Name: La indirecta neurona-astrocito Coculture Ensayo: Un In Vitro Puesta en marcha de la investigación detallada de las interacciones neurona-glía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Aprende el ensayo de cocultivo indirecto neurona-astrocito para estudiar interacciones neuron-glia in vitro usando membranas permeables. Este método permite analizar la formación sináptica durante cuatro semanas.

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El presente trabajo fue apoyado por la fundación de investigación alemana (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; la escuela de investigación de la Universidad del Ruhr Bochum (GSC98/1) y el programa prioritario SSP 1172 "Glia and Synapse", Fa 159/11-1,2,3).

Los experimentos con ratones estaban de acuerdo con la Ley Alemana y la Sociedad Alemana para la Neurociencia directrices de la cría de animales. Los comités de cuidado de los animales y la utilización de la Ruhr-Universität Bochum han concedido los permisos apropiados. 1. Preparación y cultivo de astrocitos corticales Nota: Complete estos pasos del protocolo de al menos 7 días antes de proceder a los pasos siguientes, ya que los cultivos de astrocitos deben desarrollar en monocapas confluentes se preparan antes de las neuronas. astrocitos primarios se derivan a partir de cultivos gliales mixtos obtenidos de crías de ratón de todo el día postnatal (P) 0-3. Tres cerebros (6 cortezas) por matraz T75 se van a utilizar. <ol><li> Preparar el medio de astrocitos completándolo medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% v / v de suero de caballo y 0,1% v / v de gentamicina en condiciones estériles. Almacenar el medio a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas. </li><li> Escudo 3x T75 frascos wiTH 10 mg / ml de poli-D-lisina (PDL; en el agua de cultivo celular de grado) durante al menos 1 h a 37 ° C en presencia de 6% v / v CO 2. Después del recubrimiento, lavar los frascos dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar los cationes no unidos, y añadir 9 ml medio de astrocitos. </li><li> Para la preparación de los cerebros, añadir solución salina equilibrada de 10 ml Hank (HBSS) a 1x 10 cm placa de Petri y 1 ml de HBSS a 1x 15 ml tubo (independientemente del número de los cerebros que se utilizará). Tenga un par de tijeras quirúrgicas, 2 pinzas finas y un binocular a su alcance para el procedimiento. </li><li> Decapitar a 3 crías rápidamente con las tijeras quirúrgicas y recoger las cabezas en un plato vacío de 10 cm. <ol><li> Realizar la preparación de la corteza bajo el binocular. El uso de dos pinzas finas, quitar la piel dorsal del cráneo en la línea media, comenzando desde el cuello hacia el nivel de los ojos. A partir de entonces, el cerebro con sus vasos sanguíneos es visible debajo del cráneo. </li><li>Fijar la cabeza en el extremo rostral con un par de pinzas y una incisión en la línea media del cráneo, comenzando en el extremo posterior. Posteriormente, recortar la derecha y las mitades izquierda del cráneo para exponer el cerebro. </li><li> Cierre la punta del fórceps y posicionarlo ventralmente bajo el cerebro. Levantar el cerebro fuera del cráneo y la transfiere en el HBSS-llenado 10 cm placa de Petri. Proceder de la misma manera con el modelo que faltan para que todos los cerebros se recogen en el plato. </li></ol></li><li> Después de recoger los cerebros, comenzar con la separación de las cortezas pellizcando fuera de la parte posterior del cerebro usando un par de pinzas, como un par de tijeras. Realizar una incisión en la línea media entre los dos hemisferios con un par de fórceps. Fije cuidadosamente el cerebro con una pinza y corte el mesencéfalo y los bulbos olfatorios utilizando un segundo fórceps para terminar con las mitades corticales. </li><li> Fijar la mitad cortical con un par de pinzas y pelar las meninges de los hemisferios por separarlos fesde el borde lateral y posteriormente tirando de ellas desde la superficie cortical utilizando un segundo fórceps. </li><li> Da la vuelta al medio cortical con su superficie orientada hacia el plato; diseccionar cuidadosamente y retire el hipocampo forma de media luna utilizando un par de pinzas. La transferencia de las cortezas individuales en el cónica tubo de 15 ml usando un fórceps cerrados para realizar una corteza individuo. </li><li> Después de recoger todas las cortezas, el tránsito a la campana de flujo laminar estéril y comenzar con los preparativos para la disociación del tejido cortical. </li><li> Añadir 1 ml de DMEM a un tubo de reacción 2 ml y añadir 0,1% w / v de papaína (30 unidades). Incubar la suspensión en un baño de agua a 37 ° C hasta una solución clarificada se desarrolla (aproximadamente 3 min). Añadir 0,24 mg / ml de L-cisteína y 20 mg / ml de DNAsa y agitar suavemente. NOTA: Para la digestión, se necesita aproximadamente 1 ml de solución de enzima. </li><li> Filtro (0,22 micras de tamaño de poro) para obtener 1 ml de solución estéril antes de añadirque en el tejido cortical. Incubar los tubos durante 30 min - 1 h a 37 ° C (es decir, en un baño de agua). NOTA: Los pasos 1.11 a 1.14 son críticos y deberían completarse dentro de 15 min. </li><li> Para terminar la reacción de digestión, añadir 1 ml de medio de astrocitos y se tritura cuidadosamente el tejido digerido usando una pipeta de 1 mL. Para la trituración, mueva suavemente el émbolo de la pipeta, la aspiración y la extrusión de la suspensión de tejido cortical de ese modo. </li><li> Una vez que el tejido ha sido disociado en una suspensión de una sola célula, añadir 5 