Tridimensional súper resolución Microscopía de filamentos de actina F por interferométrica photoactivated localización de Microscopía (iPalm)

El objetivo general de este procedimiento es visualizar el citoesqueleto de actina en células de mamíferos adherentes a nivel ultraestructural, utilizando un método de microscopía tridimensional de súper resolución llamado iPALM. Las imágenes de iPALM proporcionan una resolución espacial nanométrica por debajo de la tendencia en las tres dimensiones. Esto permite visualizar las ultraestructuras utilizando sondas de fluorescencia, lo que permite una alta especificidad de etiquetado.

El procedimiento presentado en este video debe ser rápidamente adaptable e instructivo para visualizar otras características ultraestructurales en las células mediante la localización de una sola molécula basada en microscopía de súper resolución. Comience este procedimiento preparando las células en cubreobjetos en una placa de seis pocillos. Para ensamblar la muestra de imagen, use pinzas finas para quitar suavemente el cubremuestras del pocillo tampón.

A continuación, elimine rápida y suavemente el exceso de tampón tocando el borde del cubreobjetos con papel absorbente doblado. Coloque el lado de la celda del vidrio de la cubierta hacia arriba sobre un trozo de papel limpio para lentes. Enjuague la muestra colocando de 30 a 50 microlitros del tampón de imagen sobre la muestra.

Retire el exceso de tampón inclinando y golpeando con papel absorbente doblado. Después de repetir el paso de enjuague varias veces, coloque de 30 a 50 microlitros de tampón de imagen sobre la muestra. Seque el borde del cubreobjetos y coloque varios puntos muy pequeños de epoxi de curado rápido sobre el área seca.

Baje lentamente otro cubreobjetos número 1.5 previamente limpiado en el centro de la celda que contiene cubreobjetos de 22 milímetros. Deje que el tampón de imagen humedezca ambos cubreobjetos por capilaridad. Los pequeños puntos de epoxi de curado rápido deben adherirse a ambos cubreobjetos.

Presione suavemente sobre la muestra ensamblada con papel absorbente doblado para distribuir la presión de manera uniforme. Use suficiente presión para hacer que la celda de la muestra sea delgada y uniforme, pero no tanto como para aplastar las celdas. Mide el grosor adecuado observando el patrón de anillos de Newton.

Asegúrese de realizar este paso con cuidado para minimizar las burbujas de aire. Si es necesario, practique con cubreobjetos vacíos varias veces antes. A continuación, selle la muestra con parafina de vaselina y lanolina derretida.

A continuación, enjuague la muestra sellada con agua desionizada. Seque la muestra con aire comprimido para prepararla para su montaje en el microscopio. Mueva la lente del objetivo superior con resorte hacia arriba para permitir la extracción del portamuestras.

Coloque la muestra sellada en el portamuestras y asegúrela con varios imanes pequeños de tierras raras. Aplique aceite de inmersión en ambos lados de la muestra de imagen. Vuelva a colocar el portamuestras en la trayectoria óptica y baje suavemente la lente del objetivo superior.

Encienda los láseres de excitación. Encienda también las cámaras EMCCD en el modo de transferencia de fotogramas. A continuación, gire los filtros de emisión adecuados.

Active un obturador mecánico para bloquear la trayectoria del haz superior y abrir la trayectoria del haz inferior. Enfoque la lente del objetivo inferior mediante la traslación en pequeños incrementos utilizando el actuador piezoeléctrico. Una vez que el fiducial esté enfocado, abra la trayectoria del haz superior mientras bloquea la trayectoria del haz inferior y enfoque la lente del objetivo superior de manera similar.

Controle el ancho del fiducial en la pantalla de la computadora para un enfoque óptimo. Para un centrado adecuado, abra las trayectorias de la viga superior e inferior. Ajuste manualmente la lente del objetivo superior mientras el objetivo inferior se mantiene constante con un par de tornillos de fijación microfinos hasta que las imágenes de referencia se superpongan lo más posible, idealmente dentro de un píxel.

Posteriormente, realice ajustes finos para que las imágenes de referencia se superpongan dentro de una décima de píxel EMCCD. Ajuste los espejos piezoeléctricos de dos ejes superiores a través del software de control mientras mantiene constantes las lentes del objetivo y los espejos de reflexión inferiores. Compare los centros de los fiduciales de las vistas objetivas superior e inferior a través de la pantalla de la computadora para guiar el proceso.

