Estudiar el Sistema de Control de Calidad de la Proteína

El objetivo general de esta técnica de imagen es observar las perturbaciones celulares inducidas por estrés térmico en células de Dictyostelium discoideum. Este método puede ayudar a comprender los mecanismos de respuesta al estrés térmico y al control de calidad de proteínas en el ameba Dictyostelium discoideum. La principal ventaja de esta técnica es el control ajustado y preciso de la temperatura aplicada a las células durante la adquisición de imágenes.

Para comenzar el procedimiento, prepare las células de Dictyostelium según se detalla en el protocolo escrito. El día anterior al análisis de imágenes, divida las células en medio de baja fluorescencia hasta alcanzar 10.000 células por mililitro. Antes de la obtención de imágenes, recolecte las células del plato de cultivo en LFM y luego transfiera un número adecuado de células a placas de vidrio en la base.

Deje que las células sedimenten durante 20 minutos y luego reemplace cuidadosamente el medio usado por medio fresco, para eliminar las células no adheridas. Observe las células en condiciones no estresantes a 23 grados Celsius y obtenga al menos seis campos de visión. Adquiera series Z de un máximo de siete micrómetros en pasos de uno a 0,25 micrómetros para capturar todo el volumen celular.

Luego, adquiera una imagen de referencia de campo claro para evaluar el número total de células. A continuación, ajuste la temperatura de la cámara de enfriamiento a 30 grados Celsius. Una vez que la pantalla de temperatura alcance el valor deseado, vuelva a enfocar manualmente en el canal de campo claro.

Revise todos los campos de visión registrados antes de iniciar la lapse de tiempo, luego comience una lapse de tiempo de cuatro horas de estrés térmico con un intervalo de cinco a 10 minutos entre puntos temporales. Verifique que el enfoque sea correcto durante la adquisición de los dos primeros puntos temporales. Una vez completado el estrés térmico, reduzca la temperatura nuevamente a 23 grados Celsius.

Espere a que el indicador de temperatura se estabilice y enfoque manualmente. Luego, registre películas de lapso de tiempo durante la fase de recuperación durante ocho a diez horas con intervalos de 10 a 20 minutos. Verifique que el enfoque sea correcto durante la adquisición del primer punto temporal.

Comience abriendo el paquete de procesamiento de imágenes equipado con el complemento Cell Counter. Cargue la pila de imágenes de campo brillante haciendo clic en Archivo y luego en Abrir. A continuación, abra el complemento Cell Counter y cargue la pila de imágenes haciendo clic en Inicializar.

Seleccione el tipo de contadores haciendo clic en el cuadro correspondiente. A continuación, cuente el número total de células y guarde los marcadores haciendo clic en Guardar marcadores. Una vez guardados los marcadores, cargue la proyección máxima del hiperapilamiento de la imagen de fluorescencia.

Abra el complemento Cell Counter y cargue los marcadores haciendo clic en Load Markers. A continuación, elija el tipo de marcador para los focos citosólicos y cuente las células. Los marcadores existentes pueden utilizarse como guía para la posición de las células individuales.

Recupere el número de cuentas por corte haciendo clic en Resultados, luego guarde las cuentas en otro lugar para cálculos posteriores. En este estudio, se observó la distribución de la proteína poliglutamina marcada con GFP, Q103, en células de Dictyostelium. Bajo condiciones normales de crecimiento, Q103-GFP se distribuye de forma difusa en el citoplasma.

Durante el estrés térmico, el marcador Q103-GFP se agrupa en estructuras punteadas. Tras la supresión del estrés y el crecimiento en condiciones normales, estas estructuras se disuelven. La redistribución de Q103-GFP y la formación de focos citosólicos inducidos por estrés térmico se cuantifican mediante análisis de imágenes.

Aquí se pueden observar los resultados representativos de la respuesta al estrés térmico. El número de células con focos citosólicos de Q103-GFP aumenta progresivamente con la prolongación del estrés térmico. Durante el estrés térmico, el sistema de control de calidad de proteínas queda sobrecargado, por lo que las proteínas propensas a la agregación no pueden mantenerse en un estado soluble.

Después del estrés térmico, disminuye el número de células con focos citoplasmáticos, lo que sugiere que las proteínas agregadas se disuelven. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo monitorear las perturbaciones inducidas por estrés térmico en la ameba Dictyostelium discoideum. Durante la adquisición de imágenes, es importante recordar asegurarse de que el enfoque esté correctamente ajustado, si tu microscopio no posee un sistema automático de enfoque por hardware.

El control de temperatura mostrado en este protocolo puede utilizarse más allá del campo de la respuesta al estrés térmico. La adquisición de imágenes bajo condiciones normales de crecimiento utilizando control de temperatura puede reducir notablemente los efectos fototóxicos.