Name: hiperpolarizado 13 C metabólico espectroscopía de resonancia magnética e Imagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Aprende a hiperpolarizar moléculas marcadas con carbono-13 mediante polarización nuclear dinámica para observar procesos metabólicos en tiempo real en líneas celulares de carcinoma de próstata.

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E.K. agradece el apoyo de la Escuela de Graduados de Bioingeniería (GSB) de la Technische Universität München. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) dentro del Centro de Investigación Colaborativa SFB 824, "Imágenes para la Selección, Monitoreo e Individualización de Terapias contra el Cáncer".

1. Ejemplo de Preparación de la Solución <ol><li> Añadir gadoterato meglumina (GADM, 0.5 mol / L) a ácido concentrado [1- 13 C] pirúvico para dar una concentración final de 1-mmol / L GADM. Añadir tritilo tris radical (8-carboxi-2,2,6,6-tetra- (hidroxietil) -benzo- [1,2-4,5] bis- (1,3) -dithiole-4-il) - sal de sodio y metilo (OX063) a esta mezcla para dar una concentración final de 15 mmol / L. Vortex hasta disolución completa. NOTA: Esta preparación solución madre está diseñado para su uso con un hiperpolarizador preclínica DNP 3.35-T. Cuando se utiliza un hiperpolarizador clínica 7-T, la meglumina gadoterato no es necesario porque, en un campo magnético superior, sus beneficios son insignificantes. La adición de un agente de contraste a base de gadolinio aumenta la polarización de estado sólido alcanzable y también la tasa de polarización. Sin embargo, en el estado líquido, el agente de contraste se acorta el tiempo de relajación T 1. </li></ol> 2. Cultivo El cultivo celular <ol><li cultivan las c pc3 en un frasco de cultivo con>cm-2 Área de crecimiento. Utilice medio F-12K que contiene 10% de suero de ternera fetal (FCS) y mantener las células a 37 ° C en una atmósfera humidificada a 5% de CO 2. Antes de la etapa de disolución, se elimina el medio del matraz de cultivo. NOTA: Cada línea celular requiere un protocolo de preparación particular para la propagación celular. Consulte los requisitos con el proveedor de la línea celular. </li></ol> 3. Preparación de las células para el experimento <ol><li> Retire el medio de las células y se lavan las células con ~ 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). </li><li> Añadir 5 ml de tripsina al matraz y devolver los frascos de cultivo celular a la incubadora durante 3-5 min. </li><li> Añadir ~ 5 ml de medio F-12K para desactivar la tripsina. </li><li> Contar las células usando un contador de células automático. Mezclar 10 l de la solución de células con 10 l de la solución de tinción. Mezclar bien con la pipeta y transferir 10 l de la mezcla en THe cámara de un "vidrio contando". </li><li> Retirar y contar las células en el matraz (s). La transferencia de los volúmenes apropiados que contienen el número deseado de células (por ejemplo, 5 x 10 6 hasta 10 8) en viales de plástico. </li><li> Centrifugar las células a 1200 xg durante 5 min y descartar el sobrenadante. </li><li> Vuelva a suspender las células en el medio F-12K que contiene 10% de FCS a un volumen total de 800 l y transferirlos en un vaso de reacción (2 ml). Coloque el recipiente de reacción en un vial de plástico llena de agua tibia. </li></ol> 4. Disolución Agente Preparación NOTA: El agente de disolución es un líquido que se utiliza para disolver la muestra hiperpolarizado. En aplicaciones biológicas, la disolución se lleva a cabo por lo general con H 2 O o basado en óxido de deuterio (D 2 O) tampones basados, tales como PBS o tris (hidroximetil) aminometano (Tris), que contiene ácido etilendiaminotetraacético 1 g / L (EDTA). <ol><li> PREPARAción de tampón / L de PBS 20 mmol <ol><li> Para preparar 100 ml del agente de disolución, se disuelven 36 mg de fosfato monosódico (NaH 2 PO 4), 247 mg de fosfato disódico (Na 2 HPO 4), y 10 mg de EDTA en una solución de hidróxido / L de sodio 20 mmol ( NaOH) en D2O mezcla adecuadamente hasta su completa disolución. NOTA: EDTA (1 g / L) se añade al tampón para eliminar los posibles iones ferromagnéticos, que puede estropear la hiperpolarización. El NaOH se utiliza para neutralizar el ácido pirúvico en una proporción 1: 1 mol de llegar a un pH de 7,4. </li></ol></li></ol> 5. Temperatura Insertar variable (IVT) El tiempo de reutilización <ol><li> En el programa polarizador ventana principal DNP-RMN, haga clic en "tiempo de reutilización." NOTA: Esto activa la bomba de vacío y evacua el VTI a aproximadamente 5,0 mbar. Posteriormente, la válvula de aguja entre el VTI y el depósito de helio líquido se abre completamente, permitiendo que el helio líquido fluya en el VTI. La velocidad de flujo es regulated por la válvula de aguja para mantener la cantidad óptima de helio líquido en el VTI hasta que alcanza la temperatura de ebullición del helio. A continuación, el VTI se evacua a vacío casi completa, y la temperatura alcanza aproximadamente 1,4 K. La VTI se llena de líquido de helio hasta 65%. En este punto, el instrumento está listo para la inserción de la muestra. </li></ol> 6. Preparación de la muestra e Inserción <ol><li> Usando una micropipeta, añadir ~ 8 l de 13 C-etiquetados de solución de muestra caldo en un vaso de plástico. </li><li> Una el vaso de plástico de la varilla de inserción e iniciar el proceso de inserción de muestra pulsando el botón "Insertar la muestra" en la ventana principal del programa. Seleccione "muestra normal" y haga clic en "Continuar". NOTA: Durante este proceso, la válvula de aguja primero se cierra para interrumpir el flujo de helio líquido en VTI, y la presión en el VTI luego aumenta. El soporte de la muestra dentro de la IFP se eleva desde el helio líquido, la válvula de entradaen la parte superior de la VTI se abre, y un flujo de helio gaseoso se introduce desde la válvula de entrada para evitar la contaminación exterior por la humedad del aire. </li><li> Cuando se le solicite, presione el tubo de inserción con la copa de plástico que hay abajo en la IFP. Asegúrese de que para alcanzar el soporte de la muestra en la parte inferior de la IFP. De lo contrario, el helio gaseoso puede empujar la