hiperpolarizado ¹³ C metabólico espectroscopía de resonancia magnética e Imagen

El objetivo general de este procedimiento es hiperpolarizar moléculas marcadas con carbono 13 utilizando polarización nuclear dinámica, y medir su conversión enzimática utilizando resonancia magnética de carbono 13, imágenes retroscópicas, in vitro. Este método aumenta la señal de resonancia del carbono entre 10.000 y 100.000 veces, lo que permite distinguir los compuestos en capas de sus productos metabólicos y localizarlos en el cuerpo mediante imágenes. La principal ventaja de este método, en comparación con, por ejemplo, las técnicas de realidad virtual, es que proporciona una vista del metabolismo de las sustancias que ocurren naturalmente en los organismos vivos en tiempo real.

Además, este método puede proporcionar información sobre el metabolismo del cáncer y tal como es in vitro. También se puede aplicar a modelos animales y pacientes humanos. La aplicación de esta técnica supera la localización tumoral.

Se puede utilizar para encontrar y distinguir subtipos de tumores metabólicos y para monitorear el tratamiento junto con técnicas de vanguardia. Para comenzar el procedimiento, primero prepare una solución de un milimolar de meglumina gadoterato y piruvato concentrado de un carbono 13. Agregue el radical tritilo OX063 a la mezcla para lograr una concentración final de 15 milimolares y disuélvalo por completo.

En el software DNP Polarizer, haga clic en Enfriar'para disminuir la temperatura del inserto de temperatura variable, o VTI, por debajo de 1,4 kelvin. Una vez que el VTI se haya enfriado, coloque unos ocho microlitros de la solución de muestra marcada con carbono 13 en un recipiente de plástico para muestras. Coloque la copa en la varilla de inserción de muestras.

En el software, haga clic en Insertar muestra 'Seleccionar muestra normal' y luego en Siguiente 'Esto eleva el soporte de muestra y abre las válvulas de entrada al VTI, lo que permite la inserción de muestras. Cuando se le solicite, utilice la varilla de inserción para empujar el recipiente de muestra en el VTI. Separe el vaso de muestra y retire con cuidado la varilla de inserción.

Confirme que la muestra se separó de la varilla y no fue empujada fuera del VTI durante el procedimiento de cierre. Haga clic en Siguiente'para cerrar las válvulas y bajar la taza de muestra al helio líquido, y luego haga clic en Finalizar'Para encontrar una frecuencia de polarización óptima, primero inicie el software RINMR. En la pantalla de configuración, haga clic en Seleccionar muestra' y Hacer micro barrido 'Cree el archivo donde se almacenarán los datos.

Vuelva al software DNP Polarizer. Seleccione la pestaña Calibrar', establezca los parámetros de barrido de microondas y, a continuación, inicie el proceso de barrido de microondas. Una vez finalizado el barrido de microondas, observe la frecuencia con una amplitud de señal máxima medida.

Regrese al software RINMR y seleccione Acumulación sólida'Luego, en el software DNP Polarizer, haga clic en Polarización'Ingrese la frecuencia de microondas óptima y la potencia. Haga clic en Siguiente 'Habilitar monitoreo de acumulación de polarización' y haga clic en Finalizar 'Polarizar la muestra durante un período de tiempo suficiente para lograr una polarización superior al 95%. Durante la polarización, conecte un matraz de recolección al tubo de escape de la muestra del hiperpolarizador y colóquelo cerca del espectrómetro.

Configure un espectrómetro de RMN de un tesla con la serie de escaneo de 13 carbonos de pulsos de RF de 110 grados a intervalos de tres segundos. Durante la polarización del piruvato, comience la preparación del cultivo celular. Retire el medio celular de los matraces de cultivo celular.

Lave las células con unos 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato. Añadir cinco mililitros de tripsina al matraz de cultivo. Incubar el cultivo durante tres a cinco minutos a 37 grados centígrados, y luego desactivar la tripsina con unos cinco mililitros de medio F12K que contenga un 10% de suero fetal de ternero por volumen.

Luego, transfiera el volumen de suspensión celular que contiene el número deseado de celdas a un tubo de centrífuga de plástico. Centrifugar la muestra de células a 1200 G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el palet en un medio F12K suficiente con 10%FCS para lograr un volumen final de 800 microlitros.

Transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y coloque el tubo en un recipiente de plástico lleno de agua tibia. Para comenzar la recopilación de datos a través de la espectroscopia de resonancia magnética de carbono 13, una vez que la muestra de célula esté preparada y la polarización del piruvato sea superior al 95 por ciento, haga clic en Ejecutar disolución en el software DNP Polarizer. Cargue el volumen medido de agente de disolución a través de la válvula superior de la cámara de disolución.

Mueva la varilla de disolución a la posición activa. Confirme haciendo clic en Siguiente'Una vez que la muestra de células esté lista para el experimento, haga clic en Finalizar' en el software DNP Polarizer para iniciar el proceso de disolución. Espere hasta que finalice el proceso de disolución.

Agregue 200 microlitros de la solución de piruvato hiperpolarizado a 800 microlitros de la muestra de células. Mezcle bien con una pipeta y luego coloque unos 600 microlitros de la mezcla en un tubo de RMN de cinco milímetros. Cargue el tubo de RMN en el espectrómetro y haga clic en Ejecutar'para iniciar la medición.

