cultivos uniformemente entre botellas de 250 mililitros compatibles con la centrifugación de alta velocidad y mantenga las botellas en hielo a partir de este punto. Granular las células bacterianas a 22.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Vuelva a suspender y combine todos los gránulos bacterianos en un total de 30 mililitros de tampón de lisado.

Transfiera este volumen a un tubo inferior de 50 mililitros capaz de centrificar a alta velocidad. Coloque este tubo en un baño de agua a 30 grados centígrados durante 30 minutos. Durante el tiempo de incubación, agite el tubo dos veces para volver a suspender las células.

Después de la incubación, transporte el tubo sobre hielo y sonique la solución a 20 kilohercios y amplitud del 70%, pulsando durante tres segundos y apagándose durante tres segundos durante cinco pulsos, sonique la solución durante seis rondas totales de cinco pulsos, permitiendo que la solución se enfríe en hielo entre rondas. A continuación, centrifugar la solución a 24.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados, luego resuspender el pellet en 30 mililitros de tampón A e incubar la solución a cuatro grados centígrados durante tres horas. Después de la incubación, sonique la solución en hielo como antes, luego agregue 17,2 gramos de guanidina HCl a la solución.

Incubar la muestra en hielo durante una hora para solublelizar la proteína de la etiqueta MOG. Para cargar y equilibrar la resina de níquel, primero lave la resina agregando 40 mililitros de agua a cada tubo que contenga resina. Coloque los tubos horizontalmente sobre un balancín y déjelos agitar durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Una vez terminado, centrifugar los tubos a 4500 veces g durante ocho minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante pipeteando para evitar alterar el pellet. A continuación, añade 40 mililitros de tampón de carga a cada tubo.

Transfiera los tubos a un balancín y déjelos agitar durante 15 minutos a cuatro grados centígrados antes de centrifusionarlos nuevamente como antes. Deseche el sobrenadante y agregue 40 mililitros de tampón B a los tubos. Transfiere los tubos a un balancín y déjalos agitar durante cinco minutos a cuatro grados centígrados antes de volver a centrifusionar los tubos con resina.

Para purificar la proteína de etiqueta MOG, transfiera todo el volumen de proteína solublizada al primer tubo que contiene resina de níquel. Después de mezclar, coloque el tubo horizontalmente sobre un balancín a cuatro grados centígrados durante una hora. Después de centralizar el tubo a 4500 veces g durante ocho minutos a cuatro grados centígrados, transfiera este sobrenadante al segundo tubo de resina de níquel e incube como antes.

Mientras tanto, vuelva a suspender la resina de níquel en el primer tubo en un tampón de evolución de 40 mililitros y coloque el tubo horizontalmente sobre un balancín a cuatro grados centígrados durante cinco minutos antes de centrifusionar como antes. Transfiera el sobrenadante que contiene la proteína de la etiqueta MOG aludida a una botella de 250 mililitros etiquetada con proteína marcada con MOG purificada. Mantenga esta botella a cuatro grados centígrados.

Con cada paso de elución, mezcle el sobrenadante resultante en esta botella. Agregue 40 mililitros de tampón de tiras al níquel presente en el primer tubo y colóquelo horizontalmente sobre un balancín durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Centrifugar el tubo, desechar el sobrenadante y recargar el níquel levantado como antes.

Una vez terminado, avanza con el segundo tubo como se hizo con el primero. Un total de cuatro rondas de absorción de la proteína solubilizada en la resina de níquel cargada y la elución recuperarán la mayor parte de la proteína. Corte aproximadamente 30 centímetros de tubo de diálisis de piel de serpiente.

Asegure un extremo con un hemostático de bloqueo doblando el extremo de la piel de serpiente tres veces y sujetando el extremo doblado con el hemostático. Rellena la piel de serpiente con proteína de etiqueta MOG diluida. A continuación, retira las burbujas de aire de la piel de serpiente forzándolas a salir por el extremo abierto.

Finalmente, selle el otro extremo del tubo con un segundo hemostático de bloqueo. A continuación, llene un cubo grande con un litro de un x tampón de acetato con guanidina de cuatro molares. Coloque hasta dos secciones de tubo de diálisis que contengan la proteína etiqueta MOG en el balde.

Con cinta adhesiva, asegure los hemostáticos al costado del balde para dejar espacio para que una barra agitadora magnética gire sin obstáculos en el fondo. Coloque el balde en una habitación de cuatro grados centígrados sobre una placa de faldón magnético y enciéndalo a una velocidad de rotación lenta. La diálisis tarda un mínimo de tres días para reducir gradualmente la cantidad de guanidina en el tampón.

Revise regularmente para asegurarse de que el tubo comience intacto y que los extremos estén bien cerrados. Después de cuatro a cinco horas, agregue un litro de un tampón de acetato al cubo de diálisis. Repita este proceso cada cuatro o cinco horas durante un total de tres veces para obtener un total de cuatro litros en el balde.

Después de desechar la mitad del tampón en el balde, vuelva a llenar con un litro de un tampón de acetato y configure el tubo y la barra agitadora. Finalmente, reemplace todo el volumen de cuatro litros en el balde con cuatro litros de tampón fresco de acetato y deje remover durante cuatro o cinco horas. Para obtener los mejores resultados, realice este paso el día de la concentración de proteínas.

Para concentrar la proteína de la etiqueta MOG, forre un bolígrafo con papel de aluminio y cubra el papel de aluminio con PEG 3350 y PEG 1000 en una proporción de uno a uno. El PEG 3350 puede ayudar a prevenir la agregación de proteínas durante la concentración y es un crioconservante eficaz. Coloque la proteína de la etiqueta MOG que contiene tubos de piel de serpiente encima del papel de aluminio y cúbrala con PEG 8000.

Deje reposar a temperatura ambiente y verifique el volumen regularmente hasta que el volumen sea igual o inferior al volumen final estimado. Si la pluma se satura demasiado de agua durante el proceso de concentración, prepare una sartén nueva con papel de aluminio y PEG. Muestras de proteína tomadas a lo largo del protocolo de purificación o ejecutadas en un gel de página SDS para confirmar la pureza.

Se muestra un gel representativo que muestra la etiqueta MOG altamente purificada a 31,86 kilodaltons. Para verificar que la proteína de la marca MOG se ha plegado correctamente, se evaluó la unión de la proteína de la marca MOG a nueve células B CD19 positivas, CD4 negativas de ganglios linfáticos de ratones negros C57 de tipo salvaje o ratones IgH MOG que expresan una cadena pesada de inmunoglobulina específica para la proteína MOG mediante citometría de flujo. Este protocolo requiere un mínimo de 10 días de principio a fin.

A lo largo del procedimiento de aislamiento es importante realizar un seguimiento de la proteína y recordar lo que debe conservarse y lo que debe desecharse. No olvide que cuando se usa sulfato de níquel, el hexahidrato utilizado para cargar la resina de níquel es extremadamente peligroso y se deben tomar precauciones para evitar la inhalación o el contacto con la piel o los ojos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir y purificar su propia proteína etiqueta MOG.

Una vez purificada, la proteína marca MOG puede emulsionarse en un adyuvante completo de Freund y utilizarse como inmunización para inducir EAE. La EAE inducida por el tag MOG se puede utilizar para estudiar la implicación de múltiples tipos de células, como las células CD4 o CDAT o las células B, en la autoinmunidad del sistema nervioso central. A diferencia del péptido corto, que está restringido por MHC, el antígeno proteico se puede utilizar en cualquier cepa de ratones.