muestra de la IFP. </li><li> Separar y retirar la varilla de inserción. </li><li> Finalizar el proceso haciendo clic en "Siguiente" en la ventana de diálogo. El procedimiento de inserción de la muestra no debe durar más de 10 s. NOTA: La válvula de entrada se cierra, el flujo de helio gaseoso se interrumpe, el soporte de muestra con la copa de muestra se sumerge en helio líquido, y se abre la válvula de aguja para permitir que el helio líquido fluya en el VTI. Después de 5 a 10 min, el VTI se enfría por debajo de 1,4 K, lo que permite a todos los electrones libres a polarizarse. </li><li> Confirmar que el vaso de plástico con la muestra se introduce correctamente en el VTI marcando tsombrero que no está unido a la varilla de inserción o empujado hacia fuera de la VTI por gas helio. A continuación, haga clic en "Finalizar". </li></ol> 7. Horno de microondas de barrido (opcional) NOTA: Un barrido de microondas permite la determinación de la frecuencia de microondas óptima para maximizar la tasa de hiperpolarización de los 13 C núcleos en el compuesto diana. <ol><li> Para medir el barrido de microondas, inicie el programa RINMR, tipo "HYPERSENSENMR," y haga clic en "Seleccionar Config" y "Do Microsweep." </li><li> Para iniciar el proceso, seleccione la pestaña "calibrar" en la ventana principal del programa. </li><li> Haga clic en "Generar" y elegir la frecuencia de comienzo y final (por ejemplo, 94.100 GHz-94.200 GHz), el incremento de frecuencia (por ejemplo, 20 MHz), la potencia (100 mW), y el tiempo (60 s). Haga clic en "Continuar", "Activar" y "Start". NOTA: Con esta configuración, la primera hiperpolarizadora polariza la muestradurante 60 s usando una frecuencia de microondas de 94.100 GHz y una potencia de 100 mW. A continuación, se aplica un pulso de 90 ° de radio-frecuencia (RF) y adquiere la señal de 13 C hiperpolarizado usando el espectrómetro incorporado. Estos pasos se repiten para cada paso en la gama de frecuencias especificada. Para hiperpolarización posterior, seleccione la frecuencia de microondas con la amplitud de la señal máxima medida. </li></ol> 8. polarización <ol><li> Para medir la acumulación de polarización, inicie el programa RINMR, tipo "HYPERSENSENMR," y haga clic en "Seleccionar Config" y "Sólido Build-up". </li><li> En el programa polarizador ventana principal DNP-RMN, haga clic en "polarización" para iniciar el proceso de hiperpolarización. </li><li> Elija la frecuencia óptima de microondas (obtenido durante el barrido de microondas) y la potencia (por ejemplo, 100 mW) para la muestra y haga clic en "Siguiente". </li><li> Habilitar "acumulación de polarización de vigilancia" y haga clic en "Finalizar". </li><li> Polarizar la muestra a&gt; 95% (~ 60 min para [1- 13 C] piruvato). NOTA: Durante la polarización, las microondas son guiados en el VTI y para la muestra, haciendo que el 13C gira para alinearse con los espines de los electrones no apareados hiperpolarizados. Para medir la acumulación de hiperpolarización, pulsos de RF con un ángulo de flip (FA) de 5 ° se aplican periódicamente (por ejemplo, cada 300 s), y la señal resultante se representa como una curva de acumulación de polarización. </li></ol> 9. Disolución <ol><li> Cuando llega a la polarización&gt; 95%, iniciar el proceso de disolución haciendo clic en "disolución" en el programa polarizador ventana principal DNP-RMN. </li><li> Escoja el proceso de disolución en el menú desplegable y haga clic en "Siguiente". NOTA: El polarizador permite definir el proceso de disolución deseado eligiendo el momento de la persecución de gas. </li><li> Cargar ~ 5 ml de la disolución de agente a través de la válvula de la parte superior en un recipiente calentado en tque parte de disolución del polarizador. Calcular el volumen exacto del agente de disolución es necesario el uso de la ecuación siguiente: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/54751/54751eq1.jpg"> donde V es el volumen DA deseada del agente de disolución, PA m, m OX063, ym Gad son las masas de la piruvato, OX063 y meglumina gadoterato, respectivamente, a la solución de ejemplo stock. </li><li> Coloque la palanca de la disolución en la posición activa por encima de la válvula de entrada. NOTA: Esto permite que el instrumento para conectar su instrumentación disolución de la copa de muestra en el IFP. </li><li> Haga clic en "Finalizar" para iniciar el proceso de disolución. NOTA: El agente de disolución se somete a presión a 3 bar por gas helio y se calienta posteriormente hasta 200 ° C, provocando un aumento en la presión. Cuando la presión alcanza 10 bar, la válvula de aguja se cierra para interrumpir el flujo de helio líquido en el VTI. El soporte de la muestra plantea la copadel helio líquido. El palo de disolución se baja en el VTI y conectado a la copa de muestra. El agente de disolución acondicionado es empujado por la presión, que resulta de la vasija de calentamiento que contiene el tampón de disolución y gas helio, a través de la palanca de la disolución a la taza, causando una rápida disolución de la muestra. La solución fluye entonces hacia fuera en el matraz de recogida a través de un tubo de plástico. El palo de disolución con la copa adjunto se eleva entonces a partir de la IFP. </li><li> Mover el palo de la disolución con la copa unido a la posición de "limpieza" y terminar el proceso haciendo clic en "Finalizar". </li></ol> 10. La detección de la 13 C hiperpolarizado Señal <ol><li> 13 C espectroscopia de resonancia magnética metabólica in vitro <ol><li> Mezclar 200 l de la / L disuelto muestra hiperpolarizado 20-mmol desde el matraz de recogida con 800 l de la solución de células. NOTA: La concentración final resultantede [1- 13 C] piruvato es 4 mmol / L. </li><li> Mezclar bien la suspensión utilizando una micropipeta y la transferencia de ~ 600 l en un tubo de RMN de 5 mm. </li><li> Insertar el tubo de RMN de 5 mm en el espectrómetro de RMN 1-T. En la ventana principal del programa, haga clic en "Ejecutar" para iniciar la medición, la aplicación de serie de un centenar de 10 ° pulsos de RF cada 3 s. NOTA: medir el tiempo entre la mezcla inicial de la muestra hiperpolarizado con las células y el comienzo