La indirecta neurona-astrocito Coculture Ensayo: Un In Vitro Puesta en marcha de la investigación detallada de las interacciones neurona-glía

El objetivo general de este ensayo de cocultivo indirecto es investigar el impacto de los astrocitos en el desarrollo de las neuronas. Nuestro laboratorio está interesado en el papel de las interacciones neurona-glía. Se cree que los astrocitos contribuyen a la formación de las sinapsis, las estructuras de conexión del sistema nervioso central.

Para estudiar su papel, hemos diseñado un modelo in vitro en el que podemos combinar astrocitos primarios y neuronas embrionarias primarias, en compartimentos separados. Los compartimentos están conectados por una membrana permeable, que permite el análisis de los intercambios entre ambos tipos de células. Con este enfoque, hemos podido monitorear la formación de sinapsis durante períodos de hasta cuatro semanas.

Además, es posible investigar las funciones individuales de los astrocitos, por un lado, y de las neuronas, por otro, utilizando este ensayo. Y finalmente, también podemos investigar con más detalle el secretoma de nuestros compartimentos celulares que contiene moléculas que median la influencia recíproca de ambos compartimentos celulares en ese sistema. Este método puede proporcionar información sobre las interacciones entre las neuronas y los astrocitos.

Además, se puede aplicar a otros organismos modelo, como las células de rata. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrían dificultades porque se requiere experiencia para obtener la operación de maduración óptima del tejido del hipocampo después de la disección. Para diseccionar las cortezas, retira la piel del cráneo a lo largo de la línea media, desde el cuello hasta el nivel de los ojos.

A continuación, sostenga la cabeza por el extremo rostral con un par de pinzas y haga una incisión a lo largo de la línea media del cráneo. Luego, corta las mitades izquierda y derecha del cráneo para exponer el cerebro. Después de eso, levante el cerebro del cráneo y transfiéralo a una placa de Petri de 10 cm llena de HBSS.

Proceda de la misma manera con los especímenes restantes hasta que todos los cerebros estén recogidos en el plato. Para separar las cortezas, pellizca la corteza posterior con un par de pinzas. Haz una incisión en la línea media entre los dos hemisferios.

Fije cuidadosamente el cerebro y corte el mesencéfalo y el bulbo olfativo con un segundo par de pinzas, lo que da como resultado dos mitades corticales. A continuación, fije una mitad cortical con un par de pinzas y retire las meninges separándolas del borde lateral. Y posteriormente tirando de ella de la superficie cortical con un segundo par de pinzas.

Orienta la mitad cortical con la superficie hacia abajo. Disecciona y retira cuidadosamente el hipocampo en forma de media luna. A continuación, transfiera las cortezas a un tubo cónico de 15 ml.

Añadir un ml de denem y papaína al 0,1%wv a un tubo de reacción de 2 ml. Incubar la suspensión en un baño de agua a 37 grados centígrados hasta que la solución esté clara. Agregue L-cisteína y ADNasa a la mezcla y agite suavemente.

A continuación, filtre la mezcla para obtener un ml de solución estéril, luego agréguela al tejido cortical e incube durante 30 minutos a una hora a 37 grados centígrados. Para finalizar la reacción de digestión, agregue un ml de medio de astrocitos y titule cuidadosamente el tejido digerido. A continuación, añada cinco ml de medio de astrocitos a la suspensión celular.

Una vez que el tejido se haya disociado en una suspensión de una sola célula, centrifugarla durante cinco minutos. Después de eso, aspire el sobrenadante con cuidado del gránulo resultante y vuelva a suspender las células en un ml de medio de astrocitos. Añadir la suspensión celular a los matraces T75 repuestos con nueve ml de medio astrocito.

Después de siete días de cultivo, compruebe si las células han formado una monocapa confluente. Asegúrese de que la temperatura esté ajustada a 37 grados centígrados y que el filtro del matraz esté sellado con una película de laboratorio para evitar la evaporación del dióxido de carbono. Para deshacerse de las células progenitoras y obtener un cultivo puro de astrocitos, coloque los matraces T75 en un agitador orbital y agite los cultivos durante la noche a 250 rotaciones por minuto.

Al día siguiente, aspire el medio y agregue 10 ml de medio de cultivo fresco repuesto con 20 micromolares RSE para eliminar las células residuales en división. En este procedimiento, coloque tantos insertos como sea necesario en la placa de 24 pocillos. Cubrir cada inserto con 10 microgramos por ml de poli d'lisina e incubar durante una hora.