A continuación, mueva la varilla de disolución con el vaso de muestra adjunto a la posición de limpieza y haga clic en Finalizar'en el software DNP Polarizer. Para comenzar la resonancia magnética de carbono 13, después de comenzar el proceso de hiperpolarización, transfiera 800 microlitros de muestra de células resuspendidas con un número de células de al menos 10 al octavo a una jeringa de tres mililitros. Conecte la jeringa a un catéter largo y coloque la jeringa en una cama de resonancia magnética.

Asegúrese de que el catéter sea lo suficientemente largo como para llegar fuera del escáner de resonancia magnética. Coloque un maniquí de calibración, que contenga urea de carbono 13 molar con 10% de meglumina gadoterate junto a la jeringa. Coloque una bobina receptora de RF de carbono 13 sintonizada en la jeringa.

Inserte la cama de exploración en el escáner de modo que el objeto de interés esté en el isocentro del escáner de resonancia magnética. Conecte el matraz de conexión al tubo de escape de la muestra del hiperpolarizador y colóquelo cerca del extremo del catéter. Ejecute una secuencia de localización estándar de tres planos y ajuste la posición de la jeringa si es necesario.

A continuación, configure y ejecute una secuencia anatómica ponderada en T2 de protones que cubra la localización de la jeringa. A partir de las imágenes anatómicas resultantes, seleccione cinco cortes continuos de la región de interés, incluido el maniquí de carbono 13. Configure una adquisición de calibración espectroscópica de carbono 13 y seleccione la secuencia de calibración de siegert de bloques 2D de la biblioteca de secuencias de pulsos.

Descargue la secuencia de pulsos en el escáner y ejecute un preescaneo espectroscópico. En la gráfica de magnitud del espectro, establezca el pico fantasma de calibración de carbono 13 en el centro de la frecuencia del escáner. Ajuste las ganancias del receptor al máximo y haga clic en Escanear'para ejecutar la secuencia de calibración.

Registre la ganancia de transmisión y la frecuencia céntrica informadas. A continuación, configure una adquisición de imágenes de desplazamiento químico de carbono 13 para los cortes anatómicos elegidos. Elija la secuencia de imágenes espectroscópicas ecoplanares 2D y descargue la secuencia de pulsos en el escáner.

Ejecute el preescaneo espectroscópico y ajuste la frecuencia céntrica y la ganancia de transmisión en función de los valores de calibración para terminar de configurar el espectrómetro de resonancia magnética. Una vez que el piruvato alcance el 95% de polarización, haga clic en Ejecutar disolución 'en el software DNP Polarizer y cargue el agente de disolución. Mueva la varilla de disolución a la posición activa.

Haga clic en Siguiente'y luego Finalizar'Cuando la muestra hiperpolarizada disuelta llegue al matraz de recolección, extraiga aproximadamente 1 mililitro de la solución hiperpolarizada en una jeringa e inyéctela en el catéter para que 200 microlitros alcancen la muestra celular. Haga clic en Escanearpara iniciar la adquisición de los datos experimentales. Una vez finalizada la recopilación de datos, mueva la varilla de disolución con el vaso de muestra adjunto a la posición de limpieza y haga clic en Finalizar en el software DNP NMR.

La tasa de intercambio metabólico de piruvato a lactato se estudió en células de carcinoma de próstata PC3 mediante el seguimiento de las intensidades de la señal de espectroscopia de RMN de carbono 13 de lactato hiperpolarizado y piruvato con respecto a la frecuencia y el tiempo. Los valores cinéticos de lactato se evaluaron mediante un modelo de razón simple y mediante un modelo diferencial de intercambio de dos sitios, y se normalizaron al número de células. En ambos modelos, se observó una tendencia a la disminución de la producción de lactato con un número creciente de células.

Esto se atribuye a concentraciones celulares más altas y a una mayor viscosidad de la muestra. Las muestras con recuentos de células inferiores a dos veces diez a siete muestran una relación señal de lactato muy pequeña con respecto al ruido y, por lo tanto, grandes valores de desviación estándar, lo que indica que las muestras deben contener al menos ese número de células para obtener datos informativos. La localización espacial se logró con resonancia magnética con una buena resolución espectral, lo que permitió adquirir imágenes de carbono 13 para regiones de frecuencia específicas.

La distribución espacial se determinó a partir de los datos brutos. La imagen de carbono 13 también podría registrarse conjuntamente con la imagen de protones adquirida anteriormente. Una vez dominado y realizado correctamente, este experimento se puede realizar en menos de 60 minutos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una hiperpolarización de una molécula deseada utilizando la técnica de polarización nuclear dinámica y cómo hacer experimentos simples de espectroscopia de RMN e imágenes celulares. Al intentar este procedimiento, es importante ser muy rápido. Después de que la muestra hiperpolarizada salga del polarizador, recuerde que pierde toda la señal de RMN obtenida en menos de dos minutos.

En conclusión, el DNP de disolución se puede utilizar para una variedad de aplicaciones. Esto incluye el estudio de enfermedades como la diabetes, o la observación de los cambios metabólicos de varios tipos de cáncer, pero también la medición del pH de los tejidos.