Name: La alimentación de las larvas de pez cebra paradigma para la alta en grasas: Alimentación, imágenes en vivo, y Cuantificación de la ingesta de alimentos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Aprende a preparar alimentos ricos en lípidos para larvas de Danio rerio y visualizar la absorción lipídica mediante análogos fluorescentes. Este método permite cuantificar la ingesta alimentaria y estudiar el metabolismo de lípidos dietéticos en tiempo real.

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Los autores agradecen a Meng-Chieh Shen por las imágenes, a Jennifer Anderson por proporcionar comentarios útiles sobre el manuscrito y a los miembros del laboratorio Farber por sus contribuciones en el desarrollo de estas técnicas. Este estudio fue financiado por el premio NIDDK-NIH RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F) y F32DK096786 (J.P.O.). Este contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los NIH. La Fundación Benéfica G. Harold y Leila Y. Mathers proporcionó apoyo adicional al laboratorio de S.A.F y a la Fundación Carnegie para la Ciencia.

Estos protocolos han sido aprobados por la Institución Carnegie para la Ciencia Institucional Cuidado de Animales y el empleo (Protocolo nº. 139). 1. Preparación de los animales <ol><li> Mantener los adultos y las larvas a 28 ° C en un 14 h: 10 h luz: oscuridad ciclo. Alimentar a los adultos dos veces al día con la cáscara de Artemia libre (decapsulated, no eclosión, a partir de las 14 dpf) y microgránulos comerciales. </li><li> Estos protocolos se han optimizado para el uso de 6-7 larvas dpf recogida por desove natural del fondo AB. Los protocolos pueden ser modificados para las larvas de otras edades y procedencias. No proveer alimento exógeno antes del 6 dpf. </li><li> Anestesie larvas con tricaína en medios embrión (EM) (4,2 ml de 4 mg / ml por tricaína 100 EM ml) a temperatura ambiente (RT). </li></ol> 2. Preparación de los lípidos ricos en yema de huevo RSS <ol><li> Preparar y almacenar las yemas de huevo de gallina. Separar la yema y la clara de 12 huevos de gallina. Reunir las yemas, alícuota de 1 ml en 1,5tubos ml y se almacena a -80 ° C hasta 1 año (12 yemas harán ~ 80 alícuotas). Aunar los blancos, almacenar y usar como, alimentación rica en proteínas pobre en lípidos. </li><li> Preparar análogo de lípido fluorescente (s) que se añade a la alimentación de la yema de huevo, si se desea. <ol><li> Suspender el análogo comprado, polvo fluorescente de lípidos en etanol al 100% o 100% de cloroformo a 0,1 g / l (ver nota siguiente discusión de disolventes), la alícuota en tubos de vidrio opaco, sellar con parafilm, y almacenar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Debido a la rápida evaporación de los disolventes orgánicos no utilice volúmenes alícuotas de menos de ~ 400 l para el almacenamiento a largo plazo. Nota: Si el análogo de lípido se suspende en etanol, grandes volúmenes de análogo de lípido serán utilizados, ya que se seca más rápido bajo N 2 de cloroformo. Si el análogo de lípido se suspendió en etanol que no tiene que ser secado y resuspendido antes de añadir a la alimentación de liposomas en el paso 2.2.4, pero la concentración total de etanol no debe superar 0.1% en el pienso de liposomas para evitar efectos fisiológicos de confusión potenciales de etanol. </li><li> Para los análogos de ácidos grasos fluorescentes: Preparar un volumen total de la emulsión de yema de huevo 20 ml 5% en EM. A partir de ese preparar alícuotas de 5 ml con una concentración final de 6,4 M de 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indaceno (BODIPY C 16) para los ensayos de formación de imágenes confocal en vivo y la ingesta de alimentos o 1 mg / ml BODIPY C 12 para obtener imágenes de microscopio estereoscópico. La transferencia de la cantidad deseada del análogo de lípido fluorescente en un tubo de plástico de 1,5 ml. Se seca el lípido bajo una corriente de N2, teniendo cuidado de no soplar el lípido fuera del tubo. </li><li> Inmediatamente, se vuelve a suspender en 5 l de etanol 100% con la pipeta una corriente abajo de los lados del tubo, añadir 95 l EM, y mezclar bien. Nota: La mezcla debe aparecer homogénea; Si los lípidos de color permanece en los lados del tubo o el líquido aparece clumpy, el lípido no ha solubilizado completamente y requiere más etanol. Proteger el tubo de aquí para allám de luz y almacenar en hielo. </li><li> Por análogo fluorescente de colesterol: preparar una concentración final de colesterol / ml 2,4 g de emulsión de yema de huevo 5 ml de 0,5-5% para los estudios de imagen en vivo. La transferencia de la cantidad deseada de colesterol en un tubo de plástico 1,5 ml. Se seca el lípido bajo una corriente de N2, teniendo cuidado de no soplar el lípido fuera del tubo. </li><li> Inmediatamente, se resuspende en 15 l de RT 100% de etanol pipeteando una corriente abajo de los lados del tubo y se mezcla con 85 l de RT 1% graso libre de ácido BSA en H purificada 2 O. Proteger el tubo de la luz y almacenar en hielo. </li></ol></li><li> Preparar la yema de huevo de liposomas RSS. <ol><li> Añadir una alícuota descongelada de yema de huevo para EM en un tubo cónico de 50 ml. Agite la mezcla de yema de huevo diluida durante 1-2 minutos; la mezcla debe parece ser una emulsión homogénea. </li><li> Se vierte la mezcla a través de un colador de malla fina para eliminar los conglomerados de proteínas y recoger en un nuevo tubo cónico, fresca 50 ml. </li><li> sonica pulsote La mezcla de huevo con una