Las cápsulas de origen vegetal extracción de microencapsulación para Aplicaciones

El objetivo general de este procedimiento es establecer un proceso simplificado para extraer cápsulas de esporopolenina y exina, o SEC, para aplicaciones de microencapsulación. Este método puede proporcionar rápidamente una microcaptura limpia para aplicaciones alimentarias y sanitarias. La principal ventaja de esta técnica es que el tiempo del proceso de extracción de SEC se puede reducir significativamente para producir SEC limpios e intactos.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el proceso de extracción simplificado de la SEC y una amplia caracterización por pasos, también se puede utilizar para explorar evaluaciones microestructurales y morfológicas fundamentales de diferentes biomateriales de origen vegetal. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido al proceso de extracción convencional de 8 a 10 días, que involucra ácidos altamente corrosivos a temperaturas elevadas. Para comenzar este procedimiento, prepare una configuración de reflujo en una campana extractora con un condensador de vidrio, un sistema de circulación de agua y un baño de agua.

Dado que el proceso de extracción SEC implica el uso de ácidos altamente corrosivos y solventes orgánicos, el proceso debe realizarse con el equipo de protección personal adecuado, como gafas, bata de laboratorio, mascarilla y guantes con notificación de peligro. Pese cuidadosamente 100 gramos de esporas de L clavatum sin crear polvo y lejos de cualquier fuente de ignición. Luego, transfiera lentamente las esporas a un matraz de fondo redondo de PTFE de un litro con una varilla de agitación magnética.

Agregue 500 mililitros de acetona a las esporas y agite suavemente el matraz para formar una suspensión homogénea. Ahora coloque el matraz en un baño de agua a 50 grados centígrados y conectado al condensador de reflujo. Caliente la suspensión para que refluya durante seis horas agitando a 200 RPM.

Después de dejar que la suspensión se enfríe a temperatura ambiente, fíltrela con papel de filtro al vacío y recoja las esporas desgrasadas en placas de Petri de vidrio grandes. Seque las esporas a temperatura ambiente cubriendo las placas de Petri con papel de aluminio con orificios para la evaporación del solvente. Después de transferir las esporas secas secas y desgrasadas a un matraz de PTFE de un litro, agregue 500 mililitros de solución de ácido fosfórico al 85%.

Coloque el matraz en un baño de agua a 70 grados centígrados y conéctelo al condensador de reflujo. Caliente la suspensión para que refluya durante 30 horas con agitación. Una vez que la suspensión se haya enfriado a temperatura ambiente, dilúyala con 500 mililitros de agua desionizada tibia y recoja los SEC por filtración al vacío con papel de filtro.

Después de esto, transfiera los SEC a un vaso de precipitados de vidrio de tres litros para realizar una serie de lavados. En la campana extractora, agregue 800 milímetros de agua desionizada caliente a los SEC y revuelva suavemente durante 10 minutos. A continuación, filtre la suspensión con papel de filtro al vacío.

Transfiera los SEC a un vaso de vidrio limpio de tres litros. Después de repetir los pasos anteriores cinco veces, agregue 600 mililitros de acetona caliente a los SEC y revuelva suavemente durante 10 minutos. Recoja los SEC por filtración al vacío y transfiéralos a un vaso de precipitados de vidrio limpio de tres litros.

Después de repetir los pasos anteriores con los disolventes adecuados, transfiera los SEC limpios a seis placas de Petri de vidrio grandes y séquelas en una campana extractora a temperatura ambiente durante 24 horas para eliminar toda el agua. A continuación, seque los SEC en un horno de vacío a 60 grados centígrados y un milibar de vacío durante 10 horas, o hasta que el peso esté constante. Luego, transfiera los SEC secos a una botella de polipropileno para almacenarlos en un gabinete seco.

Prepare 1,2 mililitros de una solución de albúmina sérica bovina, o BSA, en agua desionizada y transfiérala a un tubo de polipropileno de 50 mililitros. Agregue 150 miligramos de SEC a la solución BSA. Agite la mezcla durante 10 minutos para formar una solución homogénea.