de la adquisición espectroscópico. Asegúrese de que el procedimiento de mezcla no exceda de 30 s para minimizar la pérdida de polarización. </li></ol></li><li> Resonancia magnética metabólico 13 C <ol><li> Para construir un contenedor para los experimentos in vitro utilizando el espectrómetro de resonancia magnética, tomar una jeringa de 5 ml y conectarlo a un catéter (d = 1,2 mm) que es lo suficientemente largo para llegar a partir de iso-centro del espectrómetro al área accesible de la espectrómetro. </li><li> Llene el recipiente in vitro con THsolución de células e de la concentración deseada para el experimento (por ejemplo, 10 8) o con una solución enzimática. </li><li> Colocar un recipiente in vitro en el isocentro del imán IRM. Colocar una bobina de receptor de radiofrecuencia sintonizado-C 13 en el envase. Coloque un concentrado de 13 C-etiquetados de calibración fantasma (por ejemplo, de 10 mol / L 13 C-urea) cercano. </li><li> Inserte el "contenedor in vitro", cerca de la iso-centro del escáner de RMN. </li><li> Ejecutar secuencia de localización en 3 planos estándar del escáner y ajustar la posición del contenedor in vitro para el iso-centro, según sea necesario. </li><li> Ejecutar una secuencia ponderada en T2 1 H "anatómica" que cubre el recipiente en la localización in vitro. Utilice los siguientes parámetros: spin eco 2D con orientación axial, tiempo de repetición (TR) = 2.000 ms, tiempo de eco (TE) = 20 ms, rebanada de espesor = 1 mm, campo de visión que cubre el recipiente in vitro, y16 ecos por excitación. Asegúrese de que calce campo se realiza en protones durante este paso. </li><li> En las imágenes anatómicas, seleccionar 5 cortes contiguos se centraron en la región de interés. Prescribir una adquisición de calibración espectroscópico 13 C cubriendo los cortes anatómicos seleccionados. Utilice los siguientes parámetros: secuencia de calibración 2D Bloque-Siegert con orientación axial 12 x 12 centrada en codificado, TR = 1,000 ms, grosor de corte = 5 mm, el campo de juego de la visión imágenes anatómicas, número de exploraciones (NS) = 64, el ancho de banda = 5,000 Hz, y FA = 90 °. </li><li> Seleccione la secuencia de calibración de espectroscopia de 13C (para más información, véase Schulte et al., 2011) 75 de la biblioteca de secuencia de pulsos. Descargar la secuencia de pulsos al escáner desde el ordenador haciendo clic en "Descargar". Haga clic en "Spectra Prescan" para ejecutar el pre-escaneo espectroscópica. En la gráfica de la magnitud del espectro, ajustar el pico del cuerpo de calibración 13 C al center de la frecuencia de escáner. Ajustar la ganancia del receptor al máximo. Haga clic en "Inicio" para ejecutar la secuencia de calibración de espectroscopia 13C. Tenga en cuenta la ganancia de transmisión y la frecuencia reportado céntrica. </li><li> Establecer una adquisición de imágenes 13 C desplazamiento químico (CSI), que cubre los cortes anatómicos seleccionados. Utilice los siguientes parámetros: 2D eco-planar espectroscópica de imágenes (EPSI) con orientación axial 12 x 12 centrada en codificado, TR = 400 ms, grosor de corte = 5 mm, el campo de juego de la visión imágenes anatómicas, NS = 300, y el ancho de banda = 5.000 Hz . NOTA: Las muestras de EPSI una sola línea en el espacio k en varias ocasiones después de una excitación de RF para adquirir tanto la información espacial y espectral simultáneamente. Para obtener más información acerca de las técnicas de adquisición, véase el artículo de Durst et al. 2015 76. </li><li> Descargar la secuencia C CSI 13 y ejecute el pre-escaneo espectroscópica. Ajustar la frecuencia del escáner y transmitir la ganancia según lo especificado por la secuencia de calibraciónsalida. </li><li> Después de la solución hiperpolarizado se deposita en el matraz de recogida, elaboración de ~ 3 ml con una jeringa y luego inyectarla en el catéter conectado al recipiente in vitro. Iniciar la adquisición. Después de la adquisición se haya completado, guardar el archivo de datos brutos para la reconstrucción posterior. </li></ol></li></ol> 11. Los datos Reconstrucción <ol><li> Aplicar uno de los dos modelos cinéticos descritos para analizar los datos adquiridos. <ol><li> En el primer método para describir la cinética de LDH, valor cinética (k), comparar la suma de la señal de lactato (M LAC) a la señal de todas las moléculas hiperpolarizados (M x) 21,77. <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/54751/54751eq2.jpg"></li><li> En el otro método, medir el lactato y piruvato señales en el tiempo y montarlas a un modelo 17,25,71 cinética. Para resolver el tipo de cambio metabólico, PA k → ALC, y la efectivatasa de caída de la señal de lactato, r ALC, utilizar las siguientes ecuaciones diferenciales lineales utilizando el modelo de cambio diferencial de dos sitios, produciendo para el lactato: <img alt="Ecuación 3" src="/files/ftp_upload/54751/54751eq3.jpg"></li></ol></li></ol> Nota: La señal de lactato velocidad de desintegración r ALC efectiva depende del tiempo de relajación longitudinal lactato (T1, LAC), el tipo de cambio metabólico opuesta a partir de lactato a piruvato k ALC → PA, el FA aplicada y TR, y la intensidad de la señal de piruvato (M PA) y lactato (M LAC), teniendo en cuenta la reducción de la señal irreversible después de cada excitación sucesiva: <img alt="Ecuación 4" src="/files/ftp_upload/54751/54751eq4.jpg"> Por lo tanto, r ALC se traduce en un solo término, inseparable de la caída de la señal. Dado que es posible para corregir tque flip ángulo y el tiempo de repetición, ya pesar de que hay un flujo ALC → PA, se supone que el tipo de cambio a partir de lactato a piruvato (k ALC → PA) no tiene que ser incluido en el cálculo, basado en los resultados de Harrison et al. 2012 78. Sus resultados muestran que el ALC k → PA no juega un papel tan crucial como es de suponer. Este modo permite que el tiempo de relajación T1 de lactato a cuantificarse. Este modelo es independiente de la administración de piruvato a la medición, el cual, en el caso de los experimentos in vitro, no es crucial y se puede descuidar. Lo hace, sin embargo, juegan un papel importante para las mediciones in vivo 79.

