Híbrido-Cut: un método de seccionamiento mejorada para muestras de tejido de la planta recalcitrante

El objetivo general del método de corte híbrido es mejorar la integridad de los tejidos vegetales recalcitrantes seccionados, aquellos con fibras resistentes y cristales de sílice, para crear muestras de tejido adecuadas para estudios anatómicos y biológicos. Las plantas que contienen un alto nivel de cristal y sílice pueden sufrir un desgarro severo de parafina y problemas durante el corte. Este método mejora significativamente la integridad de los tejidos.

La principal ventaja de esta técnica es que el corte a temperatura ultra baja en el criostato endurece el bloque de parafina, reduciendo significativamente el problema de cizallamiento de cristales. La aplicación de esta técnica puede extenderse a la hibridación in situ, FISH y evaluación interna, entre otras. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos para garantizar que el bloque de parafina se adhiera firmemente a una etapa pueden resultar desafiantes.

Para comenzar, seleccione plantas maduras de orquídeas phalaenopsis en la etapa de cinco hojas. Retire con cuidado las hojas rasgándolas a lo largo de la nervadura media. Con un bisturí afilado, retire con cuidado las yemas axilares de la base de la tercera o cuarta hoja en el sistema monopodial.

Coloque inmediatamente las muestras en un frasco de centelleo de vidrio que contenga 15 mililitros de fijador de PFA helado. Aplique un vacío a las muestras del fijador a cuatro grados centígrados durante 15 a 20 minutos. Se liberarán pequeñas burbujas de las muestras.

Repita este paso hasta que la mayoría de las muestras se hundan después de la liberación del vacío. Finalmente, sostenga la aspiradora durante la noche y suéltela lentamente al día siguiente. A continuación, sumerja las muestras fijadas en 15 mililitros de PBS y colóquelas en hielo durante 15 minutos.

Deshidratar las muestras en 15 mililitros de etanol en una serie de concentraciones crecientes. 30%50%70%85%95%y finalmente 100%Infiltrar las muestras con 15 mililitros de una mezcla sustitutiva de etanol y xileno de dos a uno volumen a volumen a temperatura ambiente. Continúe la infiltración colocando secuencialmente las muestras en 15 mililitros de cada uno de los siguientes.

Una mezcla de uno a uno de volumen a volumen de etanol y sustituto de xileno, una mezcla de uno a dos volumen a volumen de sustituto de etanol y xileno y, finalmente, sustituto de xileno puro. Luego incubar los tejidos en un horno a 60 grados centígrados. Infiltrar las muestras con 15 mililitros de sustituto de xileno y mezcla de parafina a 60 grados centígrados.

Finalmente, infiltre parafina en 15 milímetros de parafina pura dos veces durante 12 horas cada una a 60 grados centígrados. Repita este paso al día siguiente. Para comenzar a incrustar, primero caliente los moldes de metal a 62 grados centígrados y luego vierta aproximadamente 13 mililitros de cera fundida en la base del molde.

Con pinzas calientes, transfiera una muestra de tejido al molde y oriéntelo en la posición deseada. Mueva el molde con cuidado sobre la placa de enfriamiento y déjelo reposar hasta que la cera se solidifique. A continuación, use una hoja de afeitar para recortar el bloque de muestra de parafina en una columna de tamaño adecuado con una superficie trapezoidal en la parte superior.

Agregue 800 microlitros de compuesto óptico para temperatura de corte, o OCT, al centro de la etapa de criostato. Coloque el bloque de parafina en la platina y oriente rápidamente el bloque de tejido a la posición deseada. Transfiera el bloque de parafina y la etapa a una cámara de cristo.

Congele rápidamente el OCT a 42 grados centígrados negativos durante 10 minutos. A continuación, enfríe el adaptador crystat y la temperatura de la cámara a menos 20 grados Celsius y menos 16 grados Celsius respectivamente. Conecte el bloque y la platina al adaptador crystat.

Ahora, secciona los tejidos hasta que tengan un grosor de 10 micrómetros. Con pinzas, recoja las secciones de tejido y colóquelas de manera que floten sobre 800 microlitros de agua tratada con DEPC en un portaobjetos recubierto de poli-l-lisina. Transfiera los portaobjetos a una placa calefactora ajustada a 42 grados centígrados.

Deje que las secciones se aplanen y use papel de filtro para absorber el agua de los bordes. Deje la muestra en la placa caliente a 42 grados centígrados durante la noche para permitir que el tejido se monte en el portaobjetos. Para desparafinar las muestras, primero coloque los portaobjetos de tejido montados en una rejilla de tinción.

Agregue 150 mililitros de xileno en un frasco de tinción y sumerja la rejilla de portaobjetos durante cinco minutos. A continuación, rehidrate las muestras colocándolas en concentraciones decrecientes de etanol, de 150 mililitros cada una, durante tres minutos a temperatura ambiente. Por último, sumerja los especímenes en agua destilada doble durante tres minutos.

Tiñir las muestras colocando los portaobjetos en 150 mililitros de solución de hematoxilina durante 1,5 minutos. Enjuague durante unos segundos en 150 mililitros de agua bidestilada que contenga una o dos gotas de ácido clorhídrico N, y luego lave brevemente los portaobjetos con agua bidestilada. Deshidratar las muestras una vez más utilizando una serie de 150 mililitros de concentraciones crecientes de etanol durante tres minutos a temperatura ambiente.

Sumerge las muestras en 150 mililitros de xileno durante cinco minutos. Finalmente, monte las muestras agregando suavemente 600 microlitros de medio de montaje a base de xileno en cada portaobjetos y luego colocando un cubreobjetos sobre la muestra. Con este método, se generaron secciones de tejido de orquídeas phalaenopsis, incluida la yema axilar, típicamente difícil de seccionar, que contiene altos niveles de cristales.

Se conservaron estructuras detalladas, lo que permitió la visualización de los cuerpos de las proteínas. El corte híbrido también produjo un corte claro para la visualización del meristemo apical del brote de la semilla germinada. Estas imágenes muestran la preparación de secciones transversales de hojas de plantas de arroz y trigo utilizando las técnicas tradicionales de corte de parafina frente a cortes híbridos.

Estos cultivos suelen contener altos niveles de sílice, lo que dificulta su sección. La integridad del tejido en las secciones de corte híbrido mejoró significativamente, y las estructuras clave a menudo distorsionadas, o difíciles de encontrar en las muestras de parafina, se conservaron en su totalidad en el tejido de corte híbrido. Además, solo se observó lagrimeo en las muestras seccionadas con parafina.

Además, la fuerte retención de la anatomía hace que los tejidos de corte híbridos sean útiles para el estudio de los patrones de expresión génica espacial. Aquí, se llevó a cabo la hibridación in situ con Actina y Ciclina B1:1 en secciones cortadas híbridas de la segunda y tercera yemas axilares de las orquídeas phalaenopsis. La mejora de la preservación anatómica permitió la detección de mayores niveles de expresión de los genes diana en las células meristemáticas en desarrollo de las terceras yemas axilares.

Al intentar este procedimiento, es importante mantener una temperatura de menos 16 grados centígrados para endurecer el bloque de parafina. Esto debería dar como resultado una sección de tejido de buena calidad. Primero tuvimos la idea de este método después de que fallamos muchas veces en realizar un corte exitoso en orquídea utilizando el método tradicional de parafina o criosección.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar todos los experimentos, como la hibridación in situ y la FISH, para responder a preguntas adicionales, incluida la investigación de la localización espacial y la función de los genes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un corte de tejido de alta calidad en una muestra de planta recalcitrante.