Name: Producción simple y eficiente y purificación de ratón mielina de oligodendrocitos de la glucoproteína de la encefalomielitis autoinmune experimental Estudios (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Aprende a producir y purificar la proteína MOG de ratón para inducir encefalomielitis autoinmune experimental. Este protocolo accesible utiliza equipamiento estándar de laboratorio inmunológico.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Sociedad de Esclerosis Múltiple de Canadá. RWJ recibió el premio Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Scholarshipship Award.

<ol><li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li>
<li>Baxter, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+application+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).</li>
<li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+%28MOG35-55%29+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Shetty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodominant+T-cell+epitopes+of+MOG+reside+in+its+transmembrane+and+cytoplasmic+domains+in+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Neuroimmunol+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE.</a> Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22(2014).</li>
<li>Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+recognition+of+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+autoantigen+depends+on+immunization+with+protein+rather+than+short+peptide%2C+while+B+cell+invasion+of+the+CNS+in+autoimmunity+does+not%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not.</a> J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).</li>
<li>Barun, B., Bar-Or, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+multiple+sclerosis+with+anti-CD20+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies.</a> Clin Immunol. 142 (1), 31-37 (2012).</li>
<li>Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+and+encephalitogenicity+of+recombinant+human+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein.</a> J Neurochem. 70 (4), 1593-1599 (1998).</li>
<li>Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+and+human+myelin+oligodendrocyte+glycoproteins+induce+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+by+different+mechanisms+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice.</a> J Immunol. 171 (1), 462-468 (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Restriction+Enzyme+Digests%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).</li>
<li>Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+additives+on+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effect of additives on protein aggregation.</a> Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).</li>
<li>Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+Infiltration+of+the+Spinal+Cord+by+Non-Classically+Activated+B+Cells+is+Associated+with+Chronic+Disease+Course+in+a+Spontaneous+B+Cell-Dependent+Model+of+CNS+Autoimmune+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease.</a> Front Immunol. 6, 470(2015).</li>
<li>LaVallie, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thioredoxin+gene+fusion+expression+system+that+circumvents+inclusion+body+formation+in+the+E.+coli+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.</a> Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).</li>
<li>Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+S.Tag+fusion+system+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The S.Tag fusion system for protein purification.</a> Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).</li>
<li>Amor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+epitopes+of+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+for+the+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+in+SJL+and+Biozzi+AB%2FH+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice.</a> J Immunol. 153 (10), 4349-4356 (1994).</li>
<li>Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+profiling+of+tobacco+etch+virus+protease+using+a+novel+fluorescence-assisted+whole-cell+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay.</a> PLoS ONE. 6 (1), e16136(2011).</li>
<li>Litzenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+producing+demyelinating+autoantibodies%3A+development+and+function+in+gene-targeted+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice.</a> J Exp Med. 188 (1), 169-180 (1998).</li>
<li>Zhang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+purification+of+Escherichia+coli-expressed+human+thymosin-alpha1+using+affinity+chromatography+and+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography.</a> Protein Expr Purif. 77 (2), 140-145 (2011).</li>
<li>Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+protein+production+levels+in+Escherichia+coli+with+a+strong+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter.</a> FEBS J. 278 (5), 729-739 (2011).</li>
<li>Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29+T+cells+exacerbates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+induced+by+mouse%2C+but+not+rat%2C+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens.</a> J Neurosci Res. 87 (15), 3511-3519 (2009).</li>
<li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+etch+virus+protease%3A+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).</li>
<li>Blommel, P. G., Fox, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+approach+to+improving+large-scale+production+of+tobacco+etch+virus+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease.</a> Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Aquí, hemos descrito un protocolo para la producción de proteína MOG etiqueta y cómo generar MOG 1-125 pura de la proteína MOG etiqueta. Este protocolo se basa tanto en los métodos estándar His-tag base de purificación de proteínas, así como un protocolo previamente descrito para la generación de una proteína de más edad a base de MOG 15. A pesar de que no se describe aquí, el uso principal de la proteína etiqueta MOG es inducir EAE mediante inmunización con antígen...

