El uso de un cartucho de filtro para la filtración de agua Las muestras y extracción de ADN del Medio Ambiente

El objetivo general de este protocolo es filtrar muestras de agua con un cartucho de filtro y extraer el ADN ambiental sin tener que cortar la carcasa para eliminar el filtro del ADN electrónico del metabarcoding de varios organismos acuáticos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo ecológico, como el monitoreo de la biodiversidad y la ecología comunitaria. La principal ventaja de esta técnica es que los cartuchos filtrantes pueden alojar mayores volúmenes de agua y la filtración y extracción de ADN se pueden realizar de forma estéril.

Para comenzar este procedimiento, conecte el tubo de alto vacío al conector de entrada de una bomba aspiradora. Conecte el otro extremo del tubo a un colector. Asegúrese de que las tres válvulas en T rojas en el colector estén en la posición de apagado.

A continuación, ponte unos guantes limpios. Inserte un accesorio luer hembra en el extremo superior del tubo de goma al vacío. Luego, inserte un conector de vacío en el extremo inferior.

Conecte con cuidado el accesorio luer hembra a un puerto de salida del cartucho de filtro. Luego, conecte el conector de vacío a un tapón de silicona. Vierta un litro de agua muestreada en la bolsa de plástico preparada.

Encierre el tapón de rosca con el conector luer-lock macho. Luego, conecte con cuidado un puerto de entrada del cartucho de filtro ensamblado con el conector luer-lock macho. Asegúrese de que todas las conexiones sean seguras.

Luego, cuelgue la bolsa de plástico de dos puntas en el panel de malla. Inserte un tapón de silicona en el puerto de entrada del colector. A continuación, encienda el aspirador.

Abra las válvulas en T rojas para la filtración. Haga funcionar el colector hasta que el cartucho del filtro esté seco. A continuación, cierre las válvulas en T rojas.

Repite todo este proceso para filtrar la cantidad deseada de agua. Una vez que se haya filtrado toda el agua muestreada, retire con cuidado el cartucho de filtro de la bolsa de plástico y el recipiente de vacío. Tape ambos extremos del cartucho con las tapas luer adecuadas.

A continuación, con un bolígrafo a prueba de disolventes, etiquete el cartucho y el tapón luer de entrada. Almacene a 20 grados centígrados hasta que esté listo para realizar la extracción de ADN. Para muestras de más de cuatro litros, prepare una botella de libro de diez litros como se detalla en el protocolo de texto.

Agregue la muestra de agua a filtrar. A continuación, inserte firmemente una punta de pipeta de diez mililitros en la válvula del frasco de libro. Inserte firmemente el orificio de entrada del cartucho de filtro en la punta de la pipeta.

Luego, inserte un tapón de silicona en el puerto de entrada del colector. Encienda el aspirador. Luego, abra las válvulas en T rojas para la filtración.

Haga funcionar el colector hasta que el cartucho del filtro esté seco. Una vez completada la filtración, cierre las válvulas en T rojas. Retire con cuidado el cartucho de la bolsa de plástico y del conector de vacío.

A continuación, cubra ambos extremos del cartucho con las tapas luer adecuadas. Utilice un bolígrafo a prueba de disolventes para etiquetar el cartucho y la tapa luer de entrada. Almacene a 20 grados centígrados hasta que esté listo para realizar la extracción de ADN.

Precalienta una incubadora a 56 grados centígrados. Luego, corte la tapa con bisagras de un tubo de 2.0 mililitros y deseche la tapa. Retire la tapa del luer de entrada del cartucho del filtro.

A continuación, inserte el puerto de entrada en el tubo de 2,0 mililitros. Con una película autosellante, selle herméticamente la conexión entre el cartucho y el tubo de recolección. A continuación, inserte la unidad combinada en un adaptador de centrífuga para un tubo cónico de 15 mililitros.

Centrifugar el cartucho durante un minuto a 5000 veces g para eliminar el líquido restante en el filtro. Una vez completada la centrifugación, retire el tubo de recolección del cartucho del filtro y deseche el tubo. A continuación, vuelva a tapar el puerto de entrada.

A continuación, mezcle 20 microlitros de solución de proteína A-Case, 220 microlitros de solución salina tamponada con fosfato y 200 microlitros de tampón AL. Retire el tapón de entrada y añada la mezcla en el cartucho con una pipeta, insertando la pipeta completamente en el puerto de entrada. Vuelva a tapar el puerto de entrada. A continuación, coloque el cartucho de filtro en un agitador giratorio.

Coloque el agitador giratorio en la incubadora precalentada y ajuste el agitador a 20 rpm durante 20 minutos. Durante la incubación, etiquete un nuevo tubo de 2,0 mililitros con un bolígrafo a prueba de solventes. Luego, colócalo en un tubo cónico de 50 mililitros.

Una vez completada la incubación, retire la tapa de entrada. A continuación, inserte el puerto de entrada en el nuevo tubo de 2,0 mililitros. Tape el tubo cónico con un tapón de rosca.

Centrifugar durante un minuto a 5000 veces g para recoger el ADN extraído. A continuación, retire el cartucho del tubo de 2,0 mililitros con pinzas esterilizadas. Tape el tubo y purifique el ADN extraído como se describe en el protocolo de texto.

En este procedimiento, se filtran cuatro volúmenes diferentes de agua de mar en el mismo colector utilizando dos filtros únicos, y posteriormente se extrae el eDNA. El cartucho filtrante detectó, en promedio, un 50% más de especies que los filtros de fibra de vidrio. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos horas si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo filtrar muestras de agua con un cartucho de filtro y cómo extraer eDNA sin tener que cortar la carcasa para quitar el filtro del eDNA del metabarcoding de varios organismos acuáticos.