Un método eficaz para la síntesis de peptoides con monómeros de tipo mixto lisina / arginina del tipo y la evaluación de su actividad anti-Leishmania

El objetivo general de este procedimiento es introducir monómeros de tipo lisina y arginina dentro de la misma secuencia peptoide y evaluar la actividad de estos compuestos contra Leishmania mexicana, los parásitos causantes de la enfermedad tropical desatendida leishmaniasis cutánea. Se necesitan con urgencia nuevas terapias para la leishmaniasis cutánea, y este procedimiento puede ayudar a identificar y desarrollar peptoides como una nueva clase de posibles antiinfecciosos para esta enfermedad tropical desatendida. La principal ventaja de este protocolo es que se pueden sintetizar peptoides que contienen funcionalidad catiónica mixta.

Esto es muy deseable, ya que puede ayudar a modular las actividades biológicas de las secuencias. Aunque esto prueba contra la forma mamífero del parásito, también se puede usar contra la etapa de insecto de Leishmania mexicana o aplicarse a líneas celulares de mamíferos. La demostración visual de este método es realmente útil porque muestra la naturaleza escalonada de la síntesis y también el cultivo de parásitos en varios puntos del ciclo de vida de Leishmania mexicana.

Para comenzar este procedimiento, prepare soluciones en dimetilformamida como se describe en el protocolo de texto. A continuación, añade 0,1 milimoles de resina de amida de pista protegida por Fmoc a un recipiente de reacción de polipropileno de 20 mililitros con tapa y dos fritas. Agregue cinco mililitros de dimetilformamida y deje reposar el recipiente durante 60 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, drene el DMF utilizando una plataforma de vacío de extracción en fase sólida. A continuación, agregue dos mililitros de solución de piperidina preparada. Coloque el recipiente en una plataforma agitadora a 450 RPM a temperatura ambiente y agite durante cinco minutos.

Drene la solución usando la estación de vacío. A continuación, añadir dos mililitros de solución de piperidina y agitar en las mismas condiciones durante 15 minutos. Una vez finalizado el agitado, drene la solución a través de una estación de vacío.

Agrega dos mililitros de DMF y mezcla durante 30 segundos para lavar la resina. Drene el DMF y repita el lavado tres veces. Para comenzar la síntesis de submonómeros, agregue un mililitro de solución de ácido bromoacético preparada y 0,2 mililitros de solución de DIC preparada.

Agitar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego, escurre la solución y lava tres veces usando dos mililitros de DMF cada vez. Agrega un mililitro de solución de amina preparada.

A continuación, agita la resina durante 60 minutos a temperatura ambiente. Escurre la solución y lava la resina tres veces usando dos mililitros de DMF cada vez. A continuación, agregue un mililitro de solución de ácido bromoacético y 0,2 mililitros de solución de DIC.

Agitar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego, escurre la solución y lava tres veces usando dos mililitros de DMF cada vez. Para introducir un monómero funcionalizado con guanidina, agregue un mililitro de solución de diamina sin protección a la resina.

Agitar durante 60 minutos a temperatura ambiente. A continuación, escurre la solución y lava la resina con dos mililitros de DMF tres veces. Añadir 0,5 mililitros de la solución preparada de 2-acetil dimedona.

Agitar durante 60 minutos a temperatura ambiente. A continuación, escurre la solución y lava la resina con dos mililitros de DMF tres veces. Continúe la síntesis de submonómeros hasta que se realice la secuencia deseada.

Luego, agregue cuatro mililitros de solución de hidracina preparada y agite durante tres minutos a temperatura ambiente. Drene la solución y repita tres veces. A continuación, lava la resina tres veces utilizando dos mililitros de DMF por cada lavado.

Añadir DIPEA y seis equivalentes de pirazol-1-carboxamidina por amina libre en la secuencia peptoide. Agitar durante 60 minutos a temperatura ambiente. Una vez que se complete la agitación, drene la solución.

Lava la resina tres veces usando dos mililitros de diclorometano para cada lavado. Seca la resina al aire durante 10 minutos y guárdala para usarla en el futuro. Se puede realizar una escisión de prueba después de la adición de aminas para verificar el progreso de la síntesis.

Para comenzar el escisión final, agregue cuatro mililitros de cóctel de escisión al mismo cartucho de reacción fritado utilizado para la síntesis y cubra el recipiente. Agitar durante 90 minutos a temperatura ambiente. A continuación, utilizando el recipiente de reacción fritado, filtre el cóctel de escisión de la resina en un matraz de fondo redondo.

Evapore el cóctel de escisión con un evaporador rotativo. Agregue dos mililitros de éter dietílico anhidro para precipitar el peptoide. Con una pipeta, retire el éter dietílico y deséchelo.

