Difusión molecular en el plasma membranas de linfocitos primarios medidos por espectroscopia de correlación de fluorescencia

El objetivo general de este protocolo es medir la tasa de difusión de una proteína marcada en las membranas de las células inmunitarias primarias mediante espectroscopia de correlación de fluorescencia. Este método puede ayudar a identificar preguntas clave en los campos de la inmunología y la biología celular, como la identificación de células asesinas naturales con una dinámica de receptores de membrana más activa. La principal ventaja de esta técnica es que se utiliza con células vivas, por lo que refleja con precisión el estado natural de cómo se mueven las moléculas.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la inmunoterapia del cáncer si se relacionan diferentes rasgos de las células asesinas naturales, como la difusión molecular, con su función, de manera que se pueda predecir mejor la eficiencia. Aunque este método puede proporcionar información sobre el movimiento molecular de las células inmunitarias, también se puede aplicar a otras células primarias y líneas celulares de cualquier disciplina. Abra el software en modo experto, con la opción Escanear nuevas imágenes seleccionada.

Seleccione la lente del objetivo de agua 40X en el microscopio de escaneo láser confocal. En la pestaña Adquirir, presione los botones Config y Scan para abrir el Control de configuración y el Control de escaneo. En la pestaña ConfoCor, presione Medir para abrir la ventana Medición.

A continuación, cree una carpeta para guardar las mediciones de FCS. Inicie una nueva base de datos de imágenes haciendo clic en Nuevo en la pestaña Archivo. Encienda la lámpara halógena.

Con el botón láser, encienda los láseres correspondientes para excitar los fluoróforos. A continuación, especifique la configuración para la captura de imágenes en la ventana Control de configuración. Esto incluye el láser de excitación, los filtros de excitación y emisión, la trayectoria de la luz y los detectores en uso.

Del mismo modo, vaya a la ventana Medición y ajuste la configuración de FCS en la pestaña Configuración del sistema. Active los canales de detección para las grabaciones de FCS alternando Ch 1 para el canal verde y Ch 2 para el canal rojo. Mientras el láser se estabiliza, lo que puede tardar hasta 30 minutos, ajuste el orificio.

Primero, coloque una gota de tinte de 50 microlitros en el centro en un pocillo de un portaobjetos de vidrio de ocho pocillos con cámara recubierta con poli-L-lisina. Los pozos adyacentes se utilizan para realizar mediciones de celdas, ya que la calibración depende del deslizamiento. Coloque una gota de agua destilada en la lente del objetivo de agua 40X y coloque la corredera.

A continuación, pulse Vis para seleccionar la fuente de luz visible y concéntrese en la posición central de la gota de fluoróforo. En la ventana de medición del software, seleccione la pestaña Adquisición y, en Posiciones, cambie la posición actual. Luego regrese a la pestaña Configuración del sistema en la misma ventana y establezca una potencia alta o de saturación para el láser verde.

Para probar la estabilidad de la señal, presione Iniciar para abrir una nueva ventana que muestra la traza de tiempo y la curva de correlación automática. Compruebe que la señal fluorescente sea alta, estable y que el eje y muestre fluctuaciones en el rango de kilohercios. Los valores más bajos pueden deberse a un enfoque impreciso o a la degradación del tinte.

A continuación, en la ventana Medición, seleccione el botón O Ajustar. A continuación, seleccione el canal de detección correcto y pulse Ajuste automático X.Si falta el límite superior de la curva resultante o no está centrado, marque la opción Grueso y vuelva a pulsar Ajuste automático X. Después de ajustar la dirección X, haga lo mismo para la dirección Y presionando en Ajuste automático Y.Deseleccione Grueso y alterne entre el ajuste X e Y presionando Ajuste automático hasta que ambos tengan valores máximos claros y estables.

Si las células están marcadas con dos fluoróforos diferentes, agregue una gota de solución de fluoróforo rojo a una cámara adyacente. A continuación, calibra el segundo canal. Ajuste el láser rojo a una potencia alta y repita el procedimiento de calibración de estabilidad.

A continuación, medimos el tiempo de tránsito de los fluoróforos que se difunden libremente a través del foco. Y usamos la etapa para calcular el área de la membrana celular que está dentro del foco. Para comenzar, concéntrese en una gota de solución realizando cuidadosamente el procedimiento de ajuste.

A continuación, vaya a la pestaña Adquisición en la ventana Medición y establezca el tiempo de adquisición en 30 segundos con tres repeticiones. Ajuste la potencia del láser a casi saturación y presione Iniciar para tomar una medición. Registre los recuentos por molécula o CPM una vez completada la medición.

A continuación, tome nuevas mediciones realizando reducciones iterativas de la potencia del láser. Dentro de este rango de potencia, incluya la potencia esperada de las próximas mediciones de celda. A continuación, compruebe que los valores de CPM se escalan linealmente con la potencia del láser.

Siempre que el resto de la escala sea lineal, la saturación a la potencia más alta es aceptable. La primera vez que se utiliza un anticuerpo fluorescente recién conjugado, se realiza una medición FCS de anticuerpos de difusión libre para cuantificar el CPM esperado. Y es importante utilizar pocillos recubiertos con PEG Poly-L-Lysine para obtener anticuerpos libres.