ml de medio de astrocitos y centrifugar durante 5 min a 216 x g. </li><li> Aspirar el sobrenadante cuidadosamente del sedimento resultante y resuspender las células en 1 ml de medio de astrocitos. </li><li> Añadir las suspensiones de células a matraces T75 se repone con 9 ml de medio de astrocitos (véase 1.2). </li><li> Se incuban las células a 37 ° C en la incubadora en presencia de 6% v / v CO 2. Después de 4 días, lleve a cabo el primer cambio de medio completo (10 ml). A partir de entonces, cambiar el medio de cultivo cada 2 - 3 d. </li><li> Después de 7 días, comprobar si las células han formado una monocapa confluente. Si no es así, esperar otros 2 - 3 días hasta que se alcanza la confluencia completa de la cultura. NOTA: Los astrocitos muestran cuerpos de las células aplanadas grandes, localice en el fondo del matraz y no desarrollan procesos celulares notables. Se diferencian de las pequeñas células progenitoras brillantes de contraste de fase y microglia que residen en la parte superior de la monocapa 17. </li><li> Con el fin de deshacerse de las células progenitoras y obtener un cultivo de astrocitos pura, poner los matraces T75 en un agitador orbital y agitar las culturas O / N a 250 rpm. Asegúrese de que la temperatura se ajusta a 37 ° C y que el filtro del matraz se selló con película de laboratorio para evitar la evaporación del CO 2. </li><li> El día siguiente, aspirar el medio y añadir medio de cultivo fresco de 10 ml rellena con 20 M de citosina-1-β-D-arabinofuranósido (AraC) para Eliminacélulas que se dividen residuales TE. NOTA: la incubación con AraC para 2 - 3 d en la incubadora a 37 ° C, 6% de CO 2 resultará en un cultivo de astrocitos puro. </li><li> Vigilar la pureza de los cultivos de astrocitos mediante inspección visual bajo el microscopio óptico. Si contraste de fase residual brillante células progenitoras y microglia todavía residen en la parte superior de la monocapa de los astrocitos 17 (véase el paso 1.16), repita los pasos 1.18 y 1.19. NOTA: El confluentes y monocapas de astrocitos puros se pueden mantener durante un máximo de 14 días en la incubadora (37 ° C, v 6% v 2 CO /) antes de proceder al siguiente paso. Cambiar la mitad del medio cada 3 d. No se debe recoger, de congelación y descongelación de los astrocitos, ya que estas células pierden sus propiedades neuronales de apoyo a través del procedimiento de almacenamiento. </li></ol> 2. Los astrocitos se preparan para el cocultivo indirecto Nota: 48 - 72 h antes de preparar las neuronas, astrocitos transferencia a la cell-insertos de cultivo. Generalmente, un solo matraz T75 proporciona un número suficiente de células para apoyar los cultivos neuronales obtenidos con un preparado. <ol><li> Colocar tantas como sea necesario insertos en 24 pocillos de placas. Escudo cada inserto con 10 mg / ml PDL (disuelto en agua de cultivo celular de grado) por alrededor de 1 h a 37 ° C, 6% v / v CO 2. Después de la incubación, lavar las piezas de inserción dos veces con PBS. Mientras tanto, proceder a la preparación de los astrocitos. NOTA: Los insertos llenos de PBS se pueden mantener hasta que la suspensión de células de astrocitos está listo para su uso. </li><li> Aspirar el medio de astrocitos (con AraC) y lavar la cultura una vez con 10 ml de PBS para asegurar que se quite cualquier suero residual. </li><li> Añadir 3 ml de tripsina-EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) 0,05% a los matraces y se incuban las células durante tripsinización a 37 ° C, 6% v / v de CO2 durante aproximadamente 10 min. </li><li> Controlar el desprendimiento de las células por inspección visual usando un microscopio y FacilitaTA El desprendimiento de las células tocando el lado de los matraces contra el escritorio. NOTA: Los pasos 2.5 a 2.8 son críticos y deberían ser terminado dentro de 15 - 20 min. </li><li> Después de la tripsinización, suavemente volver a suspender las células en medio de astrocitos 7 ml y transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml. Centrifugar durante 5 min a 216 x g. </li><li> aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio de astrocitos. </li><li> Contar las células utilizando una cámara de recuento. </li><li> Llene el fondo de los pocillos de la placa de pocillos-24 con 500 l medio de astrocitos y la transferencia de 25.000 células en 500 l medio de astrocitos en cada inserto individual. Incubar el cultivo a 37 ° C, 6% v / v CO 2. NOTA: Tras recorrer 42 - 72 horas los cultivos alcanzarán aproximadamente el 100% de confluencia. En esta etapa la pureza del cultivo puede ser verificada mediante inmunohisto 11. Los cultivos confluentes se pueden mantener durante un máximo de 7 días hasta que proceder a lapróximo paso. Cambiar la mitad del medio cada 3 d. </li></ol> 3. Preparación de las neuronas del hipocampo primaria Nota: las neuronas del hipocampo de ratones primaria deben derivarse de E15.5 - E16 embriones de ratones embarazadas cronometrados. <ol><li> Preparar medio neurona (MEM con piruvato de sodio 10 mM, 0,1% w / v ovoalbúmina, 2% v / v B27 suplemento de medio, y 0,1% v / v de gentamicina (esterilizada por filtración)), y medio de preparación (HBSS con 0,6% w / v de glucosa y 10 mM HEPES (ácido 4- (2-hidroxietil) -1-ácido etanosulfónico piperazina)). Pre-calentamiento y pre-equilibrar el medio de neuronas en frascos de filtro a 37 ° C, 6% v / v de CO2. </li><li> Colocar los portaobjetos de vidrio (12 mm de diámetro) en los pocillos de 24 pocillos de placas (utilizar los cubreobjetos especiales, que tienen una muesca para el uso con insertos de