Preparación y In Vitro Caracterización de los agentes de contraste basados ​​en dendrímeros de Imágenes por Resonancia Magnética

El objetivo general de este procedimiento es mostrar la preparación y caracterización de un quelante paramagnético dendrímero que pueda utilizarse como agente de contraste para la resonancia magnética y demostrar su rendimiento en un experimento de imagen. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los agentes de contraste para resonancia magnética, como las propiedades y la eficacia de los agentes de contraste dendrímeros. La principal ventaja de esta técnica es la conveniente preparación del eficiente agente de contraste para resonancia magnética con alto contenido proteico, lo que garantiza su fácil caracterización.

Este método puede extenderse hacia nuevas modificaciones estructurales y optimizaciones funcionales de los agentes de contraste dendriméricos para resonancia magnética, lo que es de gran relevancia para posibles aplicaciones in vivo. Las implicaciones se extienden hacia la investigación biomédica y el diagnóstico por imagen, ya que la alta tasa molecular de los agentes de contraste dendrímero provoca tiempos de retención de tejido más largos y mejora sustancialmente la señal de resonancia magnética. Primero, disuelva un gramo del precursor macrocíclico DO3A éster de tributilo en cinco mililitros de DMF.

Agregue 0,67 gramos de carbonato de potasio y revuelva a temperatura ambiente durante 45 minutos. Agregue 0,87 gramos de butatoato de terc-butil-2-bromo-4 4-nitrofenilo en porciones durante una hora y continúe agitando la mezcla de reacción durante 18 horas. Luego, retire el DMF con destilación al vacío de bulbo a bulbo a 40 a 60 grados Celsius.

Purificar el residuo con cromatografía en columna de gel de sílice para obtener un sólido redondo. Disuelva un gramo del sólido en una mezcla de 10 mililitros de etanol y 150 microlitros de una solución de siete amoníacos normales en metanol. Agregue 150 miligramos de paladio en carbón activado y configure el reactor de botella en el hidrogenador.

Agitar la mezcla durante 16 horas bajo una atmósfera de hidrógeno de 2,5 bar. Vierta una suspensión de tierra de diatomeas en etanol en un embudo de vidrio sinterizado Filtre la mezcla de reacción a través de la tierra de diatomeas para eliminar el catalizador de carbono paladio. Elimine el solvente del filtrado en un evaporador rotativo.

Disuelva el sólido resultante en 15 mililitros de diclorometano y cuatro equivalentes de trietilamina. A esto, agregue 1,3 equivalentes de tiofosgeno y revuelva la mezcla a temperatura ambiente durante 16 horas. Retire el disolvente de la mezcla de reacción en un evaporador rotativo y purifique el residuo con cromatografía en columna de gel de sílice para obtener el monómero de tipo DOTA como un sólido de color marrón claro.

Prepare 66,7 miligramos de dendrímero G4 PAMAM a partir de una solución al 10% en metanol evaporando el solvente en un evaporador rotativo a 40 grados centígrados. Disuelve el dendrímero en cuatro mililitros de DMF. Agregue 0,105 mililitros de trietilamina a la solución del dendrímero y revuelva durante 45 minutos a 60 grados centígrados.

Luego agregue 354 miligramos del monómero en porciones durante una hora. Continúe revolviendo a 45 grados centígrados durante 48 horas. Elimine el solvente con destilación al vacío de bulbo a bulbo.

Empaque una columna de cromatografía de exclusión de tamaño mediante un medio de filtración de gel lipofílico en remolino durante tres horas a temperatura ambiente. Recoja fracciones de un mililitro utilizando metanol como eluyente. Analiza las fracciones por TLC.

Elimine el solvente de las fracciones que contienen el quelante dendrímero protegido en un evaporador rotativo. Adquieren un espectro de RMN de protones del compuesto e integran las regiones aromáticas y alifáticas. Con estos valores, determine el número de macrociclos de tipo DOTA protegidos acoplados al dendrímero G4 PAMAM.

Para desproteger el producto, disuelva el sólido en cinco mililitros de ácido fórmico y remueva la mezcla a 60 grados centígrados durante 36 horas. Elimine el ácido fórmico con un evaporador rotativo. Liofilizar el residuo eliminado del evaporador rotativo para obtener el quelante dendrímero.

Usando RMN de protones, determine el número de unidades macrocíclicas acopladas al dendrímero. Disuelve el quelante liofilizado en agua. Utilice hidróxido de sodio 0,1 molar para ajustar el pH de la solución a 7,0.

Agregue una solución de 113 miligramos de cloruro de gadolinio III en un mililitro de agua gota a gota a la solución quelante durante un período de cuatro horas. Ajustar periódicamente el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 0,05 molar. Revuelve la mezcla a temperatura ambiente durante 24 horas.