Después de cubrir el tubo con papel de filtro, transfiéralo a un matraz de liofilizador y seque durante cuatro horas al vacío a un milibar. Una vez que los SEC cargados con BSA estén secos, retire los aglomerados con un mortero. Ahora transfiera los SEC cargados con BSA a un tubo de 50 mililitros y agregue dos mililitros de agua desionizada para eliminar el BSA residual.

Recoja los SEC por centrifugación a 4, 704 durante cinco minutos. Cuando termine, deseche el sobrenadante. Repetir el lavado con agua desionizada.

A continuación, cubra el tubo que contiene los SEC cargados con BSA con papel de filtro. Luego, transfiera los SEC a un congelador durante una hora. Liofiliza los SEC durante 24 horas.

Guarde los SEC en el congelador hasta su posterior caracterización. Utilice cinco miligramos de los SEC cargados con BSA en un tubo de polipropileno de dos mililitros. Agregue 1,4 mililitros de PBS y vórtice durante cinco minutos.

A continuación, sondee la suspensión al 40% de amplitud durante tres ciclos de diez segundos. Cuando termine, filtre la solución con un filtro de polietersulfona de 0,45 micras. Después de realizar los pasos anteriores con los SEC placebo, mida los absorbentes de los SEC cargados con BSA a 280 nanómetros utilizando placebo como blanco.

Por último, cuantifique la cantidad de BSA encapsulada utilizando una curva estándar de BSA en PBS. Las imágenes SEM indican esporas intactas con una microestructura única y, antes del procesamiento, se observaron orgánulos esporoplásmicos a escala micrométrica en la imagen transversal. Con el desgrasado de esporas y el tratamiento con álcalis, no se observaron cambios morfológicos y estructurales.

Las imágenes SEM después de la acidólisis muestran SECs intactas desprovistas de materiales esporoplásmicos. No se observa una eliminación sustancial de material proteico en las SEC desgrasadas y tratadas con álcali mediante análisis de CHN. La mayoría de los materiales proteicos se eliminan con acidólisis.

El análisis DIPA muestra la distribución uniforme del tamaño de los SEC después de la acidólisis durante un máximo de 30 horas. La integridad estructural de SEC disminuye con la acidólisis prolongada. Los datos de SEM y DIPA muestran que después de la etapa de desgrasado, la acidólisis produjo SEC intactas con una distribución de tamaño uniforme.

Los datos de CLSM indican que las SEC no tratadas exhiben autofluorescencia debido a los constituyentes del esporoplasma dentro de la cavidad de la espora. Después del procesamiento de acidólisis, solo se eliminan todos los contenidos esporoplásmicos. Después de la encapsulación de FITC-BSA, se observa una florescencia verde dentro de las SEC.

Las imágenes SEM muestran microcrestas intactas después de la carga de BSA. No se observaron cambios sustanciales en el diámetro, la circularidad y la relación de aspecto después de la carga de BSA en SEC. La cuantificación de BSA a partir de SEC encapsulados confirma la consistencia del proceso de microencapsulación con 0,170 más o menos 0,01 gramos de carga de BSA por gramo de SEC.

Una vez dominado, este proceso simplificado de extracción de SEC se puede realizar en 48 horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento para varias esporas de plantas y polen, es importante recordar la evaluación paso a paso del análisis morfológico y elemental estructural para lograr cápsulas intactas y limpias. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros procesos de extracción con enzimas alcalinas para comprobar la viabilidad del proceso optimizado para diversas cápsulas de origen vegetal.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la microencapsulación, la administración de fármacos y la ingeniería de tejidos exploraran diversas SEC de origen vegetal como biomateriales de próxima generación. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo extraer y caracterizar SEC de esporas de plantas y granos de polen, así como realizar la encapsulación de medicamentos y biomacromoléculas en SEC.