Un nuevo método para el análisis cualitativo multi-escala de biopelículas bacterianas en filamentosa fúngica Colonias Utilizando microscopía confocal y electrónica

El objetivo general de este protocolo es utilizar la microscopía para analizar la formación de biopelículas bacterianas en hifas filamentosas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología, como cómo se forman las biopelículas bacterianas en las hifas, qué tan específicas son y de qué están hechas. La principal ventaja de esta técnica es que permite investigar la formación de biopelículas bacterianas en hifas fúngicas a múltiples escalas, desde el rango nanométrico hasta el centímetro.

La demostración del procedimiento correrá a cargo de Cora Miquel Guennoc, de mi laboratorio, y Christophe Rose, ingeniero de microscopía electrónica de la plataforma PTEF del INRA. Para comenzar, prepare membranas de celofán con el mismo diámetro que las placas de Petri, luego colóquelas en EDTA hirviendo durante 30 minutos. Luego use agua desionizada para enjuagar las hojas y autoclavelas dos veces.

Para preparar precultivos de hongos, inocule el hongo en medio de agar, cubierto con una membrana de celofán pretratada con EDTA. Incubar los cultivos a temperatura óptima para obtener colonias de aproximadamente un centímetro de diámetro. Desde el precultivo, se inocula una placa de Petri con un medio de agar apropiado, cubierta con la membrana de celofán EDTA mediante el uso de un bisturí para rascar suavemente el área externa de una colonia de precultivo, y luego se transfieren las hifas a la placa de agar.

Incubar las placas a temperatura óptima hasta que las colonias tengan aproximadamente un centímetro de diámetro. Para preparar cultivos bacterianos como P. fluorescens BBc6, use un asa estéril para recolectar dos o tres colonias bacterianas individuales del medio de agar e inocule 25 mililitros de LB. Incubar el cultivo a una temperatura óptima durante la noche. Después de cultivar las bacterias durante la noche, centrifugar el cultivo a 5.000 veces g durante tres minutos.

Y luego suspenda el pellet en 25 mililitros de tampón estéril de fosfato de potasio 0,1 molar. Después de repetir la centrifugación, use el mismo tampón para ajustar la concentración bacteriana final a 10 a la novena celda por mililitro. Llene una microplaca de seis pocillos con cinco mililitros de la suspensión bacteriana.

Use una hoja de afeitar estéril para cortar la membrana de celofán del cultivo de hongos en cuadrados, con una sola colonia en cada membrana. Luego, con pinzas, retire con cuidado los cuadrados de celofán que contienen hifas del medio sólido y transfiéralos a pocillos individuales de la suspensión bacteriana. Agite suavemente la microplaca hasta que las colonias de hongos se desprendan del celofán.

Luego retire las láminas de celofán, dejando las colonias de hongos en el plato. Incubar la microplaca con agitación suave a 20 grados centígrados durante un tiempo dependiendo de las cepas utilizadas y de la etapa a analizar. En el caso de P. fluorescens BBc6 RA L. bicolor, incubar los cultivos durante 30 minutos para obtener biopelículas en etapa temprana, y hasta 16 horas para biopelículas maduras.

Para eliminar las bacterias planctónicas y las bacterias adheridas electrostáticamente a las hifas, enjuague el hongo transfiriéndolo a una nueva microplaca de seis pocillos llena de solución salina fuerte. Agite suavemente el plato durante un minuto. Transfiera el hongo a una nueva microplaca de seis pocillos que contenga cinco mililitros de tampón estéril de fosfato de potasio 0,1 molar.

Agite suavemente el plato durante dos minutos y luego transfiera el hongo a un tampón fresco. Mientras mantiene la colonia de hongos en amortiguador, use un bisturí para cortar la colonia aproximadamente por la mitad. Transfiera la mitad de la colonia a teñir a una placa de Petri que contenga un mililitro de agua estéril, complementada con un tinte fluorescente apropiado para visualizar la red fúngica, como la aglutinina de germen de trigo conjugada con Alexa Fluor 633.