MS es una enfermedad humana caracterizada por la inflamación crónica y la neurodegeneración del CNS que se piensa para ser accionado por una respuesta autoinmune dirigida hacia la mielina. La pérdida de mielina y axones a través del tiempo como resultado la disminución gradual de la función cognitiva y motora 1. &quot;Encefalomielitis autoinmune experimental&quot; es un término general para los modelos animales de enfermedad autoinmune dirigida hacia la mielina del SNC. Como MS humanos, EAE se caracteriza típicamente por la infiltración de células inmunes del sistema nervioso central y, en algunos casos, la desmielinización 2. Sin embargo, el grado en que cualquier modelo de EAE dado asemeja MS humana, en parte, depende de la especie o cepa utilizada y de la complejidad de la respuesta autoinmune anti-mielina subyacente. autoinmunidad anti-mielina puede ser inducida experimentalmente en varias formas, pero el método más común usado hoy en día es para inmunizar ratones con un péptido corto de aminoácidos que imitan la CD4 inmunodominante <sarriba&gt; + epítopo de células T de una proteína de la mielina. Esto representa el requisito mínimo de inducir una respuesta patógena. Tal vez el más común de ellos es un péptido de 21 aminoácidos derivado de la glicoproteína de mielina de oligodendrocitos (MOG 35-55), que se utiliza para inducir la EAE en ratones C57BL / 6 3. Sin embargo, para algunos fines experimentales es deseable o incluso necesario para inmunizar con los antígenos proteicos más grandes y de hecho hay varias ventajas a esto más de la inmunización con el péptido corto. En primer lugar, debido a la restricción MHC, los péptidos cortos son por lo general sólo es eficaz en un rango muy limitado de cepas, mientras que los antígenos de proteínas más grandes que representan ya sea toda la proteína o un dominio específico se pueden procesar normalmente para su presentación en múltiples cepas de ratón endogámica o incluso en diferentes especies 4. En segundo lugar, un antígeno de proteína más grande es capaz de inducir una respuesta inmune más compleja la incorporación de más tipos de linfocitos en el reconocimiento de antígenos, en lugar de limiting reconocimiento del antígeno a las células T CD4 +. Por ejemplo, las células B a través de su receptor de células B (BCR) interactúan directamente con todo en lugar de procesado de proteínas. Nosotros y otros han demostrado que las células B activadas por MOG 35-55 inmunización no reconocen la proteína MOG 5. Puesto que las células B se ha demostrado recientemente para jugar un papel patogénico en MS humano 6, los modelos de EAE que incorporan células B en la patología autoinmune son cada vez más importante. A pesar de las ventajas del uso de antígenos de proteínas de mayor tamaño para inducir EAE, quedan pocas fuentes disponibles en el mercado para tales proteínas. En efecto, mientras que los péptidos cortos como MOG 35-55 pueden sintetizarse muy rápidamente y a un coste relativamente bajo, las opciones comerciales para la proteína MOG es limitado y el coste sustancialmente más para comprar. No obstante, hay varios vectores de expresión disponibles para los grupos de investigación para generar MOG dominio extracelular (MOG 1-125) propios. however, todos los sistemas de expresión que hemos identificado en la literatura se basan en las tecnologías más antiguas que ya han sido reemplazados con sistemas de expresión más eficientes 7. Además, la mayoría se basan en rata o humano MOG 8. Para algunas investigaciones de la autoinmunidad en los ratones, un antígeno basado en el autoantígeno MOG ratón es preferible. Por último, todas las proteínas a base de MOG que hemos identificado, ya sea comercial o como vectores de expresión, son proteínas de fusión que contienen aminoácidos adicionales a la base MOG 1-125. Estos incluyen una etiqueta para la purificación y por lo general otras secuencias, así, muchas de las cuales con una función que no pudimos identificar. Para hacer frente a estas limitaciones, hemos generado una nueva proteína de fusión basada en el ratón MOG dominio extracelular fusionado a una etiqueta que contiene tiorredoxina para combatir la insolubilidad de la proteína conocida MOG 5. La secuencia de etiqueta también contiene una secuencia 6xHis para la purificación y un CLE proteasa TEVsitio Avage que permite la eliminación completa de todas las secuencias de etiqueta, si se desea. Este es el único método que somos conscientes de generar pura proteína MOG 1-125. Para facilitar la producción de grandes cantidades de proteína, la secuencia de MOG 1-125 fue optimizado codón para la expresión bacteriana y se insertó la proteína de fusión tag MOG en el sistema de expresión pET-32. A continuación, describimos en detalle el protocolo para producir y purificar la proteína etiqueta de MOG, y MOG 1-125 pura, utilizando equipos no especializados disponibles para la mayoría de los laboratorios de inmunología.