Después de una hora, lave los insertos dos veces con PBS. Mientras tanto, aspire el medio de astrocitos y lave el cultivo una vez con 10 ml de PBS para asegurarse de que se elimina el suero residual. A continuación, añada tres ml de EDTA de tripsina al 0,05% a los matraces e incube las células para la tripsinización durante aproximadamente 10 minutos.

Después, vuelva a suspender suavemente las células en siete ml de medio de astrocitos. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml y centrifugue durante cinco minutos a 216 x g. A continuación, aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de células en un ml de medio de astrocitos.

Cuente las celdas usando una cámara de conteo. Posteriormente, llene la placa de 24 pocillos con 500 microlitros de medio de astrocitos por pocillo. Aspirar el PBS y transferir 25.000 células y 500 microlitros de medio de astrocitos a cada inserto individual e incubar el cultivo a 37 grados centígrados.

Para diseccionar los hipocampos, prepare tres platos de 10 cm llenos de medio de preparación y un tubo de 2 ml con un ml de medio de preparación. Diseccionar los hipocampos de la corteza y recogerlos en un tubo de dos ml lleno de medio de preparación. Es fundamental que el hipocampo se aísle sin un tejido adyacente de otras regiones del SNC.

Por lo tanto, después de eliminar el hipocampo, los tejidos contaminantes extraños deben eliminarse adicionalmente. Después de la disección, transfiera el tubo a un banco de flujo laminar estéril. Retire el medio de preparación con cuidado y digiera el tejido del hipocampo de un ml de solución de digestión que contenga papaína.

Después de 15 minutos de digestión, retire con cuidado la solución de digestión succionándola suavemente con la pipeta. Debido a la alta sensibilidad de la neurona, es fundamental valorar el hipocampo con cuidado para evitar burbujas y obtener la intensidad óptima de titulación. Lave el hipocampo tres veces con medio neuronal agregando y aspirando cuidadosamente un ml de medio de cultivo fresco por ciclo de lavado.

Después del paso de lavado final, titule cuidadosamente el tejido en un ml de medio neuronal. A continuación, cuente las células utilizando una cámara de conteo. Coloque 35.000 células en 500 microlitros de medio neuronal por pocillo de la placa de 24 pocillos e incube las neuronas a 37 grados centígrados durante una hora.

Ahora saque de la incubadora los insertos preparados, que se han sembrado con monocapas de astrocitos confluentes. Cambie el medio aspirando el medio de astrocito y reemplazándolo con 500 microlitros de medio de neurona fresco. A continuación, coloque los insertos con astrocitos con cuidado en los pocillos que contienen los cultivos de neuronas utilizando pinzas estériles.

Posteriormente, vuelva a colocar el cocultivo de astrocitos de neuronas indirectas resultante en la incubadora hasta que se realicen los experimentos. Esta imagen muestra las monocapas formadas por astrocitos en la membrana del inserto de cultivo celular. Los astrocitos están inmunoteñidos para GFAP y MMP2.

El esquema aquí ilustra la configuración de cocultivo indirecto. Aunque dos culturas están físicamente separadas, comparten el mismo medio. Dos mediadores moleculares secretados de las interacciones de la glía neuronal se revelan en el medio de cocultivo utilizando Western blot con múltiples isoformas de TNC, un regulador absoluto del crecimiento y MMP2, un modificador de la matriz extracelular.

Esta imagen muestra que las neuronas primarias desarrollan redes altamente interconectadas en el día 14 de cultivo. La colocalización del fagot marcador presináptico con el andamiaje postsináptico PSD95 documenta la formación sináptica estructuralmente completada. En conclusión, utilizando nuestro sistema de ensayo hemos demostrado que es posible combinar astrocitos primarios y neuronas primarias en el modelo de cocultivo.

Ambos sobretipos están separados, pero comparten el mismo medio. Por lo tanto, también podemos investigar el secretoma de ambos tipos en nuestro modelo. En este modelo se desarrollan y maduran las sinapsis.

Y además, también podemos mostrar la aparición de estructuras específicas adicionales como las redes perineuronales. Por lo tanto, nuestro sistema modelo es muy adecuado para investigar la influencia de los astrocitos en la formación, plasticidad y función de las sinapsis.