micropunta cónico un cuarto de pulgada (5 veces (5 x 1 segundo encendido y 1 segundo apagado) una pausa 5-10 segundos entre cada serie; intensidad de salida: 6 W) a temperatura ambiente para crear liposomas. la configuración de energía Sonicator son instrumento dependiente y por lo tanto requieren de optimización para cada instrumento y micropunta. Nota: Continuamente roca mezcla de liposomas a TA para mantener la homogeneidad hasta su uso. </li></ol></li><li> Añadir el análogo de lípido fluorescente a los liposomas de yema de huevo, si se desea. Inmediatamente después de la sonicación, pipetear las lípidos preparados en la mezcla de liposomas y agitar a alta velocidad durante 30 segundos para incorporar en liposomas. Proteger a la mezcla de la luz envolviendo el tubo en aluminio y continúe meciendo a TA. </li></ol> Paradigma 3. Alimentación <ol><li> Preparar las larvas para alimentarse. <ol><li> Antes de comenzar la alimentación, las larvas a detectar los defectos morfológicos evidentes que pueden impedir la alimentación. larvas de transferencia de 60 mm x 15 mm o placas de Petri de 6 ó 12 pocillos plates, reducir al mínimo EM, y reemplazar con 5 ml de la solución de liposomas preparados. </li><li> Si es necesario, transferir las larvas de control sin alimentar a 5 ml EM y / o 5 ml 5% de clara de huevo en EM y tratar en paralelo. </li></ol></li><li> Agite suavemente las larvas se incuban en un eje de balancín (29-31 ° C a 30 rpm) en el pienso para estimular la ingesta de alimentos sin dejar de proteger de la luz, si los análogos de lípidos fluorescentes están presentes. Si la necesidad larvas que se expone a la luz, minimizar la exposición con una cubierta de cristal tintado incubadora. </li><li> Al final del período de alimentación, enjuague las larvas nadando libremente en EM 3 veces. Nota: Las larvas pueden comenzar a consumir liposomas en cualquier momento durante la alimentación. Si es crítico que las larvas de comenzar la alimentación al mismo tiempo, la pantalla de la ingesta de alimentos (ver 3.4) después de 1 h de alimentación y devolver sólo larvas que han comenzado la alimentación de la emulsión de la yema de huevo para completar la alimentación. </li><li> Detectar las larvas en este punto de la ingesta de alimentos como un número pequeño no puede eat (generalmente 0-5 ~%). Examinar los intestinos de las larvas que han sido anestesiados o ligeramente enfriados en un bloque de metal en hielo para determinar si se han alimentado: larvas que han consumido liposomas tendrá un intestino oscuro (Figura 1). </li><li> Image o proceso de larvas para la ingesta de alimentos inmediatamente. Alternativamente, el lugar larvas en EM fresco y se incuba a 28 ° C para permitir el procesamiento metabólico que se produzca. </li></ol> 4. Montaje Las larvas de imágenes en vivo <ol><li> Preparar el medio de montaje. <ol><li> El 3% de celulosa de metilo: añadir 0,75 g de metilcelulosa a 25 ml de casi ebullición EM, vórtice, roca a TA 2-3 días hasta que se disuelva por completo, y se almacena a 4 ° C durante años a -20 ° C. Los ciclos repetidos de congelación y descongelación a 4 ° C se eliminar las burbujas de aire. Almacenar 3% de metilcelulosa en hielo durante el montaje larvas. </li><li> El 1,2% de agarosa de bajo montaje: añadir 0,3 g de bajo punto de fusión de agarosa a 25 ml y disolver EM llevando a ebullición, alícuota de 2 ml en tUBE, y se mantiene a 26-28 ° C en un bloque de calor. alícuotas no utilizados se pueden almacenar a temperatura ambiente o -20 ° C y se hirvieron otra vez en el momento de uso. Asegúrese de que agarosa es lo suficientemente frío antes de exponer a las larvas o pueden ser sobre-calentado. </li></ol></li><li> De bajo magnificación, imágenes en vivo de mediano rendimiento, colocar una lámina de vidrio sobre un tejido en un bloque de metal en hielo y esperar a que la corredera se enfríe. Aplicar una cantidad generosa de 3% de metilcelulosa (que se ha mantenido a 4 ° C en hielo) sobre el portaobjetos, transferir una larva en el metilcelulosa al 3%, usando un hierro pesca con sedal de pesca de diámetro (0,41 mm pegado a la extremo de un tubo capilar de vidrio) crear un troth para drenar el exceso EM (lo que no se diluirá que la celulosa de metilo) y la posición de las larvas como deseado. </li><li> Para corto plazo (&lt;20 min), de alta magnificación de imágenes en vivo con un objetivo de inmersión de aceite en posición vertical, montaje larvas con el cubreobjetos cobertizo método. <ol><li> Utilice pegamento a base de cianoacrilato (superglue) aadjuntar aa 22 mm x 30 mm cubreobjetos a un extremo de un portaobjetos de vidrio. Utilice una de póquer para poner una línea fina de 3% de metilcelulosa en la diapositiva al lado del cubreobjetos y transferir las larvas a la diapositiva con un gran calibre pipeta Pasteur. Eliminar el exceso de EM para que no se diluya la metilcelulosa. </li><li> El uso de un poker, coloque suavemente larvas en la celulosa de metilo en sus lados (lado izquierdo hasta la imagen más del hígado, el lado derecho hasta la imagen de la vesícula biliar) con la cabeza junto a la cubreobjetos. </li><li> superglue lugar en las esquinas de un segundo cubreobjetos y suavemente coloque un borde del cubreobjetos sobre el portaobjetos montado y el otro en la diapositiva, la reducción de las larvas. Tenga cuidado de no aplicar una presión excesiva durante esta etapa o con el objetivo mientras que las imágenes de manera que las larvas permanecerá ileso. </li></ol></li><li> Para largo plazo, de imágenes