cultivo celular). <ol><li> Escudo durante al menos 1 h con 15 mg / ml de poli-DL-ornitina en agua (cultivo celular de grado) a 37 ° C. Use por lo menos 500 l por pocillo para asegurar quelos cubreobjetos están completamente cubiertos. Lavar los pocillos dos veces con PBS. Deje el PBS en los pocillos hasta en placas las células. Asegúrese de que los pozos no se sequen. </li></ol></li><li> Para diseccionar los hipocampos, preparar 3x 10 cm platos llenos con medio de preparación y 1x tubo de 2 ml con 1 ml medio preparación. Preparar tijeras y 2 pinzas finas. </li><li> Sacrificar el ratón embarazadas por dislocación cervical, esterilizar el abdomen mediante lavado con 70% v / v de etanol, y abrir el abdomen con unas tijeras afiladas. Extirpar el útero de cuentas cuidadosamente con unas tijeras y transferir el órgano en 1x 10 cm plato lleno de medio de preparación. </li><li> A continuación, retire los embriones del útero. incisión cuidadosamente el útero y eliminar el amnios sin dañar los embriones mediante el uso de 2 fórceps. A partir de entonces, decapitar cada embrión con un par de tijeras y transferir las cabezas en un segundo plato 10 cm suministrado con medio de preparación. </li><li> Proceder a la preparación de los cabezales (similar a la preparación se describe en 1.4 hasta 1.7). <ol><li> Inmovilizar la cabeza con un par de pinzas y una incisión en el cráneo y la piel en la región del cuello cerca de la parte posterior del cerebro, perpendicular a la neuroeje. Use un segundo par de pinzas para levantar tanto el cráneo y la piel que cubre, y doblar la tapa del cráneo suave hacia el extremo rostral de la cabeza, exponiendo de esta manera el cerebro. </li><li> Con la ayuda de unas pinzas 2, separar el cerebro de la cavidad craneal. Para ello, cerca de 1 par de pinzas y separar el cerebro del cráneo a partir de los bulbos olfatorios y moviéndose hacia la parte posterior del cerebro. Recoge los cerebros en otra placa de 10 cm lleno de medio de preparación. </li></ol></li><li> Diseccionar los hipocampos de los restos de la corteza, como se describe anteriormente para la preparación de astrocitos (paso 1.6). Retire el hipocampo de cada hemisferio y recogerlas en el tubo de 2 ml lleno de medio de preparación. </li><li> Después de completar la disección, transferir el tubo a la cámara de flujo laminar estéril y Digest el tejido del hipocampo con 1 ml solución de digestión que contiene papaína. Preparar la solución de digestión como se describe en el paso 01.09 a 01.10, pero el uso MEM lugar DMEM. NOTA: Los pasos 3.9 a 3.12 son críticos y deben ser completado dentro de los 10 - 15 min. </li><li> Después de la terminación de la digestión, retirar cuidadosamente la solución de digestión por succión suave con una pipeta. </li><li> Lavar los hipocampos 3 veces con medio neuronal añadiendo secuencialmente y posteriormente aspirar cuidadosamente 1 ml de medio de cultivo fresco por ciclo de lavado. No centrifugar la suspensión celular. </li><li> Después de la etapa de lavado final, se tritura cuidadosamente el tejido en 1 ml medio de la neurona. </li><li> Contar las células usando una cámara de recuento y la placa 35.000 células en 500 l de medio neurona por un solo pocillo de una de 24 pocillos de la placa (la placa mencionada en 3.2). NOTA: Opcionalmente, una alícuota de células se puede contratinción con azul de tripán para evaluar la vitalidad de la preparación de células. Controlar la densidad de placas por inspección visualion utilizando el microscopio (típicamente 90 - 110 células por campo visual de un objetivo estándar 10X). </li><li> Colocar las neuronas en la incubadora a 37 ° C, 6% v / v de CO2 durante 1 h. </li><li> Publicar incubación, tomar las inserciones preparados (sembradas con monocapas confluentes de astrocitos) fuera de la incubadora (véase el paso 2.8). Intercambiar el medio por aspiración el medio de astrocitos y reemplazándolo con 500 l de medio fresco neurona. NOTA: Los insertos deben albergar monocapas de astrocitos confluentes después de 2 - 3 Días DIV (in vitro). </li><li> Coloque los insertos con astrocitos cuidadosamente en los pocillos que contienen los cultivos de neuronas (paso 3.13) usando pinzas estériles. </li><li> Coloque el cocultivo neurona-astrocito indirecta resultante de nuevo en la incubadora a 37 ° C, 6% v / v CO 2. NOTA: En estas condiciones, las neuronas pueden ser cultivadas para un máximo de 4 semanas en medio completamente definido. Ningún cambio medio es necesario. Para los cultivos de largo plazo, se recomienda llenar correopozos MPTY con agua estéril con el fin de reducir la evaporación de la placa de pocillos 24. </li><li> Realizar análisis in vitro de células de cultivo después de períodos deseado (por ejemplo, para inmunocitoquímica, PCR, Western blot, los registros electrofisiológicos de pinzamiento zonal (o matriz multielectrodo) 7,15,18). NOTA: El sistema de cultivo también es adecuado para el tratamiento farmacológico agudo y crónico de las culturas 11. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El objetivo principal del protocolo actual consiste en cultivos neuronales y los astrocitos completamente separados, mientras se mantiene en medio compartido. Por esta razón, la pureza de los cultivos obtenidos debe ser verificada en el comienzo del procedimiento. Se recomienda el uso de la tubulina específico de neuronas, o la proteína de neurofilamentos NeuN como marcadores neuronales, GFAP como marcador de los astrocitos, antígeno O4 como marcador precursor de oligodendrocitos y la proteína Iba1 para identificar la m...

