Name: Difusión molecular en el plasma membranas de linfocitos primarios medidos por espectroscopia de correlación de fluorescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Aprende a medir la difusión de proteínas en membranas de linfocitos primarios mediante espectroscopia de correlación de fluorescencia. Esta técnica revela la dinámica de receptores en células vivas para avanzar en inmunoterapia.

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Agradecemos al Dr. Vladana Vukojevic, Centro de Medicina Molecular, Instituto Karolinska para el mantenimiento del instrumento Zeiss ConfoCor 3 y para consejos útiles con respecto a las mediciones de células. Este estudio fue financiado por becas de Vetenskapsrådet (número de concesión 2012- 1629), Magnus Bergvalls Stiftelse, y desde Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo de FCS se puede utilizar para la evaluación de la dinámica molecular de moléculas de la superficie de todos los tipos de células inmunes (murino, humano, u otras especies). Medidas FCS dinámica molecular espacio-temporales abajo a la resolución de una sola molécula en las células vivas. La densidad molecular, así como la dinámica del tipo de difusión y la agrupación de las proteínas de interés, se pueden extraer de las curvas de autocorrelación. El marcaje fluorescente es de i...

Muchas funciones células inmunes se basan en la difusión molecular y las interacciones dentro de las membranas. Las membranas biológicas son complejos, y muchos factores que pueden ser importantes para la función de las células inmunes puede influir en la velocidad de difusión de traslación de las proteínas dentro de las membranas celulares 1. Recientemente, hemos mostrado que las células asesinas naturales (NK), los linfocitos que pertenecen al sistema inmune innato, exhiben la difusión diferencial de dos proteínas estudiadas en la membrana celular en función del estado de activación de las células NK 2. espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) es una técnica que es capaz de cuantificar las velocidades de difusión molecular dentro de las membranas biológicas. Se informa de la velocidad de difusión media de la etiqueta fluorescente moléculas en un volumen fijo, por lo general en el foco de un microscopio confocal. Se basa en la medición de las fluctuaciones de la fluorescencia que se producen tras el movimiento molecular enun sistema en estado estacionario. FCS ha sido ampliamente utilizado para el estudio de la difusión de los tintes fluorescentes y proteínas, tanto en solución y dentro de las membranas lipídicas. Otros parámetros de salida que afectan a la velocidad de difusión también pueden ser estudiados indirectamente de esta manera (por ejemplo, los cambios conformacionales de proteínas o interacciones de las moléculas en las membranas celulares) 3, 4. FCS se destaca en comparación con otras técnicas debido a su alta sensibilidad, lo que permite la posibilidad para la detección de moléculas individuales. Funciona bien para concentraciones moleculares en el rango nanomolar a milimolar, que es típico de los niveles de expresión endógenos de la mayoría de las proteínas 5. Por otra parte, FCS puede dar una aproximación del número absoluto de proteínas dentro del volumen estudiado, mientras que la mayoría de otras técnicas sólo dan información relativa sobre los niveles de expresión de proteínas. Otros métodos para medir la velocidad de difusión molecular dentro de las membranas incluyen fluocencia de recuperación después de photobleaching (FRAP), solo rastreo de partículas (SPT), múltiples estenopeica FCS, y correlación de imagen métodos. Métodos FRAP y de correlación de imágenes son técnicas por conjuntos, que por lo general no dan información sobre el número absoluto de moléculas 10. En comparación con SPT, el rendimiento de FCS es mayor en lo que se refiere a la caracterización de la media de la población. El análisis también es menos exigente, ya que se mide la velocidad de difusión media de las moléculas presentes en el foco del láser, en lugar de la velocidad de moléculas individuales. También, a menos microscopios especializados están disponibles 11, SPT puede no da ninguna información acerca de las concentraciones, ya etiquetado estándar SPT debe ser muy bajo para permitir la identificación de moléculas individuales. Por otro lado, FCS requiere las moléculas en estudio sean móviles. Simplemente no detectará ningún fracciones inmóviles putativos o moléculas que se mueven muy lentamente. La tasa de difusión de las moléculas queresidir dentro del enfoque más de aproximadamente un décimo del tiempo de adquisición no será representado correctamente en las mediciones de FCS 3, 12. Por lo tanto, los coeficientes de difusión registrados por FCS tienden a ser más rápido que las velocidades de difusión reportados a partir de técnicas como FRAP y SPT, donde se toman las fracciones cercanas al inmóvil y muy lentos en cuenta también. SPT también dará una descripción más detallada de la variabilidad de las tasas de difusión dentro de la población molecular que el FCS. FCS cuantifica la fluctuación de la intensidad de fluorescencia con el tiempo dentro del volumen excitado. En el caso de mediciones de membrana, esto se traduce en la zona iluminada de la membrana. En este trabajo, utilizamos el hecho de que estas fluctuaciones son inducidas por las moléculas que exhiben difusión browniano y por lo tanto se están moviendo dentro y fuera del volumen de excitación. También hay varias otras fuentes posibles para la fluctuaciones en la señal de fluorescencia, tales como el parpadeo o la presencia de un estado triplete en los fluoróforos, los efectos ambientales, la unión-unbinding del ligando, o el movimiento de la totalidad de la membrana celular. Estas fuentes de error putativo hay que tener en cuenta al diseñar un experimento FCS con el fin de interpretar con precisión los resultados 12, 13. Típicamente, las tasas de difusión lateral en las membranas biológicas son bajos debido a la aglomeración y las interacciones, tanto entre proteínas de membrana y entre las proteínas y el citoesqueleto. Históricamente, el uso de FCS en las membranas de este modo se ha visto obstaculizada por la falta de fluoróforos foto-estable, que son necesarios para evitar la decoloración durante los tiempos de tránsito extiende a través del foco de excitación 14. Sin embargo, hoy en día, hay un montón de opciones para tintes foto-estable adecuados. Mejoras significativas en los detectores y otros equipos también permiten la detección de una prot fluorescenteins y tintes de menor brillo. Aquí, un protocolo básico para la aplicación de FCS utilizando linfocitos primarios murinos, donde la proteína de interés se marca con un anticuerpo marcado con fluorescencia, se describe. También se muestra un enfoque para adaptarse a las curvas de autocorrelación con el fin de extraer el coeficiente de difusión y la densidad molecular. El protocolo tiene como objetivo ser seguido fácilmente por los inmunólogos sin experiencia previa de técnicas para estudiar la difusión de las moléculas. Sin embargo, se espera que una comprensión básica de la microscopía confocal (para obtener este conocimiento básico, véase la referencia 15). Este protocolo puede relativamente fácilmente ser adaptado a otras células en suspensión, las dos líneas celulares y células primarias. Para los usuarios más experimentados FCS, existen métodos de análisis más refinados, algunos de los cuales se describen en la discusión.