de alta magnificación con un objetivo de inmersión en posición vertical, montaje larvas en agarosa. Añadir una larva de una pequeña alícuota de 1,2% de agarosa de baja fusión y luego transferir lalarva en un pequeño volumen de agarosa a una placa de Petri. <ol><li> posición de forma rápida las larvas con un poker antes de que solidifique de agarosa. Dejar que la agarosa se seque durante 2-3 min y cubrir la agarosa plenamente con EM fresco para evitar que se seque. </li></ol></li><li> Para largo plazo, de imágenes de alta magnificación con un objetivo invertido, montaje larvas en un plato con fondo de vidrio en agarosa. <ol><li> Enfriar un bloque de metal en hielo. Coloque el plato en el bloque de metal separadas por un pañuelo de papel para evitar un enfriamiento excesivo y la congelación de las larvas. Transferir una larva al plato y quitar la EM por efecto de mecha con un pañuelo de papel. </li><li> Coloque una gota de 28 ° C de agarosa de bajo punto de fusión (1,2%) en la parte superior de la larva y colocar inmediatamente con un póquer (lado izquierdo hacia abajo para mejor imagen del hígado, lado derecho hacia abajo a la imagen de la vesícula biliar). Retirar el recipiente del bloque frío, dejar secar durante 2-3 minutos, y añadir un volumen suficiente de EM fresca para cubrir la agarosa (~ 2-5 ml). </li></ol></li></ol> La ingesta 5. La comidaEnsayo <ol><li> Al final de un canal de liposomas yema de huevo que contiene 6,4 M BODIPY C 16, en común un mínimo de 10 larvas de lavado en un tubo de plástico 1,5 o 2 ml, eliminar EM, y complemento de congelación. Las muestras pueden ser almacenadas a -80 ° C protegido de la luz durante varios meses. Nota: Si es posible, recoger múltiples repeticiones. Es importante para recoger larvas sin alimentar en este paso para normalizar la fluorescencia de fondo de lípidos (idealmente larvas de la misma embrague se utilizan). </li><li> Realizar una extracción de lípidos Bligh-Dyer modificada 3,21. <ol><li> Añadir 100 l tampón de homogeneización (20 mM Tris-Cl, EDTA 1 mM) a la muestra en hielo (H 2 O, alternativamente purificada se puede utilizar). Homogeneizar en hielo con un aparato de ultrasonidos micropunta (5 s en total: 1 seg en 1 segundo apagado). Compruebe que las larvas son totalmente homogeneizada; en caso contrario, repetir. Transferir a un tubo de cultivo de vidrio desechable de 13 ml (otros tubos de vidrio pueden ser utilizados). Nota: El cloroformo es peligrosa; realizar todos los ex lípidos subsecuentepasos de tracción a temperatura ambiente en una campana química. </li><li> Por cada 100 l de tampón de homogeneización de segunda mano, añadir 375 l de 1: 2 (cloroformo: metanol). Vortex 30-60 seg, incubar 10 min, añadir 125 l de cloroformo por cada 100 l tampón de homogeneización utilizado, y agitar 30 seg. </li><li> Añadir 125 l de 200 mM Tris pH 7,5 por 100 l tampón de homogeneización utilizado, vórtice 30 segundos y centrifugar (2.000 x g, 5 min, RT, protegido de la luz). Retirar con cuidado las muestras de la centrífuga. Ellos se pueden separar en dos fases: una fase superior es acuosa, una interfaz de escombros de las larvas, y una fase orgánica inferior (contiene lípidos). </li><li> Con una pipeta de vidrio limpio recoger la parte inferior, la fase orgánica y la transfiere en un tubo de vidrio 13 ml limpio. Nota: Tenga cuidado de evitar la fase acuosa y restos de larvas en la interfase; si se produce contaminación, repita el paso centrifugación y recoleta. Desechar la fase acuosa superior; puede ser útil para eliminar y desechar estefase antes de la recogida de la fase orgánica. La muestra puede ser almacenada a -80 ° C por hasta 1 mes. </li><li> Se seca la fase orgánica bajo vacío (0,12 atm) mientras que la protección de la luz. No continúe para secar las muestras después de que el líquido se haya evaporado, ya que reducirá la solubilidad en lípidos. Volver a suspender los lípidos en 2: 1 (cloroformo: metanol) y almacenar en hielo. El volumen óptimo del cloroformo: metanol solución depende del método de detección utilizado; empezar con poco y continuar para diluir según sea necesario. Una pauta general es utilizar 10 l de 10 larvas agrupada. </li></ol></li><li> Encuentra las volúmenes completos de muestras en intervalos uniformemente espaciados sobre una placa de TLC canalizado y escanear la placa con un escáner de láser que se utiliza habitualmente para formación de imágenes biomolecular (por ejemplo, un lector de placas fluorescente). Para los análogos de lípidos fluorescentes incluidos en la lista de materiales que tienen un máximos de excitación 500 a 650 nm y emisión máximos de 510 a 665 nm, usar un láser de 488 nm y con la colección de emisión a 520 nm. <ol><li> Cuantificar el total de fluorescencia de cada punto con el software de imágenes. Nota: para la correcta forma natural de lípidos de fluorescencia de fondo restando la fluorescencia de las muestras de larvas pareadas, sin alimentar. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las técnicas descritas aquí permiten a los investigadores tratan larvas de pez cebra con una alimentación rica en lípidos, visualizar el procesamiento de los lípidos de la dieta en larvas vivas, y cuantificar la ingesta de alimentos de las larvas. Para asegurar el éxito, se debe prestar especial atención a varios pasos críticos. huevos de gallina comerciales varían; para minimizar la variabilidad potencial llevamos a cabo todos los ensayos en los huevos orgánicos de gallinas libres de jaulas que no han sido enriquecidas...