Rolf F. Schulte y Marion I. Menzel trabajan en GE Global Research.

13 CMRSI con sondas hiperpolarizados es un método prometedor para controlar el metabolismo en tiempo real in vitro e in vivo. Un aspecto muy importante cuando se emplea este proceso experimental es la estandarización adecuada, especialmente en relación con los experimentos in vitro. En primer lugar, la preparación de la muestra que hay que hacer correctamente y consistentemente para lograr la misma concentración de material hiperpolarizado en cada experimento. Esto requiere...

Actualmente, el método clínico más ampliamente utilizado para la estadificación del tumor, nueva puesta en escena, la supervisión la respuesta al tratamiento, y la detección de la recurrencia de una amplia variedad de cánceres es [18F] FDG PET. 1 Sin embargo, recientemente, han surgido varios nuevos enfoques y alternativas. Uno de esos métodos es 13 CMRSI. Esta técnica consiste en la introducción de la molécula de C-13 en una muestra biológica, seguido de MRI mínimamente invasivo para evaluar el metabolismo in vitro o in vivo en tiempo real. Sin embargo, el mayor reto de 13 CMRSI, en comparación con los otros métodos tales como [18 F] FDG PET o tomografía computarizada, es su baja relación señal-ruido. La señal de RMN es directamente proporcional al nivel de polarización, una proporción de la diferencia de población espín ½ núcleos en dos estados de energía de la población total (Figura 1A). La polarización es un producto de THrelación e giromagnética (γ) de los núcleos y la intensidad del campo magnético aplicado encima de la temperatura. Una polarización típico de 1 H núcleos es del orden de 0,001% a 0,005% a 3 T, lo que da una relativamente pobre relación señal-ruido. RM de hoy el estado de la técnica ha sido un método de imagen éxito sólo debido a la gran abundancia de 1H en muestras biológicas y la alta relación giromagnética de 1H (1H gamma = 42,576 MHz / T). Sin embargo, la observación de otros núcleos, tales como el carbono, es más exigente. El único isótopo de carbono estable magnéticamente activa, 13C, representa sólo el 1,1% de todos los átomos de carbono. Además, la relación giromagnética de 13 C (γ 13C = 10,705 MHz / T) es cuatro veces menor que la de 1 H, dando lugar a una eficiencia de detección inferior. En resumen, la baja abundancia de 13C y 13C bajo γ causan mediciones térmicas 13 C para alcanzar 0,0176% de la sensibilidad de un 1Medición H-NMR in vivo. La polarización nuclear dinámica Un método para superar la relativamente pobre sensibilidad de 13 mediciones C es DNP. Fue descrito originalmente para metales en 1953 por Albert W. Overhauser. En su artículo, declaró: "Se demuestra que si se satura la resonancia de espín electrónico de los electrones de conducción, los núcleos se polarizan en el mismo grado que serían si su relación giromagnética eran la del espín del electrón." 2 más adelante ese año, Carver y Slichter confirmó experimentalmente la hipótesis 3 de Overhauser. En 1958, Abragam y Procter describen este efecto para los electrones en los líquidos y la llamó el "efecto sólido." A temperaturas inferiores a 4 K, la polarización de espín electrónico alcanza casi el 100% y es más de tres órdenes de magnitud más alta que la polarización de espín nuclear (Figura 1B) 4. Tsu se produce porque la relación giromagnética del electrón (γ e = 28024.944 MHz / T) es tres órdenes de magnitud más alta que las proporciones giromagnéticas nucleares. Las interacciones débiles entre los electrones y los núcleos, tales como el efecto Overhauser, el efecto sólido, el efecto cruz, y el efecto de mezclado térmico, permiten la transferencia de polarización a partir de electrones hace girar a espines nucleares usando irradiación de microondas con una frecuencia cercana a la de electrones correspondiente resonancia paramagnética (EPR) 5,6 frecuencia. DNP teoría ha sido desarrollada para involucrar a más electrones y la mezcla térmica. Sin embargo, hasta la fecha, no unificada descripción teórica cuantitativa de DNP ha sido publicada 7,8. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54751/54751fig1.jpg"> Figura 1: comprensión dinámica de polarización nuclear y hiperpolarización. A) Una comparación esquemática de la población de centrifugadoen el estado de equilibrio térmico y la polarización del estado hiperpolarizado. B) La polarización depende de la temperatura. La polarización de un electrón (e -) alcanza 100% por debajo de 1,4 K. El DNP permite la transferencia de la polarización de la e- a los 13 núcleos de C, lo que aumenta su polarización de hasta 10 5 -fold. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54751/54751fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Para introducir DNP en los estudios de sistemas biológicos usando 13C, la posterior disolución rápida de la muestra tuvo que ser desarrollado. 