Luego, repita la precipitación de éter dietílico tres veces. Una vez completada la precipitación, disuelva el peptoide crudo en 10 mililitros de acetonitrilo preparado y solución de agua acidificada. Transfiera a un recipiente previamente pesado.

A continuación, congelar a menos 20 grados centígrados y liofilizar hasta obtener un polvo seco listo para la purificación mediante HPLC en fase inversa. Después de cultivar los parásitos Leishmania mexicana y transformarlos a la etapa de amastigote axénico, comience el ensayo de citotoxicidad mediante la preparación de soluciones madre compuestas como se describe en el protocolo de texto. Agregue dos microlitros de solución madre de peptoide de cinco milimolares, control de anfotericina B y control de DMSO a la fila superior de una placa de 96 pocillos como se describe en el protocolo de texto.

Con una pipeta multicanal, añada 48 microlitros de medio fresco a la fila superior. Agregue 25 microlitros de medio fresco a todas las demás filas. A continuación, realice una dilución en serie pipeteando 25 microlitros de solución de la fila superior, añadiéndola a la fila inferior y mezclando.

Repita las diluciones para toda la placa descartando los últimos 25 microlitros pipeteados de la fila inferior. Luego, transfiera un cultivo de parásitos a un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar durante cinco minutos a 447 veces g.

Vierta el medio viejo y agregue 10 mililitros de medio fresco. A continuación, con una pipeta, vuelva a suspender suavemente la pelletza de parásitos en el nuevo medio. Contar con un hemocitómetro mejorado de Neubauer y diluir el cultivo a ocho millones de parásitos por mililitro.

Después de diluir el cultivo, agregue 25 microlitros de parásitos a cada pocillo. Incubar la placa durante 60 minutos a 32 grados centígrados. Una vez finalizada la incubación, retire 40 microlitros de solución de cada pocillo.

Añadir 90 microlitros de medio fresco a cada pocillo e incubar a 32 grados centígrados durante 24 horas. A continuación, añada 10 microlitros de solución de viabilidad celular a base de resazurina a cada pocillo. Incubar a 32 grados centígrados durante cuatro horas.

Una vez completada la incubación, use un lector de placas para medir la fluorescencia. Analice los datos eliminando el fondo promedio y comparando la fluorescencia de los pocillos después de la normalización con la resección con los controles DMSO. En este estudio, se sintetizan dos peptoides utilizando 120 miligramos de resina de rink amida cada uno.

Los productos se purifican mediante cromatografía líquida de alta presión en fase inversa, y las fracciones correspondientes a la masa objetivo se combinan y se obtienen como polvos blancos. Aquí se muestra la cantidad recolectada para los dos peptoides con rendimientos de aproximadamente el 30% para fracciones con una pureza superior al 90%. La pureza del producto se evalúa mediante una HPLC analítica de fase inversa y se visualiza a 220 nanómetros, la absorbancia de la columna vertebral de amida.

Se considera que ambos peptoides son homogéneos. Aquí se muestran los resultados representativos de los ensayos de citotoxicidad frente a L mexicana. Las soluciones madre de cinco milimolares de los compuestos se fabrican en DMSO de grado de cultivo celular y se prueban por triplicado al menos dos veces para garantizar datos sólidos.

Se puede ver que el peptoide B es más eficaz que el peptoide A para reducir el porcentaje de parásitos viables, y ambos tienen un efecto dependiente de la dosis. Después de ver este método, debe tener una buena comprensión de cómo sintetizar, caracterizar y purificar peptoides que contienen monómeros de tipo lisina y arginina y cómo usarlos en ensayos de citotoxicidad contra Leishmania mexicana. Nuestro método para agregar funcionalidad catiónica dual a los peptoides agrega solo un paso adicional simple al método de submonómero comúnmente utilizado para la síntesis de peptoides.

Siguiendo este método, se pueden agregar submonómeros de tipo lisina o arginina de diferentes longitudes para ayudar a aumentar la diversidad de la biblioteca, por ejemplo, con cadenas laterales de dos a seis carbonos de longitud. Al intentar la síntesis de peptoides, es muy importante recordar lavar bien la resina entre pasos para evitar productos de adición o eliminación no deseados. Este método allana el camino para que los investigadores exploren la actividad biológica de los peptoides mixtos funcionalizados catiónicamente y comparen esta actividad con aquellos que contienen exclusivamente monómeros de tipo lisina o arginina.

Por último, no olvide que los parásitos y varios de los reactivos utilizados en este protocolo pueden ser extremadamente peligrosos. Por lo tanto, es importante utilizar siempre equipos de protección personal adecuados y trabajar dentro de una campana extractora o cabina de seguridad microbiológica cuando corresponda.