A lo largo de las últimas décadas, la interpretación general de la función neuroglia ha evolucionado a partir de la atribución de un apoyo meramente hacia un papel regulador activo en relación con la función neuronal 1. Debido a su impacto importante en la homeostasis cerebral en salud y enfermedad 2, los astrocitos son de especial interés para la comunidad científica. En los últimos años, una diversidad de estudios se han centrado en las interacciones neurona-glía in vivo e in vitro 3. Sin embargo, la mayoría de los sistemas de cultivo no permiten el análisis separado de los dos tipos de células y de sus respectivos secretomas. Varios enfoques explotan el cocultivo directo de las neuronas y glía para lograr la supervivencia de larga duración y el desarrollo de la red neuronal fisiológicamente relevante 4-6. El presente protocolo alcanza los mismos objetivos, manteniendo ambos tipos de células separadas físicamente 7. En comparación con conditioned medio se aproxima a 8,9, nuestro sistema permite estudiar la comunicación bidireccional entre neuronas y astrocitos. La expresión de moléculas de señalización secretadas se puede monitorizar mientras que las células maduran en el medio compartido. Esta oportunidad es especialmente relevante, como astrocitos liberan factores solubles, tales como citoquinas, factores de crecimiento y moléculas de matriz extracelular 10,11, regulando de este modo el crecimiento neuronal y la función 7,12. Por lo tanto, se ha demostrado que la adición de trombospondina a las células ganglionares de la retina in vitro induce la formación de sinapsis 13. Sin embargo, otros factores desconocidos son necesarias para hacer sinapsis funcionales 13. Además, las moléculas liberadas por los astrocitos tienen que identificarse con el fin de comprender la base de las interacciones neurona-glía. El cultivo de las neuronas primarias y astrocitos de ratón y de rata se ha descrito previamente 14-16. Aquí nosotrospresentar una herramienta elegante y versátil para combinar ambos tipos de células en un enfoque cocultivo indirecto. Dado que las dos culturas se separan físicamente aún compartiendo el mismo medio, el impacto de las neuronas, astrocitos y las moléculas solubles, pueden ser analizados por separado, creando así una poderosa herramienta para estudios de interacciones neurona-glía.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado de cultivo celular</td><td>MilliQ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citosina-&#946;-D-arabinofuranósido (AraC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>PRECAUCIÓN: H317, H361</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (Life Technologies)&nbsp;</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>PRECAUCIÓN: H317-334</td></tr><tr><td></td><td>Glucosa Serva</td><td>22700</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>Biochrom AG</td><td>S9135</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2529</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>31095-029</td><td></td></tr><tr><td>Ovoalbúmina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7641</td><td>PRECAUCIÓN: H334</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td> hecho <td>a sí mismo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-plateas Thermoscientific</td><td>/Nunc</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos (para el cocultivo indirecto)</td><td>BD Falcon</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>binocular</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Insertos de cultivo celular</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga</td><td>Heraeus</td><td>Multifuge 3S-R</td><td></td>Cámara de</tr><tr><td>recuento</td><td>Marienfeld</td><td>650010</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>FST Dumont</td> <td>411254-20</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio (12&nbsp; mm)</td><td>Carl Roth (Menzel- Gl&auml; ser)</td><td>P231.1</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 240i</td><td></td></tr><tr><td>Microtubo (2 mL)</td><td>Microscopio Sarstedt</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td></td></tr><tr><td>Millex Unidad de filtro accionada por jeringa</td><td>Millipore SLGV013SL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4000</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri (10 cm)</td><td>Pipeta Sarstedt</td><td>833.902</td><td></td></tr><tr><td>(1 mL)</td><td>Gilson</td><td>Pipetman 1000</td><td></td></tr><tr><td>Banco de trabajo estéril</td><td>The Baker Company</td><td>Esterilizador de flujo laminarGARD III</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>FST Dumont</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Henry Schein</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>Matraz T75</td><td>Sarstedt</td><td>833.911.002</td><td></td></tr><tr><td>tubo (15 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>64.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>GFL</td><td>Baño de agua tipo 1004</td><td></td></tr></tbody></table>