Los mecanismos por los que el intestino regula el procesamiento de lípidos de la dieta, el hígado controles complejos síntesis de lípidos y metabolismo de las lipoproteínas, y cómo estos órganos trabajan con el sistema nervioso central para controlar la ingesta de alimentos se conocen por completo. Es de interés biomédico para dilucidar esta biología a la luz de la actual epidemia de la obesidad, las enfermedades cardiovasculares, la diabetes y la enfermedad de hígado graso no alcohólica. Los estudios en cultivos celulares y en ratones han proporcionado la mayor parte de nuestra comprensión de las relaciones mecánicas entre lípidos de la dieta y la enfermedad, y el pez cebra (Danio rerio) están emergiendo como un modelo ideal para complementar este trabajo. El pez cebra tiene gastrointestinal similar (GI) los órganos, el metabolismo de los lípidos, y el transporte de lipoproteínas de vertebrados superiores a 1,2, se desarrollan rápidamente y son genéticamente manejable. La claridad óptica de la larvas de pez cebra facilita los estudios in vivo, una particulaventaja r para el estudio del sistema GI como su medio extracelular (es decir, la bilis, microbiota, la señalización endocrina) es prácticamente imposible de modelo ex vivo. De acuerdo, un cuerpo de investigación combinando la tratabilidad genética y condiciones favorables para imágenes en directo de las larvas de pez cebra con una variedad de manipulaciones de la dieta (alto contenido de grasa, 3,4 -colesterol 5 y dietas -carbohydrate 6,7), y modelos de enfermedad cardiovascular 8, la diabetes 9,10, esteatosis hepática 11-13, 14-16 y la obesidad, están emergiendo para proporcionar una gran cantidad de puntos de vista metabólico. Un aspecto esencial de la transición de la larvas de pez cebra en la investigación metabólica es la optimización de las técnicas desarrolladas en otros animales modelo al pez cebra y el desarrollo de nuevos ensayos que explotan las ventajas únicas de la pez cebra. Este protocolo presenta técnicas desarrollados y optimizados para alimentar larvas de pez cebra un lipid-rica comida, visualizar el procesamiento de lípidos de la dieta de todo el cuerpo de la resolución subcelular, y miden la ingesta de alimentos. yema de huevo de pollo fue elegido para componer la comida rica en lípidos, ya que contiene altos niveles de grasas y colesterol (lípidos componen ~ 58% de yema de huevo de gallina, de los cuales ~ 5% es el colesterol, 60% son triglicéridos, y 35% son fosfolípidos ). Yema de huevo de pollo proporciona más grasa que los alimentos típicos comerciales de pez cebra de microgránulos (~ 15% de lípidos) y la ventaja de que es un alimento estandarizado con porcentajes conocidos de especies ácidos grasos específicos, como las dietas de pez cebra y regimientos de alimentación no se han normalizado a través de los laboratorios 17. Por otra parte, los análogos de lípidos fluorescentes previstos en la yema de huevo visualizar el transporte y la acumulación de lípidos de la dieta 18, los componentes celulares de imagen incluyendo gotitas de lípidos, actuando ambos colorantes vitales 3 y a través de la incorporación covalente en lípidos complejos, investigar el metabolismo a través de cromatografía en capa fina (TLC) 19 </sup&gt; Y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (SAF datos no publicados), y proporcionar un ensayo cuantitativo para la ingesta total de alimentos 20.

