El uso de un cartucho de filtro para la filtración de agua Las muestras y extracción de ADN del Medio Ambiente

El objetivo general de este protocolo es filtrar muestras de agua con un cartucho de filtro y extraer ADN ambiental sin necesidad de abrir el cartucho para retirar el filtro, con el fin de obtener eADN mediante metabarcodificación a partir de diversos organismos acuáticos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo ecológico, como el monitoreo de la biodiversidad y la ecología de comunidades. La principal ventaja de esta técnica es que los cartuchos de filtro pueden manejar mayores volúmenes de agua y la filtración y la extracción de ADN se pueden realizar de manera estéril.

Para comenzar este procedimiento, conecte un tubo de vacío alto al conector de entrada de una bomba de aspiración. Conecte el otro extremo del tubo a un múltiple. Asegúrese de que las tres válvulas en T rojas del múltiple estén en la posición de apagado.

A continuación, póngase un par nuevo de guantes limpios. Inserte un conector hembra luer en el extremo superior del tubo de goma para vacío. Luego, inserte un conector para vacío en el extremo inferior.

Conecte cuidadosamente el accesorio hembra luer a un puerto de salida del cartucho de filtro. Luego, conecte el conector de vacío a un tapón de silicona. Vierta un litro de agua muestreada en la bolsa de plástico preparada.

Cierre la tapa roscada con el conector luer-lock macho. Luego, conecte cuidadosamente un puerto de entrada del cartucho de filtro ensamblado con el conector luer-lock macho. Asegúrese de que todas las conexiones estén firmes.

Luego, cuelgue la bolsa de plástico de dos puntas en el panel de malla. Inserte un tapón de silicona en el puerto de entrada del colector. A continuación, encienda el aspirador.

Abrir las válvulas en T rojas para la filtración. Hacer funcionar el colector hasta que el cartucho del filtro esté seco. Luego, cerrar las válvulas en T rojas.

Repita todo este proceso para filtrar la cantidad deseada de agua. Una vez que se haya filtrado toda el agua muestreada, retire cuidadosamente el cartucho del filtro de la bolsa de plástico y del recipiente al vacío. Tape ambos extremos del cartucho con las tapas luer adecuadas.

Luego, utilizando un rotulador resistente al disolvente, etiquete el cartucho y la tapa del conector luer de entrada. Almacene a 20 grados Celsius hasta que esté listo para realizar la extracción de ADN. Para muestras mayores de cuatro litros, prepare un frasco de diez litros según se detalla en el protocolo escrito.

Agregue la muestra de agua que se va a filtrar. Luego, inserte firmemente una punta de pipeta de diez mililitros en la válvula del frasco tipo libro. Inserte firmemente el puerto de entrada del cartucho de filtro en la punta de la pipeta.

Luego, inserte un tapón de silicona en el puerto de entrada del manifold. Encienda el aspirador. A continuación, abra las válvulas en T rojas para la filtración.

Funcione el sistema hasta que el cartucho del filtro esté seco. Una vez que la filtración esté completa, cierre las válvulas en T de color rojo. Retire cuidadosamente el cartucho de la bolsa de plástico y del conector de vacío.

Luego, tape ambos extremos del cartucho con las tapas luer adecuadas. Utilice un bolígrafo resistente al disolvente para etiquetar el cartucho y la tapa luer de entrada. Almacene a 20 grados Celsius hasta que esté listo para realizar la extracción de ADN.

Precaliente un incubador a 56 grados Celsius. Luego, corte la tapa abisagrada de un tubo de 2,0 mililitros y deseche la tapa. Retire la tapa luer de entrada del cartucho de filtro.

Luego, inserte el puerto de entrada en el tubo de 2,0 mililitros. Utilizando una película auto-sellante, selle firmemente la conexión entre el cartucho y el tubo de recolección. A continuación, inserte la unidad combinada en un adaptador de centrífuga para un tubo cónico de 15 mililitros.

Centrifugue el cartucho durante un minuto a 5000 ×g para eliminar el líquido restante en el filtro. Una vez finalizada la centrifugación, retire el tubo colector del cartucho del filtro y deseche el tubo. Luego, coloque nuevamente la tapa en la entrada.

A continuación, mezcle 20 microlitros de solución de proteína A-Case, 220 microlitros de solución salina tamponada con fosfato y 200 microlitros de tampón AL. Retire el tapón de entrada y agregue la mezcla al cartucho utilizando una pipeta, insertando completamente la pipeta en el puerto de entrada. Vuelva a colocar el tapón en el puerto de entrada. Luego, coloque el cartucho de filtro en un agitador rotatorio.

Coloque el agitador rotatorio en el incubador precalentado y ajuste el agitador a 20 rpm durante 20 minutos. Durante la incubación, etiquete un nuevo tubo de 2,0 mililitros con un bolígrafo resistente al disolvente. Luego, colóquelo en un tubo cónico de 50 mililitros.

Una vez finalizada la incubación, retire la tapa de entrada. A continuación, inserte el puerto de entrada en el nuevo tubo de 2,0 mililitros. Tape el tubo cónico con una tapa de rosca.

Centrifugar durante un minuto a 5000 veces g para recoger el ADN extraído. Luego, retire el cartucho del tubo de 2,0 mililitros utilizando fórceps esterilizados. Tape el tubo y purifique el ADN extraído según se describe en el protocolo escrito.

En este procedimiento, se filtran cuatro volúmenes diferentes de agua de mar en el mismo manifold utilizando dos filtros diferentes, y posteriormente se extrae el ADN ambiental (eDNA). El cartucho de filtro detectó, en promedio, un 50 % más de especies que los filtros de fibra de vidrio. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos horas si se lleva a cabo adecuadamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo filtrar muestras de agua con un cartucho de filtro y cómo extraer ADN ambiental sin tener que cortar la carcasa para retirar el filtro antes de realizar la metagenética de ADN ambiental de diversos organismos acuáticos.