la indirecta neurona-astrocito coculture ensayo: un<em&gt; in vitro</em&gt; puesta en marcha de la investigación detallada de las interacciones neurona-glía

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

el desarrollo neuronal y la función es el requisito previo del desarrollo como en el cerebro adulto. Sin embargo, los mecanismos que subyacen a la formación altamente controlada y mantenimiento de redes neuronales complejas no se entienden por completo hasta el momento. Las preguntas abiertas relativas a las neuronas en salud y la enfermedad son diversas y que va desde la comprensión del desarrollo de base a la investigación de patologías relacionadas con el hombre, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer y la esquizofrenia. El análisis más detallado de las neuronas se puede realizar in vitro. Sin embargo, las neuronas son células exigentes y necesitan el apoyo adicional de los astrocitos para su supervivencia a largo plazo. Esta heterogeneidad celular está en conflicto con el objetivo de diseccionar el análisis de las neuronas y astrocitos. Presentamos aquí un ensayo de cultivo celular que permite la co-cultivo a largo plazo de las neuronas y astrocitos primarios puros, que comparten el mismo medio químicamente definido, mientras que estar físicamenteapartado. En esta configuración, las culturas sobreviven durante un máximo de cuatro semanas y el ensayo es adecuado para una diversidad de investigaciones relativas a la interacción neurona-glía.