<table><tbody><tr><td>Tricaína (3-aminobenzoato de etilo sal de metanosulfinato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Anestesia para larvas de pez cebra</td></tr><tr><td>Huevos de gallina</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Huevos orgánicos, de gallinas no enjauladas, no enriquecidos con ácidos grasos omege-3</td></tr><tr><td>Procesador ultrasónico 3000 sonicador</td><td>Misonix, Inc.</td><td>S-3000</td><td>Para hacer liposomas de yema de huevo</td></tr><tr><td>Recinto acústico Sonabox</td><td>Misonix, Inc.</td><td>432B</td><td>Para hacer liposomas de yema de huevo</td></tr><tr><td>Micropunta cónica de 1/8"</td><td>Misonix, Inc.</td><td>419</td><td>Para hacer liposomas de yema de huevo</td></tr><tr><td>Viales de ámbar (4 ml, vidrio)</td><td>National Scientific</td><td>13-425</td><td>Almacenamiento de lípidos; incluye viales, tapas abiertas y septos de tapa</td></tr><tr><td>Incu-Shaker Mini&nbsp;</td><td>Benchmark</td><td>1222U12</td><td>Agitador incubado para piensos</td></tr><tr><td>BODIPY FL C16&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3821</td><td>Análogo lipídico fluorescente; (Ácido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-hexadecanoico)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C12&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3822</td><td>Análogo lipídico fluorescente; (Ácido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3A,4A-diaza-s-indaceno-3-dodecanoico)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3834</td><td>Análogo lipídico fluorescente; (Ácido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3A,4A-diaza-s-indaceno-3-pentanoico)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D2183</td><td>Análogo lipídico fluorescente; (Ácido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-propiónico)</td></tr><tr><td>Colesterol TopFluor&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>810255</td><td>Análogo lipídico fluorescente; 23-(difluoruro de dipirrometeneboro)-24-norcolesterol</td></tr><tr><td>Sin ácidos grasos BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0281-1G</td><td>Para la solubilización del colesterol TopFluor</td></tr><tr><td>Metilcelulosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0387</td><td>Medios de montaje para la obtención de imágenes de larvas vivas; 75 x 25 x 1 mm</td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP165-25 Medios de</td><td>montaje para larvas vivas imagenológico; 22 x 30</td></tr><tr><td>portaobjetos de microscopio VWR&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>16004-422 Montaje de</td><td>larvas para la obtención de imágenes en vivo</td></tr><tr><td></td><td>Cubierta de vidrio</td><td>12-544A</td><td>Larvas de montaje para imágenes en vivo</td></tr><tr><td>Super glue</td><td>Loctite</td><td>LOC01-30379</td><td>Larvas de montaje para imágenes en vivo</td></tr><tr><td>FluoroDish (plato con fondo de vidrio)</td><td>World Precision Instruments, Inc.&nbsp;</td><td>FD35-100</td><td>Montaje de larvas para imágenes en vivo; plato de 35 mm, vidrio de 23 mm, espesor de vidrio de 0,17 mm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Microscopio Leica Microsytems</td><td>SP-2, SP-5</td><td>para imágenes en vivo de gran aumento</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>SM21500 Nikon</td><td></td><td>para imágenes en vivo de bajo aumento</td></tr><tr><td>Tubos de cultivo de vidrio&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>73500-13100 Extracción de</td><td>lípidos; (13 x 100 mm; 13 ml)</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Plus&nbsp;</td><td>ThermoQuest</td><td>SC210A Extracción de</td><td>lípidos</td></tr><tr><td>Placas TLC canalizadas</td><td>Whatman Scientific</td><td>WC4855-821 Ensayo de</td><td>ingesta de alimentos; LK5D Gel de sílice 150 A, 20 x 20 cm, 250 mmm de espesor; Descontinuado</td></tr><tr><td>Placas TLC canalizadas</td><td>Analtech, Inc.</td><td>66911</td><td>Ensayo de ingesta de alimentos; Reemplazo directo para placas TLC de Whatman Scientific</td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Generador de imágenes de modo variable</td><td>GE Healthcare</td><td>9410</td><td>Lector de placas fluorescentes para ensayos de ingesta de alimentos</td></tr><tr><td>Software ImageQuant</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>29000605 Análisis de la ingesta de alimentos 5</td></tr><tr><td>3/4' Pipetas pasteur desechables de borosilicato de diámetro ancho&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Kimble</td><td>63A53WT</td><td>Transferencia de larvas</td></tr></tbody></table>