<table><tbody><tr><td>BL21 E. coli- pet32-MOGtag</td><td>Kerfoot lab</td><td></td><td>Estas bacterias son necesarias para producir la proteína MOGtag. Las reservas de glicerol de estas bacterias están disponibles a pedido.</td></tr><tr><td>LB caldo miller</td><td>Bioshop</td><td>LBL407.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>bio básica</td><td>AB0028</td><td>Reconsimetriza el polvo en 50% etanol / 50% H2O a 100 mg/ml. Almacenar a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bioshop</td><td>IPT002.5</td><td>Reconozca el polvo en H2O a 1M y almacene a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Lisozima de gallina-huevo</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.10</td><td>Reconstituir en H2O a 50 mg/ml y almacenar a -80 °C.</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologías de vida</td><td>salina tamponada con fosfato</td><td>20012-027</td><td>No se requiere solución salina tamponada con fosfato comercial, cualquier solución salina tamponada con fosfato estándar hecha en laboratorio es suficiente.</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Bioshop</td><td>SOD004.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Bioshop</td><td>TRS002.1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Bioshop</td><td>IMD508.100</td><td></td></tr><tr><td>Guanidina-HCl</td><td>Sigma</td><td>G3272</td><td>La calidad debe ser superior al 98% de pureza.</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de níquel (II)</td><td>Bioshop</td><td>NIC700.500</td><td></td></tr><tr><td>Su resina aglutinante</td><td>EMD Millipore</td><td>69670-3</td><td>Almacenamiento en 20% etanol 80% H2O a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Etanol anhidro</td><td>Alcoholes comerciales</td><td>P016EAAN</td><td>diluir con agua según sea necesario.</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.1</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio trihidrato</td><td>Bioshop</td><td>SAA305.500</td><td></td></tr><tr><td>albúmina sérica bovina estándar</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0206</td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad Ensayo de proteínas Bio-rad concentrado de reactivo de colorante</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamina ácido tetraacético, sal disódica dihidratada</td><td>Fisher scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Bioshop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>7000 MW Tubo de diálisis de piel de serpiente</td><td>Thermoscientific</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ml</td><td>Este reactivo no debe manipularse fuera de una campana extractora.</td></tr><tr><td>AcTEV proteasa</td><td>lifetechnologies</td><td>12575-015</td><td>La producción de su propia proteasa TEV se puede lograr utilizando (https://www.addgene.org/8827/) y purificada como en la referencia 17</td></tr><tr><td>Polietilenglicol 3350</td><td>Bioshop</td><td>PEG335.1</td><td></td></tr><tr><td>polietilenglicol 8000</td><td>Bioshop</td><td>PEG800.1</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp de fondo plano placa de 96 pocillos</td><td>ebioscience</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher scientific</td><td>FB-120-110</td><td></td></tr><tr><td>Eon espectrómetro de microplacas</td><td>Biotek</td><td>11-120-611</td><td>Este equipo utiliza el software de análisis de datos Gen5.</td></tr><tr><td>software de análisis de datos Gen5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dodecil sulfato de sodio</td><td>Bioshop</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>azul de bromofenol</td><td></td><td>Bioshop BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001</td><td></td></tr><tr><td>Columnas de desalinización de proteínas</td><td>Thermoscientific</td><td>89849</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001</td><td></td></tr><tr><td>prefabricado 12% poliacrilamida gel</td><td>bio-rad</td><td>456-1045</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de tinción rápida</td><td>EMD Millipore 553215</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel dock EZ imager</td><td>bio-rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>White Light Bandeja</td><td>de muestras bio-rad 1708272</td><td>&nbsp;</td><td>Se utiliza junto con el generador de imágenes EZ de base de gel para manchas azules de coomassie</td></tr><tr><td>Escalera de proteínas</td><td>bio-rad</td><td>1610375</td><td></td></tr></tbody></table>

producción simple y eficiente y purificación de ratón mielina de oligodendrocitos de la glucoproteína de la encefalomielitis autoinmune experimental estudios