<table><tbody><tr><td>MACS NK Cell Isolation Kit ratón II</td><td>Miltenyi Biotec NordenAB</td><td>130-096-892</td><td>Selección negativa de células NK</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td> inactivado por calor<td>-</td><td>-</td><td>Hecho en casa&nbsp;</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medio 1640</td><td>PAA La Compañía de Cultivo Celular &nbsp;</td><td>E15-848</td><td>Medio transparente</td></tr><tr><td>Clon de anticuerpos 2.4G2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>553140</td><td>Para el bloqueo de receptores Fc.</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Ly49A&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Anticuerpo monoclonal fabricado internamente y conjugado internamente con el anticuerpo Alexa fluor 647</td></tr><tr><td>Clone JR9.318</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-H-2Dd&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>558915</td><td>Conjugado internamente con MFP488</td></tr><tr><td>Clon 34.5.8S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP488</td><td>Mobiotech</td><td>MFP-A2181</td><td>Colorante fluorescente para la conjugación de anticuerpos.</td></tr><tr><td>Poly-L-Lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Diluido en agua destilada (1.10)</td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina (20 kDa) injertado con polietilenglicol (2 kDa)</td><td>SuSoS AG</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)</td><td>Diluido en PBS (pH 7.4) a 0.5 mg/ml.</td></tr><tr><td>Cloruro de rodamina 110</td><td>Sigma-Aldrich 432202</td><td></td><td>Coeficiente de difusión conocido: 3.3 &times; 10&minus; 10</s> m2/seg 19</td></tr><tr><td>Alexa fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A20006</td><td>Coeficiente de difusión conocido: 4,4 veces; 10&menos; 10 m2/seg 20</td></tr><tr><td>Microscopio confocal&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>Software: Confocor 3</td><td>Zeiss</td> Software: Matlab con caja de herramientas de ajuste de curvas <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Matlab</td><td>versión R2013b</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Thermo-scientific&nbsp;</td><td>155411</td><td>8 pocillos, fondo de borosilicato 1.0</td></tr></tbody></table>

difusión molecular en el plasma membranas de linfocitos primarios medidos por espectroscopia de correlación de fluorescencia