la alimentación de las larvas de pez cebra paradigma para la alta en grasas: alimentación, imágenes en vivo, y cuantificación de la ingesta de alimentos

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

pez cebra están emergiendo como un modelo de procesamiento de lípidos en la dieta y enfermedades metabólicas. Este protocolo describe cómo alimentar a las larvas de pez cebra con una harina rica en lípidos, que consiste en una emulsión de liposomas de yema de huevo de gallina creada mediante la sonicación de yema de huevo en medios embrionarios. Se proporcionan instrucciones detalladas para examinar las larvas para el consumo de yema de huevo, de modo que las larvas que no se alimentan no confundan los resultados experimentales. Los liposomas de yema de huevo de gallina se pueden enriquecer con análogos lipídicos fluorescentes, incluidos ácidos grasos y colesterol, lo que permite la visualización sistémica y subcelular del procesamiento de lípidos dietéticos. Se describen varios métodos para montar larvas que son propicios para la obtención de imágenes vivas a corto y largo plazo con objetivos verticales e invertidos a alto y bajo aumento. Además, se presenta un ensayo para cuantificar la ingesta de alimento de las larvas mediante la extracción de los lípidos de las larvas alimentadas con análogos lipídicos fluorescentes, la detección de los lípidos en una placa de cromatografía en capa fina y la cuantificación de la fluorescencia. Finalmente, se discuten los aspectos críticos de los procedimientos, los controles importantes, las opciones para modificar los protocolos para abordar preguntas experimentales específicas y las posibles limitaciones. Estas técnicas se pueden aplicar no solo a investigaciones enfocadas y basadas en hipótesis, sino también a una variedad de pantallas y técnicas de imágenes en vivo para estudiar el metabolismo de los lípidos en la dieta y el control de la ingesta de alimentos.

Cuando se alimenta en un agitador a 29-31 ° C, la mayoría de las larvas sanas (≥95%) va a comer dentro de 1 hora. Al consumir la emulsión de yema de huevo, el intestino de las larvas se oscurece. Muy intestinos oscuros pueden ser observadas a las 2 horas (Figura 1). Si las larvas son sin comer o dejar de comer, el intestino sigue siendo clara. Las larvas alimentadas huevo blanco exhibición distendido lumen intestinal que no se oscurece en color. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="...

El pez cebra está emergiendo como un modelo valioso de procesamiento de lípidos en la dieta y enfermedades metabólicas. Se describen los protocolos de alimentación para larvas ricas en lípidos, imágenes en vivo de análogos lipídicos fluorescentes en la dieta y cuantificación de la ingesta de alimentos. Estas técnicas se pueden aplicar a una variedad de técnicas de detección, imágenes e indagación basada en hipótesis.

La alimentación de las larvas de pez cebra paradigma para la alta en grasas: Alimentación, imágenes en vivo, y Cuantificación de la ingesta de alimentos

