Estudiar el Sistema de Control de Calidad de la Proteína D. discoideum Uso de imágenes de células vivas con temperatura controlada
2 de diciembre de 2016
La amebas social Dictyostelium discoideum se ha establecido recientemente como un sistema para estudiar el mal plegamiento de proteínas y la proteostasis. Aquí, describimos una nueva metodología basada en imágenes para estudiar la agregación de proteínas inducida por la temperatura y la respuesta al estrés celular en D. discoideum.
El objetivo general de esta técnica de imagen es observar las perturbaciones celulares inducidas por el estrés térmico en las células de Dictyostelium discoideum. Este método puede ayudar a comprender los mecanismos de la respuesta al estrés térmico y el control de la calidad de las proteínas en la ameba Dictyostelium discoideum. La principal ventaja de esta técnica es el control estricto y preciso de la temperatura aplicada a la obtención de imágenes de los archivos de las células.
Para comenzar el procedimiento, prepare las células de Dictyostelium como se detalla en el protocolo de texto. El día antes de la toma de imágenes, divida las células en un medio de baja fluorescencia a 10.000 células por mililitro. Antes de la obtención de imágenes, recoja las células de la placa de tejido en LFM, luego transfiera un número adecuado de células a placas con fondo de vidrio.
Deje que las células se asienten durante 20 minutos y luego reemplace con cuidado el medio usado con medio nuevo, para eliminar las células no sedimentadas. Las células de imagen en condiciones no estresadas a 23 grados centígrados, adquieren un mínimo de seis campos de visión. Adquiera pilas Z de un máximo de siete micrómetros en pasos de uno a 0,25 micrómetros para capturar todo el volumen de la celda.
A continuación, adquiera una imagen de campo claro de referencia para evaluar el número total de células. A continuación, ajuste la temperatura de la cámara de enfriamiento a 30 grados centígrados. Una vez que la visualización de la temperatura haya alcanzado el valor deseado, vuelva a enfocar manualmente en el canal de campo claro.
Verifique todos los campos de visión registrados antes de iniciar el lapso de tiempo, luego inicie un lapso de tiempo para cuatro horas de estrés por calor con un intervalo de tiempo de cinco a 10 minutos entre puntos de tiempo. Compruebe que el enfoque es correcto durante la adquisición de los dos primeros puntos de tiempo. Una vez completado el estrés por calor, reduzca la temperatura a 23 grados centígrados.
Espere a que la pantalla de temperatura se ajuste y vuelva a enfocar manualmente. A continuación, grabe vídeos time-lapse en la fase de recuperación durante ocho a 10 horas en intervalos de tiempo de 10 a 20 minutos. Compruebe que el enfoque es correcto durante la adquisición del primer punto de tiempo.
Comience abriendo el paquete de procesamiento de imágenes equipado con el complemento Cell Counter. Cargue la pila de imágenes de campo claro haciendo clic en Archivo y, a continuación, en Abrir. A continuación, abra el complemento Cell Counter, cargue la pila de imágenes haciendo clic en Inicializar.
Elija el tipo de contadores haciendo clic en la casilla correspondiente. Después de esto, cuente el número total de celdas, guarde los marcadores haciendo clic en Guardar marcadores. Una vez guardados los marcadores, cargue la proyección máxima de la imagen de fluorescencia hyperstack.
Abra el complemento Cell Counter y cargue los marcadores haciendo clic en Cargar marcadores. A continuación, elija el tipo de marcador para los focos citosólicos y cuente las células. Los marcadores existentes se pueden utilizar como guía para la posición de las celdas individuales.
Recupere el número de recuentos por rebanada haciendo clic en Resultados, luego guarde los recuentos en otro lugar para cálculos posteriores. En este estudio, se observó la distribución de la proteína poliglutamina Q103 marcada con GFP en células de Dictyostelium. En condiciones normales de crecimiento, la Q103-GFP se distribuye de forma difusa en el citoplasma.
Durante el estrés térmico, el marcador Q103-GFP se fusiona para puntear estructuras. Tras la liberación del estrés y el crecimiento en condiciones normales de crecimiento, estas estructuras se disuelven. La redistribución de Q103-GFP y la formación de focos citosólicos inducidos por estrés térmico se cuantifica mediante análisis de imágenes.