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) es una poderosa técnica para el estudio de la difusión de las moléculas dentro de las membranas biológicas con una alta resolución espacial y temporal. FCS puede cuantificar el coeficiente de concentración y la difusión molecular de moléculas marcadas con fluorescencia en la membrana celular. Esta técnica tiene la capacidad de explorar las características de difusión molecular de las moléculas en la membrana plasmática de las células inmunes en el estado de equilibrio (es decir, sin procesos que afectan el resultado durante el tiempo de medición real). FCS es adecuado para el estudio de la difusión de las proteínas que se expresan en niveles típicos de proteínas más endógenas. Aquí, se demuestra un método sencillo y robusto para determinar la velocidad de difusión de las proteínas de la membrana celular en los linfocitos primarios. se describen Una manera eficaz de realizar mediciones en células vivas de anticuerpos manchados y observaciones que ocurren comúnmente después de la adquisición. Los avances recientesen el desarrollo de los tintes fluorescentes foto-estable pueden ser utilizados por la conjugación de los anticuerpos de interés de apropiarse de tintes que no usar lejía ampliamente durante las mediciones. Además, esto permite la detección de entidades que se difunden lentamente, lo que es una característica común de las proteínas expresadas en las membranas celulares. se pone de relieve el procedimiento de análisis para extraer parámetros de concentración y de difusión molecular a partir de las curvas de autocorrelación generados. En resumen, se proporciona un protocolo básico para las mediciones de FCS; que puede ser seguido por los inmunólogos con una comprensión de la microscopía confocal, pero con ninguna otra experiencia anterior de técnicas para la medición de parámetros dinámicos, tales como velocidades de difusión molecular.

Un resultado típico generará una curva de autocorrelación con un tiempo de tránsito en el intervalo de 10 mseg a 400 mseg para proteínas de membrana. El número de moléculas puede variar entre 0,5 a alrededor de 200 por m 2 para proteínas expresadas de forma endógena. Compruebe cuidadosamente que el CPM no es menor de lo esperado. Esto puede significar que hay una influencia de la señal de fondo. Como regla general, la señal de CPM en las células que se acepta para el análisis ...

Se describe un método para medir la difusión de proteínas en las membranas de las células inmunitarias primarias mediante espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS). En este trabajo se ilustra el uso de anticuerpos para el marcaje fluorescente.

Difusión molecular en el plasma membranas de linfocitos primarios medidos por espectroscopia de correlación de fluorescencia