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

El objetivo general de este protocolo experimental es alimentar a larvas de pez cebra con una comida rica en lípidos que puede estar enriquecida con un análogo fluorescente de lípido para observar la dinámica de absorción de lípidos en las larvas y cuantificar la ingesta dietética de lípidos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del metabolismo y la biología gastrointestinal, como la forma en que los lípidos dietéticos son metabolizados y cómo se regula la ingesta de alimentos. La principal ventaja de esta técnica es que los análogos fluorescentes de lípidos pueden administrarse eficazmente mediante liposomas dietéticos.La transparencia óptica del pez cebra larvario permite utilizar microscopía para revelar el procesamiento lipídico a nivel subcelular. Para comenzar, suspenda un miligramo de análogo lipídico fluorescente en polvo en dos mililitros de cloroformo al 100 %, para obtener una concentración final de 0,5 microgramos por microlitro. Alicote el análogo en tubos de vidrio ámbar con tapas roscadas compatibles con el disolvente y que contengan una junta de teflón.Almacene estos stocks en el congelador. Añada 10,4 microlitros del stock del análogo lipídico fluorescente de 0,5 microgramos por microlitro a un tubo de 1,5 mililitros y seque bajo una corriente de nitrógeno, teniendo cuidado de no expulsar el lípido del tubo. Inmediatamente, reconstituya el lípido seco en cinco microlitros de etanol al 100 % pipeteando un chorro por las paredes del tubo.Luego, agregue 95 microlitros de medio para embriones y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo hasta que la mezcla parezca homogénea. Proteja el tubo de la luz y guárdelo en hielo hasta su uso. Para preparar una solución de liposomas fluorescentes de colesterol, agregue suficiente stock del análogo fluorescente de colesterol en un tubo de 1,5 mililitros para obtener una concentración final de 2,5 microgramos por mililitro cuando se añada a la emulsión de yema de huevo.Seque el stock de colesterol bajo una corriente de nitrógeno, como antes. Inmediatamente, resuspenda el análogo fluorescente de colesterol en 15 microlitros de etanol al 100 % a temperatura ambiente, pipeteando un flujo por la pared del tubo. Y mezcle con 85 microlitros de BSA al 1 % libre de ácidos grasos y agua.Es esencial solubilizar completamente el análogo lipídico fluorescente en etanol y en el medio para embriones antes de añadirlo a la emulsión de yema de huevo para garantizar una distribución homogénea del lípido en el alimento y una disponibilidad uniforme para todas las larvas. Proteja el tubo de la luz con papel de aluminio y guárdelo en hielo. Para preparar la solución alimenticia, añada 19 mililitros de medio para embriones a un tubo cónico de 50 mililitros y luego agregue un alícuota de un mililitro de yema de huevo.Vortexee la mezcla durante uno o dos minutos para obtener una emulsión homogénea. Vierta la mezcla a través de un colador fino para eliminar los conglomerados proteicos y recójala en un tubo cónico nuevo de 50 mililitros. A continuación, someta la mezcla de huevo a sonicación pulsada cinco veces, un segundo encendido, un segundo apagado, utilizando una microsonda cónica de 1/4 de pulgada a seis vatios.Repita el programa de sonicación cuatro veces adicionales. Esto crea los liposomas, que ahora deben agitarse continuamente hasta su uso para mantener la homogeneidad. Añada la cantidad adecuada de análogos de lípidos fluorescentes a cinco mililitros de la mezcla de liposomas inmediatamente después de la sonicación.Vortexee a alta velocidad durante 30 segundos para incorporar los análogos lipídicos fluorescentes en los liposomas. Proteja la mezcla de la luz envolviendo el tubo en papel de aluminio y devuélvalo al agitador. Añada cincuenta larvas a un recipiente de alimentación, retire el medio de embrión y agregue 5 mililitros de alimento.Para estimular la ingesta de alimento, agite suavemente las larvas en una plataforma oscilante incubada y protéjalas de la luz si se están utilizando análogos lipídicos fluorescentes. Al final del período de alimentación, lave las larvas tres veces con cinco mililitros de medio para embriones. Para inmovilizar las larvas, coloque un bloque metálico sobre hielo, cúbralo con un tejido para evitar un enfriamiento excesivo y luego coloque las larvas en el recipiente con medio para embriones encima para enfriarlas.Observe las larvas a 10x bajo un microscopio estereoscópico y determine cuáles han ingerido la alimentación con liposomas. Las larvas que han consumido liposomas tendrán el intestino oscurecido. Es fundamental determinar si una larva se ha alimentado mediante la verificación de un intestino oscurecido.Típicamente, entre uno y cinco por ciento de las larvas no comerán, y podrían confundir los resultados experimentales si no se identifican y eliminan. Para imágenes de alta magnificación a largo plazo con un objetivo invertido, enfríe primero las larvas en un bloque de metal sobre hielo. Transfiera una larva a un recipiente con fondo de vidrio y elimine el medio del embrión mediante absorción con un tejido.Coloque una gota de agarosa al 1,2 % de fusión baja a 42 grados Celsius encima de la larva e inmediatamente colóquela en posición con una aguja. Retire el recipiente del bloque frío y deje reposar la agarosa durante dos o tres minutos. Finalmente, agregue un volumen suficiente de medio fresco para embriones para cubrir la agarosa y evitar la desecación.Los especímenes ya están listos para la obtención de imágenes. Al final de una alimentación con liposomas, reúna