Los resultados representativos de la respuesta al estrés térmico se pueden ver aquí. El número de células con focos citosólicos Q103-GFP aumenta en número con el estrés térmico continuo. Durante el estrés térmico, el sistema de control de calidad de las proteínas se ve abrumado, por lo que las proteínas propensas a la agregación no pueden mantenerse en un estado soluble.
Después del estrés por calor, el número de células con focos citosólicos disminuye, lo que sugiere que las proteínas agregadas se disuelven. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo monitorear las perturbaciones inducidas por el estrés por calor en la ameba Dictyostelium discoideum. A lo largo de la toma de imágenes, es importante recordar que el enfoque esté correctamente ajustado, si su microscopio no posee un enfoque automático de hardware.
El control de temperatura mostrado en este protocolo se puede utilizar más allá del campo de respuesta al estrés térmico. Las imágenes en condiciones normales de crecimiento mediante control de temperatura pueden reducir notablemente los efectos fototóxicos.
Visión general
Este estudio presenta una nueva metodología de imagen para investigar la agregación de proteínas inducida por temperatura y las respuestas de estrés celular en la ameba social Dictyostelium discoideum. La técnica permite un control preciso de la temperatura, permitiendo a los investigadores observar los efectos del estrés térmico en el control de calidad de las proteínas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Neurociencia
- Agregación de proteínas
Antecedentes
- Dictyostelium discoideum sirve como organismo modelo para estudiar las respuestas celulares al estrés.
- Entender el plegamiento erróneo de las proteínas es crucial para obtener conocimientos sobre varias enfermedades.
- El estrés térmico puede llevar a la agregación de proteínas, afectando la función celular.
- Las técnicas de imagen son esenciales para la observación en tiempo real de los procesos celulares.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método para observar las perturbaciones celulares inducidas por el estrés térmico.
- Dilucidar los mecanismos de respuesta al estrés térmico en D. discoideum.
- Evaluar la efectividad del control de calidad de las proteínas bajo condiciones de estrés.
Métodos utilizados
- Preparación de células de Dictyostelium en medio de baja fluorescencia.
- Imagen bajo temperaturas controladas (23°C y 30°C).
- Imagen de lapso de tiempo para monitorear las respuestas celulares durante varias horas.
- Análisis de imágenes para cuantificar la agregación y recuperación de proteínas.
Resultados principales
- La proteína Q103-GFP mostró una distribución difusa en condiciones normales.
- Durante el estrés térmico, Q103-GFP formó estructuras puntiformes indicando agregación.
- Después del estrés, el número de células con agregados disminuyó, sugiriendo recuperación.
- El método demostró con éxito la dinámica de la agregación y disolución de proteínas.
Conclusiones
- La técnica de imagen proporciona información sobre las respuestas de estrés celular.
- El control de temperatura es crítico para la observación precisa de la dinámica de las proteínas.
- Esta metodología puede aplicarse a otras áreas de investigación del estrés celular.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Temperature-controlled live cell imaging in Dictyostelium discoideum enables precise interrogation of protein quality control mechanisms under stress, supporting early-stage target validation for protein aggregation pathways. This approach enhances predictive confidence in mechanistic studies relevant to neurodegeneration and proteostasis. The method's ability to reduce phototoxicity and quantify dynamic protein aggregation provides actionable insights for portfolio triage in discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of protein aggregation dynamics in a live, stress-responsive model.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cellular responses to heat-induced proteotoxic stress.
- Facilitates functional validation of protein quality control targets relevant to aggregation disorders.
Screening & Assay Development
- Provides a validated imaging protocol for quantifying protein aggregation and dissolution events.
- Reduces phototoxicity, allowing higher imaging intensities for low-expression proteins.
- Supports reproducible, quantitative readouts suitable for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms of protein misfolding and aggregation.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical model development.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for aggregation-targeted therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical validation of protein aggregation targets.
- Discovery Biology: Quantifies heat stress-induced protein aggregation, clarifying proteostasis pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative aggregation metrics for assay development.
- Analytics: Provides cell-level counts of aggregation events and recovery dynamics.
- Translational Research: Models disease-relevant stress responses for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable protocol for diverse protein quality control studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation for protein aggregation pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized imaging and analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing quantitative, mechanistic data on proteostasis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of aggregation-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging and quantitative image analysis.
- Demands temperature-controlled microscopy and compatible analytical software.
- Necessitates cross-team standardization for imaging parameters and data interpretation.
- Adaptable to other aggregation-prone protein models with protocol optimization.
- High cell motility and phototoxicity sensitivity require careful experimental design.