El análisis de los cultivos neuronales a través del sistema de cocultivo indirecto es múltiple y se puede realizar en diferentes etapas de la maduración de la cultura. Debido al hecho de que las células se pueden mantener durante un máximo de 4 semanas, son posibles investigaciones a largo plazo de los cultivos. El esquema en el panel central izquierda de la Figura 1 demuestra la configuración de cocultivo. Co...

Este protocolo describe el co-cultivo de neuronas-astrocito indirecta para el análisis de las interacciones neurona compartimentada-glia.

La indirecta neurona-astrocito Coculture Ensayo: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Puesta en marcha de la investigación detallada de las interacciones neurona-glía

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

El objetivo general de este Ensayo de Cocultivo Indirecto es investigar el impacto de los astrocitos en el desarrollo de las neuronas. Nuestro laboratorio está interesado en el papel de las interacciones neurona-glia. Se cree que los astrocitos contribuyen a la formación de las sinapsis, las estructuras de conexión del sistema nervioso central.Con el fin de estudiar su función, hemos diseñado un modelo in vitro en el que podemos combinar astrocitos primarios y neuronas embrionarias primarias en compartimentos separados. Los compartimentos están conectados por una membrana permeable, lo que permite analizar los intercambios entre ambos tipos celulares. Mediante este enfoque, hemos podido monitorear la formación de sinapsis durante períodos de hasta cuatro semanas.Además, es posible investigar los roles individuales de los astrocitos por un lado, y de las neuronas por otro, utilizando este ensayo. Y finalmente, también podemos investigar con mayor detalle el secretoma de nuestros compartimentos celulares, que contiene moléculas que median la influencia recíproca entre ambos compartimentos celulares en ese sistema. Este método puede proporcionar información sobre las interacciones entre neuronas y astrocitos.Además, puede aplicarse a otros organismos modelo, como las células de rata. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrían dificultades porque se requiere experiencia para obtener la operación óptima de maduración del tejido hipocampal después de la disección. Para diseccionar las cortezas, retire la piel del cráneo a lo largo de la línea media, comenzando desde el cuello hacia arriba hasta el nivel de los ojos.A continuación, sostenga la cabeza por el extremo rostral con un par de pinzas y realice una incisión a lo largo de la línea media del cráneo. Luego, retire con pinzas las mitades izquierda y derecha del cráneo para exponer el cerebro. Después, levante el cerebro del cráneo y transfiéralo a una placa de Petri de 10 cm llena con HBSS.Proceda de la misma manera con los especímenes restantes hasta que todos los cerebros sean recolectados en el recipiente. Para separar los cortices, pellizque la parte posterior con un par de pinzas. Realice una incisión en la línea media entre los dos hemisferios.Fije cuidadosamente el cerebro y corte el mesencéfalo y el bulbo olfatorio utilizando un segundo par de pinzas, lo que resulta en dos mitades corticales. A continuación, fije una mitad cortical con un par de pinzas y desprenda las meninges separándolas desde el borde lateral, y luego extráigalas de la superficie cortical utilizando un segundo par de pinzas.Oriente la mitad cortical con su superficie hacia abajo. Diseque cuidadosamente y retire el hipocampo con forma de media luna. Luego transfiera las cortezas a un tubo cónico de 15 ml.Agregue un ml de denem y papaina al 0,1 % p/v a un tubo de reacción de 2 ml. Incube la suspensión en un baño de agua a 37 grados Celsius hasta que la solución esté clara. Agregue L-cisteína y DNAasa a la mezcla y agite suavemente.Luego, filtre la mezcla para obtener un ml de solución estéril, añádala al tejido cortical e incube durante 30 minutos a una hora a 37 grados Celsius. Para detener la reacción de digestión, agregue un ml de medio para astrocitos y titule cuidadosamente el tejido digerido. Posteriormente, añada cinco ml de medio para astrocitos a la suspensión celular.Una vez que el tejido se haya disociado en una suspensión de células individuales, centrifúguelo durante cinco minutos. A continuación, aspire cuidadosamente el sobrenadante del pellet resultante y re-suspenda las células en un ml de medio para astrocitos. Añada la suspensión celular a los frascos T75 reabastecidos con nueve ml de medio para astrocitos.Después de siete días de cultivo, verifique si las células han formado una monocapa confluente. Asegúrese de que la temperatura se haya ajustado a 37 grados Celsius y de que el filtro del frasco esté sellado con película de laboratorio para prevenir la evaporación del dióxido de carbono. Con el fin de eliminar las células progenitoras y obtener un cultivo puro de astrocitos, coloque los frascos T75 en un agitador orbital y agite los cultivos durante la noche a 250 rotaciones por minuto.Al día siguiente, aspire el medio y agregue 10 ml de medio de cultivo fresco repuesto con 20 micromolares de RSE para eliminar las células residuales en división. En este procedimiento, coloque tantos insertos como sean necesarios en la placa de 24 pocillos. Recubra cada inserto con 10 microgramos por ml de poli-d-lisina e incube durante una hora.Después de una hora, lave los insertos dos veces con PBS. Mientras tanto, aspire el medio de los astrocitos y lave el cultivo una vez con 10 ml de PBS para asegurarse de que se elimine el suero residual. A continuación, agregue tres ml de tripsina-EDTA al 0,05 % a los frascos e incube las células durante aproximadamente 10 minutos para la tripsinización.Posteriormente, resuspenda suavemente las células en siete ml de medio para astrocitos. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml y centrifugue durante cinco minutos a 216 x g. Luego aspire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda el botón celular en un ml de medio para astrocitos.Cuente las células utilizando una cámara de recuento. Posteriormente, llene la placa de 24 pocillos con 500 microlitros de medio para astrocitos por pocillo. Aspire el PBS y transfiera 25.000 células y 500 microlitros de medio para astrocitos a cada inserto individual, e incube la cultura a 37 grados Celsius.Para diseccionar los hipocampos, prepare tres placas de 10 cm llenas con medio de preparación y un tubo de 2 ml con un ml de medio de preparación. Diseccione los hipocampos del cortex noyadees y recójalos en un tubo de 2 ml lleno con medio de preparación. Es fundamental que los hipocampos sean aislados sin tejido adyacente de otras regiones del SNC.Por lo tanto, tras extraer el hipocampo, deben eliminarse adicionalmente los tejidos contaminantes externos. Después de la disección, transfiera el tubo a una cabina de flujo laminar estéril. Retire cuidadosamente el medio de preparación y digiera el tejido hipocampal con un ml de solución de digestión que contenga papaína.Después de 15 minutos de digestión, retire cuidadosamente la solución de digestión mediante succión suave con la pipeta. Debido a la alta sensibilidad de las neuronas, es fundamental titular cuidadosamente el hipocampo para evitar burbujas y lograr la intensidad óptima de titulación. Lave los hipocampos tres veces con medio neuronal añadiendo y aspirando cuidadosamente un ml de medio de cultivo fresco por cada ciclo de lavado.Después del último paso de lavado, titular cuidadosamente el tejido en un ml de medio para neuronas. Luego, contar las células utilizando una cámara de recuento. Sembrar 35.000 células en 500 microlitros de medio para neuronas por pocillo de una placa de 24 pocillos e incubar las neuronas a 37 grados Celsius durante una hora.Ahora tome los insertos preparados, que han sido sembrados con monocapas de astrocitos confluentes, fuera del incubador. Cambie el medio aspirando el medio de los astrocitos y reemplazándolo con 500 microlitros de medio fresco para neuronas. Luego, coloque cuidadosamente los insertos con astrocitos en los pocillos que contienen los cultivos de neuronas utilizando pinzas estériles.Posteriormente, coloque el cultivo celular cocultivado indirecto de neuronas y astrocitos resultante de nuevo en el incubador hasta los experimentos. Esta imagen muestra las monocapas formadas por astrocitos sobre la membrana del inserto para cultivo celular. Los astrocitos están inmunomarcados para GFAP y MMP2.El esquema ilustra el montaje de cocultivo indirecto. Aunque dos cultivos están físicamente separados, comparten el mismo medio. Dos mediadores moleculares secretados de las interacciones neuronales y gliales se revelan en el medio de cocultivo mediante blot de Western con múltiples isoformas de TNC, un regulador directo del crecimiento, y MMP2, un modificador de la matriz extracelular.Esta imagen muestra que las neuronas primarias desarrollan redes altamente interconectadas para el día 14 del cultivo. La co-localización del marcador presináptico bassoon con el andamiaje postsináptico PSD95 documenta la formación sináptica estructuralmente completa. En conclusión, utilizando nuestro sistema de ensayo, hemos demostrado que es posible combinar astrocitos primarios y neuronas primarias en el modelo de cultivo conjunto.Ambos surtipos están separados pero comparten el mismo medio. Por lo tanto, también podemos investigar el secretoma de ambos surtipos en nuestro modelo. En este modelo, las sinapsis se desarrollan y maduran.Además, también podemos mostrar la aparición de estructuras específicas adicionales, como las redes perineuronales. Por lo tanto, nuestro sistema de modelo es muy adecuado para investigar la influencia de los astrocitos en la formación, plasticidad y función de las sinapsis.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este artículo describe un nuevo protocolo y el reactivo conjunto diseñado para la medición sensible de los efectos neurotóxicos de los compuestos y los tratamientos en co-cultivos de neuronas y astrocitos utilizando el análisis de contenido de alta. Los resultados demuestran que el análisis de contenido de alta tecnología representa una apasionante novela para la evaluación de la neurotoxicidad.