un mínimo de 10 larvas lavadas en un tubo de 1,5 mililitros. Retire el medio de embrión y luego congele rápidamente las larvas.Repita en un tubo separado con 10 larvas no alimentadas como control. Manteniendo la muestra en hielo, agregue 100 microlitros de tampón de homogenización a cada tubo y luego homogenice con un sonicador de micropunta. Transfiera el tejido a un tubo de cultivo de 13 mililitros.Añada 375 microlitros de uno a dos de cloroformo a metanol a cada suspensión de tampón de homogenización. Agite en vórtex durante 30 a 60 segundos y luego incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Añada además 125 microlitros de cloroformo y agite en vórtex durante 30 segundos.A continuación, agregue 125 µL de TRIS 200 mM pH 7,5, vortexee durante 30 segundos y luego centrifugue a 2000 ×g durante cinco minutos protegido de la luz. Retire las muestras del centrifugador con cuidado para evitar perturbar las fases separadas. Utilizando una pipeta de vidrio limpia, recoja la fase orgánica inferior y transfiérala a un tubo de vidrio limpio de 13 mL.Evite cuidadosamente transferir cualquiera de las fases superior acuosa o intermedia de residuos larvales y deseche estas. Seque la fase orgánica bajo vacío a 0,12 atmósferas de presión, protegiéndola de la luz, teniendo cuidado de detenerse una vez que el líquido haya evaporado. Re_suspenda una sola muestra en 10 microlitros de una mezcla de cloroformo a metanol en proporción dos a uno e invoque todo el volumen de la muestra sobre una placa de cromatografía en capa fina con canales.Repita con las muestras restantes, aplicando en intervalos espaciados uniformemente. Finalmente, escanee la placa con un lector de placas fluorescente. El examen de larvas alimentadas en un agitador bajo condiciones experimentales muestra intestinos oscurecidos, típico de peces que han consumido la emulsión de yema de huevo.Las larvas no alimentadas generalmente tienen intestinos transparentes, por lo que aquellas que no han consumido la fórmula de dieta durante el período de alimentación se distinguen fácilmente. Una larva alimentada con un análogo fluorescente de lípido visualiza el transporte y la acumulación de este lípido dietético. Aquí, la señal fluorescente se observa en todos los órganos digestivos tras ocho horas de alimentación.Se incorporan varios análogos de lípidos en, y por lo tanto visualizan, conjuntos únicos de estructuras celulares, ya que se metabolizan de manera diferencial en lípidos complejos. Aquí, los análogos Fluorescent-C16 y C12 marcan gotas lipídicas. El análogo Fluorescent-C5 marca conductos hepáticos y pancreáticos, gotas lipídicas, membranas celulares y redes arteriales.Y las etiquetas análogas de Fluorescent-C2 marcan los conductos hepáticos y pancreáticos, así como las membranas celulares. Se utilizaron ensayos de ingesta alimenticia en larvas para estudiar la alimentación de larvas silvestres frente a larvas transgénicas que sobreexpresan la Apolipoproteína A4B1, y se observó que durante períodos de alimentación de cuatro horas, las larvas transgénicas comieron menos que las silvestres. Los cruces se normalizaron utilizando larvas controles emparejadas y sin alimentar.La cuantificación de la fluorescencia de larvas silvestres y transgénicas, que sobreexpresan Apo A4 tras la alimentación, muestra una ingestión significativamente reducida en las larvas transgénicas en comparación con las silvestres. Una vez dominado, el alimento con análogo lipídico fluorescente de yema de huevo se puede preparar en aproximadamente 15 minutos. La ingesta de alimento puede cuantificarse a partir de 10 a 12 muestras agrupadas en aproximadamente cuatro horas.Al intentar este procedimiento, es importante recordar tamizar las larvas en busca de defectos del desarrollo que puedan afectar la ingesta de alimento, como una mandíbula malformada, un intestino subdesarrollado o una movilidad reducida. Métodos como tratamientos farmacológicos o ingeniería del genoma pueden incorporarse a este protocolo experimental con el fin de responder preguntas adicionales, como la forma en que proteínas específicas y vías de señalización celular regulan la ingesta de alimento y el metabolismo de lípidos. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que investigadores en los campos de la fisiología gastrointestinal y la biología celular pudieran visualizar el transporte y la acumulación de lípidos dietarios en larvas de pez cebra.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar un alimento rico en lípidos para larvas de pez cebra, evaluar a las larvas para determinar la ingesta de alimento, montar larvas para imágenes a corto y largo plazo, y cuantificar la ingesta de alimento. No olvide que trabajar con un sonicador puede ser peligroso. Se debe usar protección auditiva al realizar este procedimiento.

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Investigación

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Biology

Biología

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Ensayo de evitación y tigmotaxis del pez cebra: un método de alto rendimiento para examinar el comportamiento de las larvas en respuesta a estímulos visuales aversivos

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La alimentación de las larvas de pez cebra paradigma para la alta en grasas: Alimentación, imágenes en vivo, y Cuantificación de la ingesta de alimentos (Video) | JoVE Journal

La alimentación de las larvas de pez cebra paradigma para la alta en grasas: Alimentación, imágenes en vivo, y Cuantificación de la ingesta de alimentos

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