Las cápsulas de origen vegetal extracción de microencapsulación para Aplicaciones

El objetivo general de este procedimiento es establecer un proceso optimizado para extraer cápsulas de exina de esporopolenina, o SEC, para aplicaciones de microencapsulación. Este método puede proporcionar rápidamente microcaptura limpia para aplicaciones alimentarias y de salud. La ventaja principal de esta técnica es que el tiempo del proceso de extracción de SEC puede reducirse significativamente para producir SEC limpias e intactas.

Aunque este método puede ofrecer información sobre el proceso de extracción simplificado de la SEC y una caracterización paso a paso exhaustiva, también puede utilizarse para explorar evaluaciones fundamentales de la microestructura y la morfología de diferentes biomateriales de origen vegetal. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido al proceso convencional de extracción de 8 a 10 días, que implica ácidos altamente corrosivos a temperaturas elevadas. Para comenzar este procedimiento, prepare un sistema de reflujo en una campana extractora con un condensador de vidrio, un sistema de circulación de agua y un baño de agua.

Dado que el proceso de extracción por SEC implica el uso de ácidos altamente corrosivos y solventes orgánicos, debe realizarse con el equipo de protección personal adecuado, como gafas, bata de laboratorio, mascarilla facial y guantes, además de notificación de peligro. Pese cuidadosamente 100 gramos de esporas de L clavatum sin generar polvo y lejos de cualquier fuente de ignición. Luego, transfiera lentamente las esporas a un matraz redondo de un litro de PTFE con una barra de agitación magnética.

Agregue 500 mililitros de acetona a las esporas y agite suavemente el matraz para formar una suspensión homogénea. Coloque ahora el matraz en un baño de agua ajustado a 50 grados Celsius y conectado al condensador de reflujo. Caliente la suspensión a reflujo durante seis horas con agitación a 200 RPM.

Después de dejar que la suspensión se enfríe a temperatura ambiente, filtre mediante papel de filtro al vacío y recoja las esporas desengrasadas en placas de Petri de vidrio grandes. Seque las esporas a temperatura ambiente cubriendo las placas de Petri con papel de aluminio perforado para permitir la evaporación del disolvente. Después de transferir las esporas secas y desengrasadas a un matraz de PTFE de un litro, agregue 500 mililitros de solución de ácido fosfórico al 85 %.

Coloque el matraz en un baño de agua ajustado a 70 grados Celsius y conéctelo al condensador de reflujo. Caliente la suspensión a reflujo durante 30 horas con agitación. Una vez que la suspensión se haya enfriado a temperatura ambiente, dilúyala con 500 mililitros de agua desionizada tibia y recoja los SEC mediante filtración al vacío utilizando papel de filtro.

A continuación, transfiera las SEC a un vaso de vidrio de tres litros para realizar una serie de lavados. En la campana extractora, agregue 800 milímetros de agua desionizada caliente a las SEC y agite suavemente durante 10 minutos. Luego, filtre la suspensión utilizando papel de filtro bajo vacío.

Transfiera las SEC a un vaso de vidrio limpio de tres litros. Después de repetir los pasos anteriores cinco veces, agregue 600 mililitros de acetona caliente a las SEC y agite suavemente durante 10 minutos. Recoja las SEC mediante filtración al vacío y transfiéralas a un vaso de vidrio limpio de tres litros.

Después de repetir los pasos anteriores con los disolventes adecuados, transfiera las SEC limpias a seis placas de Petri grandes de vidrio y séquelas en una campana extractora a temperatura ambiente durante 24 horas para eliminar toda el agua. A continuación, seque las SEC en una estufa al vacío a 60 grados Celsius y un milibar de vacío durante 10 horas, o hasta que alcancen peso constante. Luego, transfiera las SEC secas a un frasco de polipropileno para su almacenamiento en un armario seco.

Prepare 1,2 mililitros de una solución de Albúmina Sérica Bovina, o BSA, en agua desionizada y transfiérala a un tubo de polipropileno de 50 mililitros. Añada 150 miligramos de SECs a la solución de BSA. Vortexee la mezcla durante 10 minutos para formar una solución homogénea.