Luego, agregue 158 miligramos de EDTA en porciones durante un período de cuatro horas corrigiendo el pH a 7.0 según sea necesario. Revuelva durante otras 24 horas a temperatura ambiente. Empaque una columna de cromatografía de exclusión de tamaño con medio de filtración de gel hidrófilo hinchado en agua.

Concentre la mezcla de reacción, cargue la mezcla en la columna y eluya con agua desionizada. Centrifugar la muestra purificada en una unidad de filtro centrífugo de tres kilodalton durante 30 minutos a 1.800 veces g. Repita la filtración unas cinco veces para eliminar el exceso de gadolinio y EDTA.

Confirme la ausencia de iones de gadolinio libres en el filtrado con una prueba de naranja de xilenol. Retire los volátiles de la muestra filtrada y liofilice el residuo para obtener el agente de contraste dendrímero. Preparar una solución madre de DCA en agua con una concentración entre cinco y 10 milimolares.

Para determinar la concentración precisa de DCA, primero combine 360 microlitros de la solución madre con 60 microlitros de un estándar de D2O y terc-butanol. Coloque 400 microlitros de la muestra en un tubo de RMN externo. Coloque un tubo de inserción de RMN coaxial que contenga una solución de referencia de terc-butanol y agua en el tubo de muestra.

Adquiera un espectro de RMN de protones y mida el cambio de frecuencia entre las señales de terc-butanol de las soluciones de referencia y de muestra. Calcule la concentración de DCA utilizando la fórmula mostrada, corrigiendo el terc-butanol añadido en la muestra. Determine la concentración de una solución GdDOTA disponible comercialmente de la misma manera.

Coloque las soluciones de DCA y GdDOTA en el tampón HEPES y los controles de agua en dos juegos de viales de plástico. Cierre los viales con tapas asegurándose de que no haya burbujas de aire. En una jeringa de 60 mililitros, cargue horizontalmente las muestras de DCA de 0,01 y 0,02 milimolares, una de las muestras de GdDOTA de 0,5 y 1,0 milimolares y dos de los controles de agua.

Repita este procedimiento cargando el segundo conjunto de muestras en una segunda jeringa de 60 mililitros. Llene cada jeringa con una solución milimolar de GdDOTA y tape las puntas de la jeringa. Coloque una de las jeringas horizontalmente en un escáner de resonancia magnética de modo que las muestras queden verticales con respecto al escáner.

Deslice las jeringas en el centro del escáner. Seleccione el escaneo anatómico para colocar la jeringa en el isocentro del imán. Luego presione el botón del semáforo para realizar ajustes de los parámetros de escaneo iniciales e iniciar el escaneo.

Elija el método de disparo de ángulo rápido/lento para realizar imágenes ponderadas en T1 o el método de adquisición rápida con mejora de la relajación para realizar imágenes en ángulo T2. Utilice el escaneo del localizador para seleccionar el corte coronal de las muestras alineadas verticalmente. Optimice el contraste a los parámetros de adquisición de ruido y adquiera la imagen.

Utilice un ROI circular para determinar la amplitud media de la señal y la desviación estándar para el fondo y para cada muestra. Calcule la relación señal-ruido. La RMN, la MS de Maldi-Tof y el análisis elemental indicaron que un promedio de 49 unidades macrocíclicas se conjugaron con el dendrímero G4 PAMAM.

Las concentraciones y los tiempos de relajación longitudinal y transversal de las soluciones de DCA también se determinaron con RMN. Los valores de relajación obtenidos se compararon con un monómero de GdDOTA disponible comercialmente y clínicamente utilizado. El rendimiento del DCA también se comparó con el monómero GdDOTA.

Dos conjuntos de soluciones tenían concentraciones de gadolinio similares determinadas por el número de unidades macrocíclicas conjugadas y los otros dos conjuntos tenían concentraciones moleculares similares. En un experimento de imagen ponderado en T1 con concentraciones similares de gadolinio, la relación señal-ruido fue ligeramente superior para el DCA que para el GdDOTA. Cuando las soluciones tenían concentraciones similares por molécula, la relación señal-ruido del DCA era aproximadamente tres veces mayor que la de GdDOTA.

En un experimento de imagen ponderada en T2, la relación señal-ruido del DCA fue significativamente menor que la del GdDOTA en ambos pares de concentraciones, particularmente a concentraciones más altas de DCA. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar un agente de contraste de resonancia magnética purificado y caracterizado a base de dendrímeros. Siguiendo este procedimiento, se pueden preparar diferentes tipos de agentes de contraste de resonancia magnética de tamaño dendrímero y nanométrico modificando las unidades de la molécula y analizarlos convenientemente.

Después de dominar esta técnica, los investigadores en el campo del desarrollo de agentes de contraste para resonancia magnética deberían ser capaces de preparar una gama de sondas específicas para ejecutar varios estudios funcionales de importancia crítica para la imagen molecular contemporánea.