Con los láseres encendidos, las cámaras transmitiendo continuamente, y las trayectorias del haz superior e inferior abiertas, oscilan el piezoeléctrico Z del portamuestras utilizando una forma de onda de voltaje sinusoidal generada por el software de control para una oscilación continua del eje Z en una magnitud de 400 nanómetros. Transfiera manualmente el conjunto del divisor de haz motorizado hacia arriba o hacia abajo hasta que oscile la intensidad del fiducial. Debido al efecto de interferencia deseado de un solo fotón, esto significa la estrecha coincidencia de las longitudes de los caminos ópticos.

En casos óptimos, se puede lograr una relación pico-valle superior a 10. Para asegurarse de que tanto la amplitud como la fase en cada superficie sean lo más uniformes posible en todo el campo, ajuste el espejo inferior del conjunto del divisor de haz en pequeños pasos para ajustar el espacio y los ángulos de inclinación. Realice la alineación fina del divisor de haz trasladando la muestra en pasos Z de ocho nanómetros a 800 nanómetros.

Monitoree la intensidad fiducial entre las cámaras uno a tres. Ajuste la altura, la posición y la inclinación del espejo inferior dentro del conjunto del divisor de haz en pequeños pasos, de modo que la fase de oscilación de la cámara uno en relación con la cámara dos se maximice, idealmente a 120 grados. Una vez completada la alineación inicial, traslade la muestra para escanear en busca de un campo de visión adecuado que contenga tanto celdas para obtener imágenes como varios fiduciales cercanos.

Coloque un recinto alrededor del sistema para bloquear la luz parásita y las perturbaciones ambientales. Una vez que se encuentre el área de imagen, traslade la muestra nuevamente y registre la curva de calibración para su uso en extracciones posteriores de coordenadas Z. Con el comando acquire calibration scans versus sample piezo position en la interfaz principal.

Una vez que se encuentra el área deseada y se obtiene la curva de calibración, ingrese los nombres de archivo apropiados en el software. Abra las trayectorias del haz superior e inferior, luego aumente la potencia de excitación del láser de 642 nanómetros al máximo. Para Alexa Fluor 647, puede ser necesario un período inicial de apagado de Fluor-4.

Exponga con una excitación constante de 642 nanómetros durante cinco minutos, o más si es necesario, hasta que se observe el parpadeo de una sola molécula. El software permite un aumento automático de la fotoactivación de 405 nanómetros durante el transcurso de la adquisición. Por lo general, se requiere un gran número de marcos de adquisición para que las características filamentosas sean claramente visibles.

Cuando esté listo, comience la adquisición de conjuntos de imágenes sin procesar utilizando el comando iniciar la adquisición de iPALM en la interfaz principal. Durante la adquisición, ajuste el nivel de fotoactivación ajustando la intensidad del láser de 405 nanómetros para mantener la densidad de parpadeo adecuada según sea necesario. Cuando el cubremuestras se ensambla correctamente, los anillos de Newton se pueden observar a simple vista bajo luz ambiental o iluminación fluorescente estándar.

La extracción de las posiciones axiales de los emisores de fluorescencia requiere interferencia multifásica simultánea en la obtención de imágenes iPALM, que se calibra mediante los cambios de intensidad de un fiducial dado en tres EMCCD. A continuación, las intensidades se normalizan y se ajustan para determinar las diferencias de fase. Esta es la imagen iPALM de reconstrucción con cada coordenada de localización representada por un gaussiano 2D con el ancho correspondiente a la incertidumbre de localización.

La coordenada Z se colorea de acuerdo con la barra de color. Se pueden observar áreas de rasgos filamentosos densos y escasos. Aquí se muestran imágenes de reconstrucción iPALM del citoesqueleto de actina de las células HUVEC marcadas con faloidina Alexa Fluor 647.

El color de la imagen indica las coordenadas Z de acuerdo con la barra de colores. El histograma de sección transversal transversal se genera a partir de las coordenadas de localización XY a lo largo del eje largo del área en caja. El ajuste gaussiano muestra un ancho completo a la mitad del máximo de 43,88 nanómetros asociado con la sección transversal.

Este histograma es de la posición Z de las coordenadas de localización en el área recuadrada. El ajuste gaussiano muestra el ancho completo a la mitad del máximo de 17,50 nanómetros. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 90 minutos si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debe comprender cómo visualizar el citoesqueleto de actina en el ultraestructural usando iPALM a través de una preparación y montaje simples, alineación óptica, adquisición de datos sin procesar y el análisis posterior para reconstruir imágenes de súper resolución. Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino para que las investigaciones en el campo de la biología celular exploraran la arquitectura a nanoescala del citoesqueleto de actina, así como las estructuras de adhesión celular, como las adherencias focales.