50 años después de la hipótesis de Overhauser, Jan H. Ardenkjaer-Larsen et al. resuelto el problema técnicamente difícil de llevar la muestra congelada hiperpolarizado en el estado líquido con una pérdida mínima de hiperpolarización 6. Disolución DNP abre un nuevo campo de investigación llamado 13 CMRSI, proporcionando un nuevo método para investigar y caracterizar diversos estados de enfermedad 9,10. Como excipientes estables de un electrón no apareado, un tris radical tritilo (8-carboxi-2,2,6,6-tetra- (hidroxietil) -benzo- [1,2-4,5] bis- (1,3) -dithiole-4-il) metil sal de sodio (OX063) o (2,2,6,6-tetrametil-piperidin-1-il) oxilo (TEMPO) se utiliza por lo general. Estos se mezclan con la 13 molécula de C marcado deseado y se expusieron a irradiación de microondas con una frecuencia cercana a la frecuencia EPR correspondiente. Usando esta técnica, la polarización de los núcleos 13 C se puede aumentar hasta 37% 11. Esto se traduce en una mejora de la polarización -fold 10 5 en comparación con la polarización de equilibrio térmico 11,12. Sin embargo, tan pronto como la irradiación con microondas se detiene y / o el C-molécula 13 se transfiere al estado líquido, la polarización decae con el tiempo de relajación longitudinal (T 1) del núcleo 13 C que se polariza. Por lo tanto, lainvención de técnicas de disolución rápida o cualquier técnica posterior acortar el tiempo antes de la medición experimental (es decir, inyección) es crucial para aplicaciones biológicas 13. Hay tres principales requisitos que la molécula candidata necesita para cumplir con éxito de 13 estudios CMRSI. En primer lugar, el núcleo 13 C de interés tiene que tener un tiempo suficientemente largo T 1 (&gt; 10 s). La elección de la etiqueta C-13 es crucial. Los mejores candidatos son núcleos de átomos de carbono que no tienen contacto directo con 1-H núcleos través de un enlace. También necesita ser metabolizado rápidamente dentro de 2 - 3 veces T 1, dando como resultado un producto metabólico corriente abajo con un desplazamiento químico significativamente diferente de la sustancia original. La mezcla de la muestra también debe formar un vidrio amorfo cuando está en un estado sólido de modo que la distribución espacial disminuye la distancia entre el electrón y 13 C, permitiendo que el transfer de polarización. Si la molécula candidata no forma vidrio amorfo de forma natural, que tiene que ser altamente soluble en un agente de acristalado, tal como glicerol o sulfóxido de dimetilo 14. Estos requisitos dan como resultado un número relativamente pequeño de moléculas candidatas. Sin embargo, incluso después del descubrimiento con éxito de una molécula adecuada, el desarrollo de un protocolo de trabajo para la hiperpolarización puede ser técnicamente difícil 9,14,15. En los últimos años, varios sustratos han sido exitosamente polarizado, tales como [1- 13 C] piruvato 12,16 - 36, [2- 13 C] piruvato 37, [1- 13 C] piruvato de etilo 38, [1- 13 C ] lactato 39, [1- 13 C] fumarato 40 - 43, 13, C-bicarbonato de 36,44,45, [1- 13 C] acetato de sodio 43,46 - 49, 13 C-urea 6,36,50,51 , [5- 13 C] glutamine 15,52,53, [1- 13 C] glutamato 53,54, [1- 13 C] 2-oxoglutarato 55, [1- 13 C] alanina, y otros 14,56. Un sustrato particularmente interesante y de uso general para la hiperpolarización es [1- 13 C] piruvato. Es ampliamente utilizado en estudios preclínicos para investigar la energía metabolismo celular en diversas enfermedades 14,17,22. [1- 13 C] piruvato cumple con todos los requisitos para la hiperpolarización éxito, incluyendo un transporte relativamente largo T 1 y rápida a través de la membrana celular antes de ser metabolizados posteriormente. Los estudios preclínicos con piruvato [1- 13 C] Actualmente se están traduciendo en la clínica 57. El metabolismo de piruvato Es bien sabido que hay una relación directa entre las mutaciones en el ADN y los cambios en sus vías metabólicas de un cáncer de células. Ya en la década de 1920, Otto Warburg descuEred que hay un aumento del metabolismo de la glucosa y la producción de lactato en los tumores en comparación con tejido sano 58-60. Posteriormente, diversas alteraciones en otras vías metabólicas, tales como la vía de las pentosas fosfato, el ciclo del ácido tricarboxílico, la fosforilación oxidativa, y la síntesis de nucleótidos y lípidos, se han descrito. El piruvato es el producto final de la glicólisis. En el tumor, se somete a la glucólisis anaeróbica catalizada por la LDH 61 y reacciona con la forma reducida del dinucleótido de adenina nicotinamida coenzima (NADH), dando como resultado lactato y la forma oxidada de la coenzima (NAD +). Alternativamente, el piruvato se somete a una reacción de transaminación con glutamato para formar alanina, catalizada por la alanina transaminasa (ALT). Ambas reacciones son fácilmente reversible. El piruvato también se somete a descarboxilación catalizada por la piruvato deshidrogenasa (PDH) en dióxido de carbono y acetil-CoA, rREPRESENTAN una reacción irreversible en este paso. Alternancias en estas velocidades de reacción pueden estar relacionados con el metabolismo del tumor 17,21,22,25,62. Las vías metabólicas se resumen en la Figura 2. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54751/54751fig1.jpg"> Figura 2: Esquema de la importante reacción metabólica del piruvato. Piruvato de conversión / lactato es catalizada por la LDH, y la conversión de piruvato / alanina es catalizada por la ALT. El piruvato se convierte irreversiblemente a acetil-CoA y CO 2 por PDH, y CO 2 se encuentra en un equilibrio dependiente del pH con bicarbonato de 80. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54751/54751fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> La detección de hiperpolarizado [1- 13 C] piruvato y sus metabolitos se ha demostrado previamente en la rata élarte 37,63 - 65, 66 de hígado, músculo y riñón 62,67. Un estudio demostró diferencias significativas en la proporción de lactato-alanina entre el hígado de rata normal y ayunaron 66 y demostró un nivel muy elevado de lactato hiperpolarizado y [1- 13 C] en el cáncer de hígado 68,69. Hay pruebas de que el grado del tumor se puede identificar en un adenocarcinoma transgénico de próstata de ratón (TRAMP) utilizando hiperpolarizado piruvato [1- 13 C] 22, con los niveles de lactato hiperpolarizados que muestran una alta correlación con el grado histológico de los tumores extirpados. La alanina catalizada a partir de piruvato por ALT también se ha sugerido como un marcador útil en la rata carcinoma hepatocelular 23. La medición de la flujo metabólico piruvato-lactato se ha utilizado para el control de isquemia 63,65,70 y como respuesta al tratamiento con fármacos citotóxicos quimioterapia 17,40, dirigidos &lt;sup&gt; 24,25,41, 26 o radioterapia en modelos animales. También se ha utilizado para la detección del inhibidor LY294002 respuesta fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) en el glioblastoma y el cáncer de mama modelos de ratón 25. Los cambios en el metabolismo del piruvato en tumores cerebrales 26 y cáncer de próstata 24,71 también se han observado después del tratamiento. Carcinoma de próstata El carcinoma de próstata es el cáncer predominante en hombres de edad avanzada y el segundo cáncer más importantes relacionados con la muerte en los hombres en todo el mundo 72. Hasta la fecha, no existen métodos fiables y no invasivas están disponibles para el diagnóstico precoz y la caracterización de cáncer de próstata 73,74, haciendo hincapié en la necesidad urgente de nuevas técnicas de imagen metabólica para permitir la detección rigurosa y la estadificación de los pacientes. Carcinoma de próstata se utilizó como modelo para demostrar las posibilidades de DNP disolución combinados con 13 CMRSI en pacientes 57. Este trabajo fue continuado en un primer ensayo clínico que emplea [1- 13 C] piruvato y 13 CMRSI para la obtención de imágenes de cáncer de próstata, y ha recientemente se ha completado (NCT01229618). La motivación detrás de este trabajo era ilustrar con más detalle y para un público más amplio de la aplicación del método CMRSI 13 en un entorno preclínico con las células. La medición del metabolismo de la LDH-catalizada de [1- 13 C] piruvato a [1- 13 C] lactato in vitro en la línea celular de carcinoma de próstata PC3, se demuestra la posible aplicación de DNP disolución en estudios in vitro y la dirección de los pasos cruciales y desafíos durante los experimentos.

<table><tbody><tr><td>HyperSense DNP Polariser</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>3.35 T preclínico Hiperpolarizador DNP</td></tr><tr><td>GE/Agilent MR901</td><td>GE Healthcare/Agilent Technologies</td><td></td><td>Escáner de resonancia magnética preclínica 7 T, con diámetro pequeño diseñado para experimentos con roedores</td></tr><tr>Espectrómetro de RMN<td>Spinsolve Carbon</td><td>Magritek</td><td></td><td>1 T con imán permanente</td></tr><tr><td>Óxido de deuterio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monbasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>Edetato disódico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>Ácido pirúvico - 13C1</td><td>Cambridge Isotopes Laboratories</td><td>CLM-8077-1</td><td></td></tr><tr><td>Dotarem (0,5 mmol/L)</td>Gadoterato <td>de Guerbet</td><td></td><td>meglumina&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Tris (8-carboxi-2,2,6,6-tetra-(hidroxietil)-benzo-[1,2&ndash; 4,5]-bis-(1,3)-ditiol-4-il)-metil sodio sal (OX063)</td><td>GE Healthcare radical</td><td></td><td>de tritilo utilizado como fuente de electrón libre</td></tr><tr><td>PC3 línea celular</td><td>ATCC</td><td>CRL1435</td><td></td></tr><tr><td>medio F-12K&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>ATCC</td><td>SCRR-30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA, 1x</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de plástico de muestra</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013-MSDS</td><td></td></tr></tbody></table>

hiperpolarizado 13 c metabólico espectroscopía de resonancia magnética e imagen

Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

En las últimas décadas, los nuevos métodos para la estadificación del tumor, nueva puesta en escena, la supervisión la respuesta al tratamiento, y la detección de la recurrencia de una variedad de cánceres han surgido en relación con la tomografía por emisión de positrones estado de la técnica con 18 F-FDG ([18F ] FDG PET). 13 C resonancia magnética espectroscópica (13 CMRSI) es un método de formación de imágenes mínimamente invasiva que permite la supervisión del metabolismo in vivo y en tiempo real. Al igual que con cualquier otro método basado en 13 C de resonancia magnética nuclear (RMN), se enfrenta al reto de baja polarización térmica y una posterior baja relación señal-ruido debido a la relativamente baja relación giromagnética de 13 C y su baja abundancia natural en muestras biológicas. Al superar estas limitaciones, la polarización nuclear dinámica (DNP) con la posterior disolución de la muestra ha permitido recientemente utilizada sistemas de imagen de resonancia magnética (MRI) de RMN y para medir, El estudio y la imagen vías metabólicas clave en diversos sistemas biológicos. Una molécula particularmente interesante y prometedora utilizado en 13 CMRSI es [1- 13 C] piruvato, que, en los últimos diez años, ha sido ampliamente utilizado para in vitro, preclínica, y, más recientemente, los estudios clínicos para investigar el metabolismo de la energía celular en el cáncer y otras enfermedades. En este artículo, se describe la técnica de disolución DNP usando un preclínica hiperpolarizadora DNP 3,35 T y demostrar su uso en estudios in vitro. Un protocolo similar para la hiperpolarización se puede aplicar en su mayor parte en estudios in vivo también. Para ello, se utilizó lactato deshidrogenasa (LDH) y la reacción catalizada metabólica de [1- 13 C] piruvato a lactato [1- 13 C] en una línea celular de carcinoma de próstata, PC3, in vitro utilizando 13 CMRSI.