Después de cubrir el tubo con papel de filtro, transfiéralo a un frasco de liofilizador y séquelo durante cuatro horas con vacío a un milibar. Una vez que los SEC cargados con BSA estén secos, retire los aglomerados con un mortero y un pistilo. A continuación, transfiera los SEC cargados con BSA a un tubo de 50 mililitros y agregue dos mililitros de agua desionizada para eliminar el BSA residual.

Recolecte las SEC mediante centrifugación a 4.704 ×g durante cinco minutos. Una vez finalizado, deseche el sobrenadante. Repita la lavado con agua desionizada.

A continuación, cubra el tubo que contiene los SEC cargados con BSA con papel de filtro. Luego, transfiera los SEC a un congelador durante una hora. Liofilice los SEC durante 24 horas.

Almacene los SEC en el congelador hasta su posterior caracterización. Utilice cinco miligramos de los SEC cargados con BSA en un tubo de polipropileno de dos mililitros. Añada 1,4 mililitros de PBS y mezcle por vortex durante cinco minutos.

A continuación, sonicar la suspensión con sonda al 40 % de amplitud durante tres ciclos de diez segundos. Una vez finalizado, filtrar la solución utilizando un filtro de politetrafluoroetileno de 0,45 micrómetros. Después de realizar los pasos anteriores con los SEC de placebo, medir la absorbancia de los SEC cargados con BSA a 280 nanómetros utilizando el placebo como blanco.

Finalmente, cuantifique la cantidad de BSA encapsulada utilizando una curva patrón de BSA en PBS. Las imágenes de SEM indican esporas intactas con una microestructura única y, antes del procesamiento, se observaron orgánulos esporoplásmicos a escala micrométrica en la imagen de sección transversal. Con la desgrasación de las esporas y el tratamiento alcalino, no se observaron cambios morfológicos ni estructurales.

Las imágenes de SEM tras la acidólisis muestran SECs intactos, carentes de materiales esporoplásmicos. No se observa una eliminación sustancial de materiales proteicos en los SECs desengrasados y tratados con álcali mediante análisis CHN. La mayoría de los materiales proteicos se elimina con la acidólisis.

El análisis DIPA muestra la distribución uniforme del tamaño de las SEC tras la acidólisis durante hasta 30 horas. La integridad estructural de las SEC disminuye con una acidólisis prolongada. Los datos de MEB y DIPA muestran que tras el paso de desengrase, la acidólisis produjo SEC intactas con una distribución de tamaño uniforme.

Los datos de CLSM indican que las SEC no tratadas presentan autofluorescencia debido a los constituyentes del esporoplasma dentro de la cavidad de la espora. Tras la acidólisis, todos los contenidos esporoplásmicos son eliminados. Después de la encapsulación de FITC-BSA, se observa fluorescencia verde dentro de las SEC.

Las imágenes de SEM muestran microarrugas intactas tras la carga de BSA. No se observaron cambios sustanciales en el diámetro, circularidad ni relación de aspecto tras la carga de BSA en las SEC. La cuantificación de BSA a partir de SEC encapsuladas confirma la consistencia del proceso de microencapsulación, con una carga de 0.170 más o menos 0.01 gramos de BSA por gramo de SEC.

Una vez dominado, este proceso simplificado de extracción por SEC puede realizarse en 48 horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento con esporas y polen de diversas plantas, es importante recordar la evaluación paso a paso del análisis morfológico estructural y elemental para obtener cápsulas intactas y limpias. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros procesos de extracción que involucren enzimas alcalinas con el fin de comprobar la viabilidad del proceso optimizado para cápsulas derivadas de diversas plantas.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la microencapsulación, la administración de fármacos y la ingeniería de tejidos exploraran diversos SEC de origen vegetal como biomateriales de próxima generación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer y caracterizar SEC a partir de esporas y granos de polen vegetales, así como de cómo realizar la encapsulación de fármacos y biomacromoléculas en SEC.