A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad

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Estudio de células gliales Influencia heterogeneidad de crecimiento de los axones se utiliza un método co-cultivo de Nueva

Aquí les ofrecemos un protocolo para el cultivo de neuronas de rata cortical en presencia de una capa alimentadora glial. Los cultivos de neuronas de establecer la polaridad y la creación de sinapsis, y se puede separar de la glía para su uso en diversas aplicaciones, tales como la electrofisiología, imágenes de calcio, los ensayos de supervivencia de las células, inmunocitoquímica, y ADN / ARN / aislamiento de las proteínas.

Bilaminar Co-cultivo de neuronas de rata primaria cortical y la glía

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Análisis de imágenes de Neuron a la interacción glía en la Plataforma Cultura Microfluidic (MCP)-basada en Axón Neuronal y Sistema Glia Co-cultura

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Una técnica de cocultivo indirecto neurona-astrocito para estudiar las interacciones neurona-glía

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Un método de cocultivo para modelar las interacciones neurona-oligodendrocito

Este video demuestra el establecimiento de un cocultivo neurona-astrocito para registrar la actividad de la red neuronal. Al establecer el cocultivo de neuronas motoras y astrocitos en una placa de matriz de electrodos múltiples (MEA), la actividad eléctrica rítmica sincrónica de la red neuronal se registró extracelularmente utilizando el MEA.

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Este video demuestra la evaluación de la actividad eléctrica neuronal en un cocultivo de neuronas glutamatérgicas corticales derivadas de hiPSC y células de glioma utilizando un dispositivo microfluídico con matrices de electrodos múltiples.

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En este protocolo, nuestro objetivo es describir un método reproducible para combinar disociado humanas pluripotentes células madre derivadas neuronas y astrocitos juntos en 3D esfera cocultures, mantener estas esferas en condiciones flotantes libres y posteriormente medición de la actividad de circuito sináptico de las esferas con inmunoanálisis y matriz micropozo-microcanal grabaciones.

Microcircuito sináptica modelado con 3D Cocultures de astrocitos y neuronas de células madre pluripotentes humanas

Aquí, presentamos un enfoque simple utilizando medios de cultivo específicos que permiten el establecimiento de culturas enriquecidas con neuronas y astrocitos, o cultivos de neurona-glia de la corteza embrionaria, con alto rendimiento y reproducibilidad.

Un modelo de cultivo celular para estudiar el papel de las interacciones de neuronas y glia en isquemia

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Generación y cocultivo de microglía primaria murina y neuronas corticales

Aprende el ensayo de cocultivo indirecto neurona-astrocito para estudiar interacciones neuron-glia in vitro usando membranas permeables. Este método permite analizar la formación sináptica durante cuatro semanas.

La indirecta neurona-astrocito Coculture Ensayo: Un In Vitro Puesta en marcha de la investigación detallada de las interacciones neurona-glía (Video) | JoVE Journal

La indirecta neurona-astrocito Coculture Ensayo: Un

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