Los resultados del "barrido de microondas" se ilustran en la Figura 3. Se muestra que la frecuencia de microondas óptima para el [1- 13 C] muestra piruvato es en 94,156 GHz para el local de hiperpolarizador 3,35-T. Todos siguiente experimento hiperpolarización (n = 14) se realizaron con esta frecuencia de microondas con una potencia de 100 mW. La irradiación de microondas se aplicó durante 60 a 80 min, lo que lleva a una hiperpolarización de estado sólido mayor que 90%. Los resultados se pres...

La polarización nuclear dinámica con la posterior disolución de la muestra ha permitido estudios en tiempo real del metabolismo en sistemas biológicos. Se utilizó piruvato hiperpolarizado [1-13C] para estudiar la actividad de la lactato deshidrogenasa en una línea celular de carcinoma de próstata in vitro.

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In the past decades, new methods for tumor staging, restaging, treatment response monitoring, and recurrence detection of a variety of cancers have ...

El objetivo general de este procedimiento es hiperpolarizar moléculas marcadas con carbono 13 utilizando polarización nuclear dinámica, y medir su conversión enzimática utilizando resonancia magnética de carbono 13, imágenes retroscópicas, in vitro. Este método aumenta la señal de resonancia del carbono entre 10.000 y 100.000 veces, lo que permite distinguir los compuestos en capas de sus productos metabólicos y localizarlos en el cuerpo mediante imágenes. La principal ventaja de este método, en comparación con, por ejemplo, las técnicas de realidad virtual, es que proporciona una vista del metabolismo de las sustancias que ocurren naturalmente en los organismos vivos en tiempo real.Además, este método puede proporcionar información sobre el metabolismo del cáncer y tal como es in vitro. También se puede aplicar a modelos animales y pacientes humanos. La aplicación de esta técnica supera la localización tumoral.Se puede utilizar para encontrar y distinguir subtipos de tumores metabólicos y para monitorear el tratamiento junto con técnicas de vanguardia. Para comenzar el procedimiento, primero prepare una solución de un milimolar de meglumina gadoterato y piruvato concentrado de un carbono 13. Agregue el radical tritilo OX063 a la mezcla para lograr una concentración final de 15 milimolares y disuélvalo por completo.En el software DNP Polarizer, haga clic en Enfriar'para disminuir la temperatura del inserto de temperatura variable, o VTI, por debajo de 1,4 kelvin. Una vez que el VTI se haya enfriado, coloque unos ocho microlitros de la solución de muestra marcada con carbono 13 en un recipiente de plástico para muestras. Coloque la copa en la varilla de inserción de muestras.En el software, haga clic en Insertar muestra 'Seleccionar muestra normal' y luego en Siguiente 'Esto eleva el soporte de muestra y abre las válvulas de entrada al VTI, lo que permite la inserción de muestras. Cuando se le solicite, utilice la varilla de inserción para empujar el recipiente de muestra en el VTI. Separe el vaso de muestra y retire con cuidado la varilla de inserción.Confirme que la muestra se separó de la varilla y no fue empujada fuera del VTI durante el procedimiento de cierre. Haga clic en Siguiente'para cerrar las válvulas y bajar la taza de muestra al helio líquido, y luego haga clic en Finalizar'Para encontrar una frecuencia de polarización óptima, primero inicie el software RINMR. En la pantalla de configuración, haga clic en Seleccionar muestra' y Hacer micro barrido 'Cree el archivo donde se almacenarán los datos.Vuelva al software DNP Polarizer. Seleccione la pestaña Calibrar', establezca los parámetros de barrido de microondas y, a continuación, inicie el proceso de barrido de microondas. Una vez finalizado el barrido de microondas, observe la frecuencia con una amplitud de señal máxima medida.Regrese al software RINMR y seleccione Acumulación sólida'Luego, en el software DNP Polarizer, haga clic en Polarización'Ingrese la frecuencia de microondas óptima y la potencia. Haga clic en Siguiente 'Habilitar monitoreo de acumulación de polarización' y haga clic en Finalizar 'Polarizar la muestra durante un período de tiempo suficiente para lograr una polarización superior al 95%. Durante la polarización, conecte un matraz de recolección al tubo de escape de la muestra del hiperpolarizador y colóquelo cerca del espectrómetro.Configure un espectrómetro de RMN de un tesla con la serie de escaneo de 13 carbonos de pulsos de RF de 110 grados a intervalos de tres segundos. Durante la polarización del piruvato, comience la preparación del cultivo celular. Retire el medio celular de los matraces de cultivo celular.Lave las células con unos 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato. Añadir cinco mililitros de tripsina al matraz de cultivo. Incubar el cultivo durante tres a cinco minutos a 37 grados centígrados, y luego desactivar la tripsina con unos cinco mililitros de medio F12K que contenga un 10% de suero fetal de ternero por volumen.Luego, transfiera el volumen de suspensión celular que contiene el número deseado de celdas a un tubo de centrífuga de plástico. Centrifugar la muestra de células a 1200 G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el palet en un medio F12K suficiente con 10%FCS para lograr un volumen final de 800 microlitros.Transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y coloque el tubo en un recipiente de plástico lleno de agua tibia. Para comenzar la recopilación de datos a través de la espectroscopia de resonancia magnética de carbono 13, una vez que la muestra de célula esté preparada y la polarización del piruvato sea superior al 95 por ciento, haga clic en Ejecutar disolución en el software DNP Polarizer. Cargue el volumen medido de agente de disolución a través de la válvula superior de la cámara de disolución.Mueva la varilla de disolución a la posición activa. Confirme haciendo clic en Siguiente'Una vez que la muestra de