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

< clase p='jove_content'>La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria crónica del sistema nervioso central (SNC), que se cree que ocurre como resultado de respuestas autoinmunes dirigidas a la mielina. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es el modelo animal más común de enfermedad autoinmune del SNC, y generalmente se induce a través de la inmunización con péptidos cortos que representan epítopos de células T CD4+ inmunodominantes de proteínas mielina. Sin embargo, las células B reconocen directamente las proteínas no procesadas, y la inmunización con péptido corto no activa las células B que reconocen la proteína nativa. Dado que los ensayos clínicos recientes de terapias de agotamiento de células B en la EM han sugerido un papel de las células B en la conducción de la enfermedad en los seres humanos, existe una necesidad urgente de modelos animales que incorporen el reconocimiento de autoantígenos por parte de las células B. Con este fin, hemos generado una nueva proteína de fusión que contiene el dominio extracelular de la versión de ratón de la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG), así como fusiones N-terminales de una etiqueta His con fines de purificación y la proteína tiorredoxina para mejorar la solubilidad (etiqueta MOG). Se incorporó un sitio de escisión de la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) para permitir la eliminación de todas las secuencias de marcas, dejando solo el dominio extracelular MOG1-125 puro. Aquí, describimos un protocolo simple que utiliza solo equipos de laboratorio estándar para producir grandes cantidades deetiqueta MOG pura o MOG1-125. Este protocolo genera constantemente más de 200 mg de proteínade etiqueta MOG. La inmunización conla etiqueta MOG o MOG1-125 genera una respuesta autoinmune que incluye células B patógenas que reconocen el MOG nativo del ratón.

Una vez que la purificación es completa, las muestras recogidas en los pasos 1.4, 2.1, 3.4, y el producto final de la etapa 6.4 se deben ejecutar en un gel de proteína (Figura 3A). MOG etiqueta debe aparecer en primer lugar como una banda de 31,86 kDa en la muestra T / N, pero no t 0, y debe ser la única banda en el producto puro final. Para probar si la proteína tag MOG ha plegado correctamente, la proteína tag MOG ...

Describimos un protocolo simple utilizando solo equipos básicos de laboratorio para generar y purificar grandes cantidades de una proteína de fusión que contiene glicoproteína de oligodendrocitos de mielina de ratón. Esta proteína se puede utilizar para inducir encefalomielitis autoinmune experimental impulsada por células T y B.

Producción simple y eficiente y purificación de ratón mielina de oligodendrocitos de la glucoproteína de la encefalomielitis autoinmune experimental Estudios

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

El objetivo general de este protocolo es generar una proteína basada en el dominio extracelular de la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina o MOG, que puede utilizarse para inducir encefalomielitis autoinmune experimental o EAE. Este protocolo permite que cualquier laboratorio produzca la proteína MOG para usarla como antígeno en la inducción de EAE. La principal ventaja de este protocolo es que no depende de equipos especializados para el manejo de proteínas, sino que se puede utilizar equipo estándar disponible en casi cualquier laboratorio de inmunología.Bueno, este protocolo fue optimizado para la proteína MOG con etiqueta basada en la versión de ratón, por lo que debería funcionar para otros sistemas de expresión de proteína MOG que incluyan una etiqueta His para purificación. Inocular cinco mililitros de caldo esterilizado con el stock glicerinado de BL21 MOG y incubarlo durante la noche a 37 grados Celsius y 200 RPM. Añadir 500 microlitros de ampicilina al 100 miligramos por mililitro a cada uno de los dos frascos de 500 mililitros que contienen 500 mililitros de LB estéril. Transferir un mililitro de la cultura nocturna a cada uno de los dos frascos de caldo LB.Incub

simple-efficient-production-purification-mouse-myelin-oligodendrocyte

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra una técnica de homogeneización eficiente para generar una emulsión adyuvante de antígeno para inducir encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en un modelo murino. La emulsión contiene un autoantígeno, la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG), en la fase acuosa, rodeada por una fase oleosa continua que comprende una bacteria patógena inactivada. La emulsión asegura una liberación sostenida de antígenos para una respuesta inmunitaria prolongada.

Preparación de una emulsión antigénica adyuvante para inducir encefalomielitis autoinmune

El video demuestra la inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón mediante la inyección de una combinación de glicoproteínas de oligodendrocitos de mielina y Mycobacterium tuberculosis inactivada. El modelo permite a los investigadores estudiar los mecanismos de la enfermedad y probar intervenciones terapéuticas.

Inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón

Este video muestra el método para inducir encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) inyectando péptidos derivados de mielina con un adyuvante para activar las células T autorreactivas, que migran al cerebro. La toxina de la tos ferina se administra para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, lo que permite que estas células T y otras células inmunitarias ingresen al cerebro. Estas células inmunitarias causan desmielinización, lo que conduce a una transmisión nerviosa...

Generación de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón

En este video, se establece un modelo de ratón de esclerosis múltiple utilizando encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Al ratón se le inyecta una emulsión que contiene un péptido neuronal y un adyuvante, lo que desencadena una respuesta inmunitaria que activa las células T autorreactivas. A esto le sigue una inyección de toxina pertussis (PTX) para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, lo que permite que las células T autorreactivas se infiltren en el cerebro. Esta...

Fuente: Jain, R. W., et al. Producción y purificación simples y eficientes de glicoproteína de oligodendrocitos de mielina de ratón para estudios experimentales de encefalomielitis autoinmune. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra el aislamiento y la purificación de MOGtag, una glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) recombinante utilizada en estudios experimentales de encefalomielitis autoinmune (EAE). El protocolo implica lisis bacteriana, sonicación, centrifugación y...

Aislamiento y purificación de glicoproteínas de oligodendrocitos de mielina recombinante

El trasplante de células madre / progenitoras neuronales (CPN) tiene grandes promesas en neurología regenerativa. La administración sistémica de NPC se ha convertido en el protocolo eficaz, de bajo invasiva, y terapéuticamente muy eficaz para entregar las células madre en el cerebro y la médula espinal de roedores y primates no humanos afectados por daño experimental inflamatoria crónica del sistema nervioso central.

Inyección sistémica de Neuronales células madre / progenitoras en ratones con EAE crónica

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal establecido de la esclerosis múltiple. C57BL / 6 ratones se inmunizan con mielina de oligodendrocitos glicoproteína (MOG) péptido 35-55 (MOG 35-55), dando como resultado una parálisis flácida ascendente causada por las células inmunes autorreactivas en el sistema nervioso central. Se discutirán Protocolos para la inducción de la enfermedad y el seguimiento.

La mielina glicoproteína del oligodendrocito (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Inducida por la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratones C57BL / 6 ratones

Describimos el aislamiento Inmunomagnética de los oligodendrocitos primario de ratón, que permite el aislamiento rápido y específico de las células para el cultivo en vitro .

Aislamiento Inmunomagnética rápida y específica de los oligodendrocitos primarios de ratón

Para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental, un modelo animal de esclerosis múltiple, los ratones son inmunizados con una emulsión de agua en aceite que contiene un autoantígeno y un adyuvante completo de Freund. Si bien existen varios protocolos para la preparación de estas emulsiones, aquí se presenta un protocolo de homogeneización rápido, simple y estandarizado para la preparación de emulsiones.

Un método de homogeneización rápido, simple y estandarizado para preparar emulsiones de antígeno/adyuvante para inducir encefalomielitis autoinmune experimental

Hasta la fecha, los protocolos para el aislamiento simultáneo de todos los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central del mismo ratón son una demanda insatisfecha. El protocolo muestra un procedimiento aplicable en ratones con encefalomielitis autoinmune naïve y experimental para investigar redes celulares complejas durante la neuroinflamación y, al mismo tiempo, reducir el número de ratones requerido.

Aislamiento simultáneo de los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central de ratones adultos con encefalomielitis autoinmune

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal de esclerosis múltiple (EM), que comparte con la enfermedad humana una respuesta autoinmune humoral robusta. En este trabajo presentamos un protocolo ELISA sencillo y flexible para cuantificar autoanticuerpos en el suero de ratones inmunizados con EAE.

Cuantificación de anticuerpos autorreactivos en ratones tras encefalomielitis autoinmune experimental

Aprende a producir y purificar la proteína MOG de ratón para inducir encefalomielitis autoinmune experimental. Este protocolo accesible utiliza equipamiento estándar de laboratorio inmunológico.

Producción simple y eficiente y purificación de ratón mielina de oligodendrocitos de la glucoproteína de la encefalomielitis autoinmune experimental Estudios (Video) | JoVE Journal

Producción simple y eficiente y purificación de ratón mielina de oligodendrocitos de la glucoproteína de la encefalomielitis autoinmune experimental Estudios

Explorar más videos