Virus Zika Sistema infecciosa cultivo celular y la

El objetivo general de este estudio es establecer un sistema de cultivo infeccioso in vitro basado en células de mamífero para el virus del Zika, con el fin de investigar la replicación del virus, así como utilizar la plataforma in vitro para el desarrollo de fármacos. Este protocolo detallado paso a paso del sistema de cultivo celular infeccioso por el virus del Zika puede ayudar a esclarecer el mecanismo de la patogénesis inducida por el virus del Zika y la evolución de la virulencia viral. La principal ventaja de esta técnica es que permite la producción a gran escala del virus del Zika para el desarrollo de fármacos y vacunas.

Comience por cosechar las células Vero al 80 % de densidad celular en un matraz de cultivo T75 aspirando el medio del matraz y lavando las células con dos mililitros de solución salina tamponada con fosfato. Añada dos mililitros de tripsina al 0,25 % e incube el matraz a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Tras la incubación, añada ocho mililitros de medio de crecimiento con suero para inactivar la tripsina. A continuación, transfiera las células a un tubo de 15 mililitros. Luego, retire 10 microlitros de células y mézclelos con una cantidad igual de azul de tripano al 0,4 %. Cargue la mezcla preparada en la cámara de recuento de células y determine el número de células viables mediante un contador automático de células. Siembre un total de siete millones de células en un matraz T160 en un volumen de 30 mililitros. Al día siguiente, prepare una multiplicidad de infección adecuada del inóculo del virus Zika en 10 mililitros de medio de cultivo sin suero por matraz.

El manejo seguro del virus es fundamental para prevenir la propagación de la infección.

Retire el medio gastado del matraz T160 y luego agregue los 10 mililitros completos del inóculo viral recién preparado. Incube los matraces inoculados a 37 grados Celsius con 5%CO2 durante cuatro a seis horas. Distribuya el inóculo inclinando suavemente el matraz lateralmente cada hora durante la incubación. Al finalizar la incubación, reemplace el inóculo con 30 mililitros de medio de crecimiento tibio suplementado con suero. A continuación, continúe el cultivo viral durante las siguientes 96 horas. Después de cuatro días, verifique la progresión de la infección observando la aparición de placas virales en la monocapa celular, utilizando un microscopio de contraste de fases. Tome imágenes según sea necesario a 40x y 200x de aumento.

Recolecte los sobrenadantes del cultivo celular en el punto temporal de 96 horas y centrifugue el sobrenadante a 300 veces G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius para eliminar los restos celulares. Después de la centrifugación, retire cuidadosamente los sobrenadantes sin perturbar los restos sedimentados y transfiéralos a tubos de 15 mililitros.

Guarde los sobrenadantes de cultivo viral en múltiples alícuotas a menos 80 grados Celsius.

Para titular el virus, siembre primero células Vero ingenuas en una placa de 12 pocillos a una concentración de un por diez a la quinta células por pocillo, en un volumen de dos mililitros. Al día siguiente, prepare diluciones seriadas diez veces del sobrenadante de cultivo viral, recolectado del frasco T160 utilizando medio sin suero.

Al preparar diluciones seriadas del sobrenadante de cultivo viral para ácidos de titulación, asegúrese de manipular el virus de forma segura para prevenir infecciones.

A continuación, retire el medio gastado de cada pocillo de la placa de 12 pocillos que contiene células Vero, y agregue 400 microlitros del inóculo diluido sobre las células Vero en triplicado. Incube las placas inoculadas en el incubador de cultivo de tejidos durante cuatro a seis horas.

Al final de la incubación, reemplace el inóculo con dos mililitros de medio suplementado con suero por pocillo. A las 48 horas posteriores a la inoculación, cuente las focos virales a las diluciones apropiadas, utilizando un microscopio de contraste de fases. Calcule la titulación viral como unidades formadoras de placas por mililitro.

Después de inocular células Vero en una placa de 12 pocillos con títulos altos y bajos del virus del Zika, e incubar durante 48 y 96 horas, se evalúa la replicación del genoma mediante PCR cuantitativa para detectar la expresión del genoma del virus del Zika y mediante inmunocitoquímica para el ARN de doble cadena.

Para inmunocitoquímica, retire el medio de los pocillos de la placa de 12 pocillos y agregue un mililitro de metanol a cada pocillo. Deje que las células se fijen a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. A continuación, lave las células fijadas tres veces con PBS 1x. Luego agregue el tampón de bloqueo e incube durante una hora a temperatura ambiente. Diluya el anticuerpo monoclonal de ratón anti-RNA de doble cadena J2 uno a 100 en el tampón de bloqueo, añádalo a las células e incube las células en esta solución durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, diluya el anticuerpo secundario de cabra anti-ratón IgG-594 uno a 1.000 en tampón de bloqueo, y tras lavar las células con PBS 1x, añádalo a las células e incube durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar las células con PBS 1x, tiña los núcleos utilizando el colorante Hoechst y observe las células mediante un microscopio de fluorescencia con un aumento de 100x.

Seis horas después de sembrar una placa de 12 pocillos con células Vero ingenuas, como antes, agregue las citocinas de interés a las concentraciones indicadas en duplicados biológicos. Doce horas después del tratamiento, realice la infección con el virus Zika e incluya pocillos de control negativo sin infección. Cuatro horas después de la infección, sustituya el inóculo viral por medio tratado con citocinas e incube las células a 37 grados Celsius durante 44 horas adicionales. A las 48 horas postinfección, cuente las placas virales utilizando un microscopio de contraste de fases y obtenga imágenes representativas de las células infectadas a un aumento de 40x.

Este gráfico muestra el contenido genómico del virus del Zika medido mediante RT-qPCR. Los cebadores del genotipo Pan y de la cepa PRVABC-59 mostraron igual sensibilidad y especificidad. Como era de esperar, los cebadores virales del virus de la hepatitis C no amplificaron ningún producto.

Cinética de crecimiento viral del Zika en los puntos de tiempo indicados en células infectadas con título bajo y alto, en comparación con el control mock no infectado, se muestra aquí. Los resultados del ensayo de inmunocitoquímica muestran que a las 48 horas post-infección, las células infectadas se encuentran en algunos cúmulos, mientras que a las 96 horas post-infección, la mayoría de las células están infectadas. Este gráfico muestra la modulación del crecimiento viral del Zika por diversas citocinas, en comparación con el control de vehículo.

Estas imágenes de contraste de fase muestran células infectadas con el virus del Zika con o sin tratamiento con citocinas. Las placas virales formadas por células infectadas pueden observarse como focos. Obsérvese que los pocillos tratados con interferón no presentan placas virales.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el mapeo de alta resolución de dominios del virus del Zika para la localización de proteínas virales y la replicación en células de mosquito y humanas, con el fin de responder preguntas adicionales, tales como la elucidación del mecanismo de patogénesis de la enfermedad y la evolución de la virulencia viral. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo establecer un sistema de cultivo infeccioso in vitro basado en células de mamífero para el estudio de la replicación del virus del Zika, así como del uso de la plataforma in vitro para el desarrollo de fármacos y vacunas.