Para este procedimiento, recubra un portaobjetos con cámara con 200 microlitros de poli-L-lisina injertada en polietilenglicol. Deje que la solución se adhiera durante una hora a temperatura ambiente. La solución madre se puede refrigerar hasta por dos semanas.

Y el caldo de polvo debe almacenarse en el congelador. Más tarde, retire el líquido y deje que la cámara se seque al aire. En el microscopio, diluya el anticuerpo en PBS entre uno y 10 microgramos por mililitro.

Proceda a medir el tiempo de tránsito de los anticuerpos libres como se describe en la sección anterior para los fluoróforos libres. Para realizar mediciones en una célula, agregue 125 microlitros de células en PBS más 1 % de FCS de la suspensión celular marcada con anticuerpos. Y 150 microlitros de Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 transparente en un pozo vacío en el portaobjetos de vidrio recubierto de PLL.

Deje que las células se incuben en la oscuridad a la temperatura de medición durante al menos 20 minutos antes de continuar, para que las células puedan adherirse y equilibrarse. Inicie la obtención de imágenes con escaneos XY rápidos para encontrar la potencia láser más baja posible necesaria para ver las células. A continuación, centre la imagen en una celda redonda de brillo medio donde la membrana esté claramente definida.

Es crucial que no haya señal fluorescente en el citoplasma. Acérquese hasta que la celda cubra la mayor parte de la imagen. A continuación, concéntrese en la parte superior de la membrana celular.

Comience en el centro de la celda y muévase hacia arriba hasta que el centro de la imagen muestre una pequeña área redonda con fluorescencia uniforme. La colocación cuidadosa del foco es crucial. Si el foco no está en la membrana, la fluorescencia detectada no provendrá de los receptores de membrana marcados con fluorescencia.

Y, por lo tanto, los resultados no reflejarán su comportamiento. Ahora, en la pestaña Adquisición de la ventana Medición, seleccione una posición para la medición FCS activando el punto de mira. A continuación, establezca el número de repeticiones entre seis y 10 y establezca el tiempo de medición en 10 segundos por repetición.

Ahora regrese a la pestaña Configuración del sistema de la ventana Medición y reduzca la potencia del láser para las mediciones de FCS a entre uno y 10 microvatios. A continuación, pulse Inicio. Si la traza de intensidad cae en más de un 30% durante los primeros 10 segundos, la célula se ha blanqueado demasiado y se debe medir otra célula a una potencia menor.

Si se pierde la señal, ajuste el enfoque en la dirección Z y reinicie la medición. Una vez completada la medición, mire en la ventana Control de escaneo para verificar que la celda aún esté centrada para asegurarse de que se midió su membrana. Si la celda se movió, descarte los datos.

Ahora vaya a la ventana Correlación automática y elimine manualmente las repeticiones individuales que contengan maniobras de zoom, blanqueo, grupos grandes u otros artefactos. Haga clic con el botón derecho y seleccione Eliminar para eliminar los artefactos. La selección de los artefactos reales requiere práctica.

La eliminación de repeticiones es un proceso sencillo, pero las repeticiones deben evaluarse correctamente para saber qué se debe eliminar y cuál no. A continuación, guarde el archivo final en formato FCS. Conserve solo las celdas a las que les queden al menos cuatro repeticiones después de la eliminación de artefactos para un análisis más detallado.

Una curva de autocorrelación típica de un receptor de membrana es suave y tiene un tiempo de tránsito en el rango de 10 a 400 milisegundos. Establezca los dominios de ajuste de modo que se representen tanto el inicio como el final de la parte inclinada más pronunciada, que representa la difusión. Utilizando un modelo de difusión libre en dos dimensiones para ajustar los datos, preste atención a la parte de la curva con la pendiente más profunda.

Pequeñas fluctuaciones de un segundo o alrededor de un segundo en la escala tau, observadas en el residuo, son aceptables. Si la curva encaja mal, pero la celda no tiene problemas aparentes, como movimiento, blanqueo o clústeres, es probable que sea necesario cambiar los valores iniciales o los límites superior e inferior del modelo. Una vez que el modelo se ajuste bien a la curva de correlación automática, extraiga los valores de los parámetros de la variable.

El número de moléculas puede variar entre 0,5 y alrededor de 200 por micra cuadrada para las proteínas expresadas endógenamente. Compruebe que el valor de CPM de la medición celular es al menos el 33% del registrado por los anticuerpos que se difunden libremente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la tasa de difusión de proteínas utilizando espectroscopia de correlación fluorescente.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco o seis horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante mantener las células en hielo hasta unos 20 minutos antes del inicio de la medición. No mida ninguna muestra durante más de dos horas.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la obtención de imágenes, para responder a preguntas adicionales, como la forma en que la tasa de difusión se correlaciona con el nivel de expresión de una determinada proteína. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en los campos de la biología molecular y la inmunología exploraran la dinámica de las proteínas en células vivas.