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

El objetivo general de este protocolo es medir la tasa de difusión de una proteína marcada en las membranas de las células inmunitarias primarias mediante espectroscopia de correlación de fluorescencia. Este método puede ayudar a identificar preguntas clave en los campos de la inmunología y la biología celular, como la identificación de células asesinas naturales con una dinámica de receptores de membrana más activa. La principal ventaja de esta técnica es que se utiliza con células vivas, por lo que refleja con precisión el estado natural de cómo se mueven las moléculas.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la inmunoterapia del cáncer si se relacionan diferentes rasgos de las células asesinas naturales, como la difusión molecular, con su función, de manera que se pueda predecir mejor la eficiencia. Aunque este método puede proporcionar información sobre el movimiento molecular de las células inmunitarias, también se puede aplicar a otras células primarias y líneas celulares de cualquier disciplina. Abra el software en modo experto, con la opción Escanear nuevas imágenes seleccionada.Seleccione la lente del objetivo de agua 40X en el microscopio de escaneo láser confocal. En la pestaña Adquirir, presione los botones Config y Scan para abrir el Control de configuración y el Control de escaneo. En la pestaña ConfoCor, presione Medir para abrir la ventana Medición.A continuación, cree una carpeta para guardar las mediciones de FCS. Inicie una nueva base de datos de imágenes haciendo clic en Nuevo en la pestaña Archivo. Encienda la lámpara halógena.Con el botón láser, encienda los láseres correspondientes para excitar los fluoróforos. A continuación, especifique la configuración para la captura de imágenes en la ventana Control de configuración. Esto incluye el láser de excitación, los filtros de excitación y emisión, la trayectoria de la luz y los detectores en uso.Del mismo modo, vaya a la ventana Medición y ajuste la configuración de FCS en la pestaña Configuración del sistema. Active los canales de detección para las grabaciones de FCS alternando Ch 1 para el canal verde y Ch 2 para el canal rojo. Mientras el láser se estabiliza, lo que puede tardar hasta 30 minutos, ajuste el orificio.Primero, coloque una gota de tinte de 50 microlitros en el centro en un pocillo de un portaobjetos de vidrio de ocho pocillos con cámara recubierta con poli-L-lisina. Los pozos adyacentes se utilizan para realizar mediciones de celdas, ya que la calibración depende del deslizamiento. Coloque una gota de agua destilada en la lente del objetivo de agua 40X y coloque la corredera.A continuación, pulse Vis para seleccionar la fuente de luz visible y concéntrese en la posición central de la gota de fluoróforo. En la ventana de medición del software, seleccione la pestaña Adquisición y, en Posiciones, cambie la posición actual. Luego regrese a la pestaña Configuración del sistema en la misma ventana y establezca una potencia alta o de saturación para el láser verde.Para probar la estabilidad de la señal, presione Iniciar para abrir una nueva ventana que muestra la traza de tiempo y la curva de correlación automática. Compruebe que la señal fluorescente sea alta, estable y que el eje y muestre fluctuaciones en el rango de kilohercios. Los valores más bajos pueden deberse a un enfoque impreciso o a la degradación del tinte.A continuación, en la ventana Medición, seleccione el botón O Ajustar. A continuación, seleccione el canal de detección correcto y pulse Ajuste automático X.Si falta el límite superior de la curva resultante o no está centrado, marque la opción Grueso y vuelva a pulsar Ajuste automático X. Después de ajustar la dirección X, haga lo mismo para la dirección Y presionando en Ajuste automático Y.Deseleccione Grueso y alterne entre el ajuste X e Y presionando Ajuste automático hasta que ambos tengan valores máximos claros y estables.Si las células están marcadas con dos fluoróforos diferentes, agregue una gota de solución de fluoróforo rojo a una cámara adyacente. A continuación, calibra el segundo canal. Ajuste el láser rojo a una potencia alta y repita el procedimiento de calibración de estabilidad.A continuación, medimos el tiempo de tránsito de los fluoróforos que se difunden libremente a través del foco. Y usamos la etapa para calcular el área de la membrana celular que está dentro del foco. Para comenzar, concéntrese en una gota de solución realizando cuidadosamente el procedimiento de ajuste.A continuación, vaya a la pestaña Adquisición en la ventana Medición y establezca el tiempo de adquisición en 30 segundos con tres repeticiones. Ajuste la potencia del láser a casi saturación y presione Iniciar para tomar una medición. Registre los recuentos por molécula o CPM una vez completada la medición.A continuación, tome nuevas mediciones realizando reducciones iterativas de la potencia del láser. Dentro de este rango de potencia, incluya la potencia esperada de las próximas mediciones de celda. A continuación, compruebe que los valores de CPM se escalan linealmente con la potencia del láser.Siempre que el resto de la escala sea lineal, la saturación a la potencia más alta es aceptable. La primera vez que se utiliza un anticuerpo fluorescente recién conjugado, se realiza una medición FCS de anticuerpos de difusión libre para cuantificar el CPM esperado. Y es importante utilizar pocillos recubiertos con PEG Poly-L-Lysine para obtener anticuerpos libres.Para