células esté lista para el experimento, haga clic en Finalizar' en el software DNP Polarizer para iniciar el proceso de disolución. Espere hasta que finalice el proceso de disolución.Agregue 200 microlitros de la solución de piruvato hiperpolarizado a 800 microlitros de la muestra de células. Mezcle bien con una pipeta y luego coloque unos 600 microlitros de la mezcla en un tubo de RMN de cinco milímetros. Cargue el tubo de RMN en el espectrómetro y haga clic en Ejecutar'para iniciar la medición.A continuación, mueva la varilla de disolución con el vaso de muestra adjunto a la posición de limpieza y haga clic en Finalizar'en el software DNP Polarizer. Para comenzar la resonancia magnética de carbono 13, después de comenzar el proceso de hiperpolarización, transfiera 800 microlitros de muestra de células resuspendidas con un número de células de al menos 10 al octavo a una jeringa de tres mililitros. Conecte la jeringa a un catéter largo y coloque la jeringa en una cama de resonancia magnética.Asegúrese de que el catéter sea lo suficientemente largo como para llegar fuera del escáner de resonancia magnética. Coloque un maniquí de calibración, que contenga urea de carbono 13 molar con 10% de meglumina gadoterate junto a la jeringa. Coloque una bobina receptora de RF de carbono 13 sintonizada en la jeringa.Inserte la cama de exploración en el escáner de modo que el objeto de interés esté en el isocentro del escáner de resonancia magnética. Conecte el matraz de conexión al tubo de escape de la muestra del hiperpolarizador y colóquelo cerca del extremo del catéter. Ejecute una secuencia de localización estándar de tres planos y ajuste la posición de la jeringa si es necesario.A continuación, configure y ejecute una secuencia anatómica ponderada en T2 de protones que cubra la localización de la jeringa. A partir de las imágenes anatómicas resultantes, seleccione cinco cortes continuos de la región de interés, incluido el maniquí de carbono 13. Configure una adquisición de calibración espectroscópica de carbono 13 y seleccione la secuencia de calibración de siegert de bloques 2D de la biblioteca de secuencias de pulsos.Descargue la secuencia de pulsos en el escáner y ejecute un preescaneo espectroscópico. En la gráfica de magnitud del espectro, establezca el pico fantasma de calibración de carbono 13 en el centro de la frecuencia del escáner. Ajuste las ganancias del receptor al máximo y haga clic en Escanear'para ejecutar la secuencia de calibración.Registre la ganancia de transmisión y la frecuencia céntrica informadas. A continuación, configure una adquisición de imágenes de desplazamiento químico de carbono 13 para los cortes anatómicos elegidos. Elija la secuencia de imágenes espectroscópicas ecoplanares 2D y descargue la secuencia de pulsos en el escáner.Ejecute el preescaneo espectroscópico y ajuste la frecuencia céntrica y la ganancia de transmisión en función de los valores de calibración para terminar de configurar el espectrómetro de resonancia magnética. Una vez que el piruvato alcance el 95% de polarización, haga clic en Ejecutar disolución 'en el software DNP Polarizer y cargue el agente de disolución. Mueva la varilla de disolución a la posición activa.Haga clic en Siguiente'y luego Finalizar'Cuando la muestra hiperpolarizada disuelta llegue al matraz de recolección, extraiga aproximadamente 1 mililitro de la solución hiperpolarizada en una jeringa e inyéctela en el catéter para que 200 microlitros alcancen la muestra celular. Haga clic en Escanearpara iniciar la adquisición de los datos experimentales. Una vez finalizada la recopilación de datos, mueva la varilla de disolución con el vaso de muestra adjunto a la posición de limpieza y haga clic en Finalizar en el software DNP NMR.La tasa de intercambio metabólico de piruvato a lactato se estudió en células de carcinoma de próstata PC3 mediante el seguimiento de las intensidades de la señal de espectroscopia de RMN de carbono 13 de lactato hiperpolarizado y piruvato con respecto a la frecuencia y el tiempo. Los valores cinéticos de lactato se evaluaron mediante un modelo de razón simple y mediante un modelo diferencial de intercambio de dos sitios, y se normalizaron al número de células. En ambos modelos, se observó una tendencia a la disminución de la producción de lactato con un número creciente de células.Esto se atribuye a concentraciones celulares más altas y a una mayor viscosidad de la muestra. Las muestras con recuentos de células inferiores a dos veces diez a siete muestran una relación señal de lactato muy pequeña con respecto al ruido y, por lo tanto, grandes valores de desviación estándar, lo que indica que las muestras deben contener al menos ese número de células para obtener datos informativos. La localización espacial se logró con resonancia magnética con una buena resolución espectral, lo que permitió adquirir imágenes de carbono 13 para regiones de frecuencia específicas.La distribución espacial se determinó a partir de los datos brutos. La imagen de carbono 13 también podría registrarse conjuntamente con la imagen de protones adquirida anteriormente. Una vez dominado y realizado correctamente, este experimento se puede realizar en menos de 60 minutos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una hiperpolarización de una molécula deseada utilizando la técnica de polarización nuclear dinámica y cómo hacer experimentos simples de espectroscopia de RMN e imágenes celulares. Al intentar este procedimiento, es importante ser muy rápido. Después de que la muestra hiperpolarizada salga del polarizador, recuerde que pierde toda la señal de RMN obtenida en menos de dos minutos.En conclusión, el DNP de disolución se puede utilizar para una variedad de aplicaciones. Esto incluye el estudio de enfermedades como la diabetes, o la observación de los cambios metabólicos de varios tipos de cáncer, pero también la medición del pH de los tejidos.

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