A continuación, incubar la muestra en la oscuridad. Después de la tinción, enjuague la muestra transfiriéndola a una tapa de placa de Petri que contenga 10 mililitros de tampón estéril de fosfato de potasio 0,1 molar y agite suavemente durante un minuto. Sumerja hasta la mitad un portaobjetos en la tapa de la placa de Petri y coloque delicadamente la sección cortada para que flote sobre el portaobjetos.

A continuación, levante lentamente el portaobjetos de la solución tampón, permitiendo que la muestra se asiente suavemente en el portaobjetos. El aspecto más delicado es la colocación de la muestra en el portaobjetos. Para evitar la descripción de la biopelícula, la muestra y el portaobjetos deben sumergirse mientras se coloca la muestra, y la muestra no debe moverse más antes de la toma de imágenes.

Finalmente, agregue 10 microlitros de medio de montaje anti-decoloración a la muestra y cúbrala con un cubreobjetos de vidrio. Examine los portaobjetos bajo un microscopio láser confocal con un objetivo de 10x o 40x. Utilice una combinación de escaneo de mosaicos y las funciones de apilamiento Z para obtener vistas globales en 3D de la colonia de hongos y las biopelículas.

Para llevar a cabo la microscopía electrónica, después de enjuagar el hongo en una solución salina fuerte como antes, transfiera el hongo a agua estéril en lugar de tampón para evitar la formación de cristales de sal durante la etapa de deshidratación. Transfiera las biopelículas a un portamuestras y elimine el exceso de agua. A continuación, transfiera las muestras a la cámara de un microscopio electrónico de barrido de presión variable.

En una etapa de enfriamiento Peltier, congele la muestra a menos 50 grados centígrados, permitiendo que se liofilice lentamente directamente en la cámara SEM, con 100 pascales de presión variable configurados durante 15 horas. Recupere la muestra y transfiérala a un sistema de deposición de película de alto vacío. A continuación, cubra la muestra con dos nanómetros de platino bajo plasma de argón.

Observe la muestra recubierta con un microscopio electrónico de barrido, con una pistola de emisión de campo que utiliza el detector de lente de alta resolución y una alta tensión electrónica de un kilovoltio. Este análisis a mesoescala de biopelículas demuestra la distribución heterogénica de la biopelícula de P. fluorescens BBc6 en verde sobre las hifas de L. bicolor S238N, que se muestran en rojo. El análisis también hizo posible el seguimiento de la formación de biopelículas a lo largo del tiempo, desde los primeros pasos en los que solo algunas bacterias marcadas con GFP se unieron a las hifas, que se muestran en rojo, hasta la formación de una biopelícula gruesa y madura.

Como se muestra aquí, las imágenes de mesoescala de alta resolución también se utilizaron para llevar a cabo análisis a microescala, para obtener arquitecturas de colonias. Además, en esta proyección de máxima intensidad 2D de alta resolución de una imagen confocal 3D, el marcaje específico con SYPRO Ruby, mostrado en rojo, indica la presencia de proteínas en la matriz, con bacterias BBc6 marcadas con GFP y hongos marcados con FUN-1 en verde oscuro. Después de la deshidratación y codificación de la misma muestra, se obtuvieron más detalles de la estructura de la biopelícula mediante imágenes SEM.

Las puntas de flecha verdes apuntan a las células bacterianas en la biopelícula, y las puntas de flecha amarillas apuntan a hifas fúngicas. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unas dos horas y media para una muestra, sin contar el tiempo de incubación para la formación de biofilm y el cultivo de microorganismos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el éxito del método depende en gran medida de la capacidad de obtener colonias de hongos muy delgadas, formadas por solo unas pocas capas de hifas.

Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como la mutagénesis o la hibridación in situ, para responder a preguntas adicionales, como la caracterización funcional o química del biofilm, o para estudiar biofilms multiespecie. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que investigadores de múltiples campos como la medicina, las ciencias ambientales, la industria alimentaria, etc., exploraran la formación de biopelículas durante las interacciones bacterianas fúngicas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo cultivar y analizar la formación de biopelículas bacterianas en hifas fúngicas.