este procedimiento, recubra un portaobjetos con cámara con 200 microlitros de poli-L-lisina injertada en polietilenglicol. Deje que la solución se adhiera durante una hora a temperatura ambiente. La solución madre se puede refrigerar hasta por dos semanas.Y el caldo de polvo debe almacenarse en el congelador. Más tarde, retire el líquido y deje que la cámara se seque al aire. En el microscopio, diluya el anticuerpo en PBS entre uno y 10 microgramos por mililitro.Proceda a medir el tiempo de tránsito de los anticuerpos libres como se describe en la sección anterior para los fluoróforos libres. Para realizar mediciones en una célula, agregue 125 microlitros de células en PBS más 1 % de FCS de la suspensión celular marcada con anticuerpos. Y 150 microlitros de Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 transparente en un pozo vacío en el portaobjetos de vidrio recubierto de PLL.Deje que las células se incuben en la oscuridad a la temperatura de medición durante al menos 20 minutos antes de continuar, para que las células puedan adherirse y equilibrarse. Inicie la obtención de imágenes con escaneos XY rápidos para encontrar la potencia láser más baja posible necesaria para ver las células. A continuación, centre la imagen en una celda redonda de brillo medio donde la membrana esté claramente definida.Es crucial que no haya señal fluorescente en el citoplasma. Acérquese hasta que la celda cubra la mayor parte de la imagen. A continuación, concéntrese en la parte superior de la membrana celular.Comience en el centro de la celda y muévase hacia arriba hasta que el centro de la imagen muestre una pequeña área redonda con fluorescencia uniforme. La colocación cuidadosa del foco es crucial. Si el foco no está en la membrana, la fluorescencia detectada no provendrá de los receptores de membrana marcados con fluorescencia.Y, por lo tanto, los resultados no reflejarán su comportamiento. Ahora, en la pestaña Adquisición de la ventana Medición, seleccione una posición para la medición FCS activando el punto de mira. A continuación, establezca el número de repeticiones entre seis y 10 y establezca el tiempo de medición en 10 segundos por repetición.Ahora regrese a la pestaña Configuración del sistema de la ventana Medición y reduzca la potencia del láser para las mediciones de FCS a entre uno y 10 microvatios. A continuación, pulse Inicio. Si la traza de intensidad cae en más de un 30% durante los primeros 10 segundos, la célula se ha blanqueado demasiado y se debe medir otra célula a una potencia menor.Si se pierde la señal, ajuste el enfoque en la dirección Z y reinicie la medición. Una vez completada la medición, mire en la ventana Control de escaneo para verificar que la celda aún esté centrada para asegurarse de que se midió su membrana. Si la celda se movió, descarte los datos.Ahora vaya a la ventana Correlación automática y elimine manualmente las repeticiones individuales que contengan maniobras de zoom, blanqueo, grupos grandes u otros artefactos. Haga clic con el botón derecho y seleccione Eliminar para eliminar los artefactos. La selección de los artefactos reales requiere práctica.La eliminación de repeticiones es un proceso sencillo, pero las repeticiones deben evaluarse correctamente para saber qué se debe eliminar y cuál no. A continuación, guarde el archivo final en formato FCS. Conserve solo las celdas a las que les queden al menos cuatro repeticiones después de la eliminación de artefactos para un análisis más detallado.Una curva de autocorrelación típica de un receptor de membrana es suave y tiene un tiempo de tránsito en el rango de 10 a 400 milisegundos. Establezca los dominios de ajuste de modo que se representen tanto el inicio como el final de la parte inclinada más pronunciada, que representa la difusión. Utilizando un modelo de difusión libre en dos dimensiones para ajustar los datos, preste atención a la parte de la curva con la pendiente más profunda.Pequeñas fluctuaciones de un segundo o alrededor de un segundo en la escala tau, observadas en el residuo, son aceptables. Si la curva encaja mal, pero la celda no tiene problemas aparentes, como movimiento, blanqueo o clústeres, es probable que sea necesario cambiar los valores iniciales o los límites superior e inferior del modelo. Una vez que el modelo se ajuste bien a la curva de correlación automática, extraiga los valores de los parámetros de la variable.El número de moléculas puede variar entre 0,5 y alrededor de 200 por micra cuadrada para las proteínas expresadas endógenamente. Compruebe que el valor de CPM de la medición celular es al menos el 33% del registrado por los anticuerpos que se difunden libremente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la tasa de difusión de proteínas utilizando espectroscopia de correlación fluorescente.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco o seis horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante mantener las células en hielo hasta unos 20 minutos antes del inicio de la medición. No mida ninguna muestra durante más de dos horas.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la obtención de imágenes, para responder a preguntas adicionales, como la forma en que la tasa de difusión se correlaciona con el nivel de expresión de una determinada proteína. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en los campos de la biología molecular y la inmunología exploraran la dinámica de las proteínas en células vivas.

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