Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana

El objetivo general de este experimento es determinar el recuento de células NK y los niveles de activación citotóxica en una muestra de sangre total humana de forma rápida, fiable y estable. Este método puede ayudar a responder preguntas en los campos inmunológicos, tales como: ¿Cuáles son los efectos de las intervenciones externas en la bioactividad de las células NK? La principal ventaja de esta técnica es que es rápida y precisa, a la vez que proporciona resultados reproducibles en todos los experimentos.

Para aislar las células NK de la sangre entera humana, primero coloque los tubos de 15 mililitros etiquetados como muestra de sangre completa, fracción negativa y fracción positiva en las posiciones apropiadas en el estante de tubos separadores de células. Cuando todos los tubos estén cargados, inserte la rejilla del separador en el minimuestreador para el etiquetado automático y seleccione Reactivo en el menú, para resaltar la posición en la que se colocará el vial en la rejilla. Seleccione Leer reactivo para activar el lector de códigos 2D y sostenga el vial de reactivo adecuado frente al lector de códigos 2D en un ángulo de 0,5 a 2,5 centímetros con respecto a la cubierta del lector de códigos.

Coloque el vial de lectura en la posición adecuada de la rejilla del separador. A continuación, en la pestaña Separación, resalte las posiciones deseadas. A continuación, abra el submenú Etiquetado y seleccione un programa de etiquetado automático.

Asigne las microesferas del reactivo de separación celular a las posiciones de bastidor 1, 2, 3 y 4. Y seleccione el programa de separación de Posselwb. Seleccione el programa de lavado con enjuague.

Introduzca 1500 microlitros para el volumen de muestra en el submenú Volumen y pulse Intro. A continuación, haga clic en Ejecutar para comenzar la separación de celdas. Haga clic en Aceptar para confirmar que hay suficiente búfer disponible para procesar todas las muestras.

Para preparar una muestra de ensayo de citotoxicidad, primero etiquete tubos de 1,5 mililitros para cada muestra y/o participante, según corresponda, y coloque la proporción deseada de células NK y células K562 marcadas con DIO en cada tubo. Recoja las células por centrifugación y retire con cuidado el sobrenadante sin alterar la pelletización de la célula. A continuación, vuelva a suspender la mezcla celular en 500 microlitros de medio celular NK incompleto y etiquete las células de cada tubo con 5 microlitros de yoduro de propidio.

Recoja las células a través de otra centrifugación e incube el cultivo de descarte a 37 grados centígrados durante dos horas. Al final de la incubación, centrifugar las células en las mismas condiciones de centrífuga y resuspender el pellet en 25 microlitros de medio de cultivo celular NK fresco e incompleto. Para analizar las células mediante citometría de flujo, primero, haga clic en el botón de inicio en el software del citómetro de flujo de imágenes para vaciar el sistema.

A continuación, haga clic en el botón de diagrama de dispersión para crear cuatro diagramas de dispersión y cargue el tubo de control positivo doble. Usando la muestra de control positivo doble, determine la intensidad deseada para el láser de 405 milivatios, de modo que el detector no se sobrecargue, y configure el generador de imágenes para que adquiera el número adecuado de recuentos de células. Configurar el láser de 405 milivatios a una intensidad que sea adecuada para la detección de DIO y PI requerirá experiencia con ambos tintes y el rango de detección del citómetro de flujo.

Una vez finalizada la adquisición de la muestra de control positivo doble, cargue la muestra de control solo DIO, seleccione el objetivo 40X y apague el láser de 642 milivatios y el canal de campo claro. Criar el número apropiado de células y repetir la adquisición para la muestra de yoduro de propidio solamente. Cuando se hayan ejecutado todas las muestras de control, vuelva a encender el láser de 405 milivatios y el canal de campo claro y haga clic en Establecer intensidad.

A continuación, en la pestaña Adquisición de archivos, introduzca un nombre de archivo personalizado y seleccione una carpeta para guardar los archivos de datos. A continuación, introduzca el número de celdas que desea adquirir. Cargue el primer tubo de muestra experimental y haga clic en el botón Adquirir.

Cuando se hayan ejecutado todas las muestras, abra la aplicación de software de análisis de citómetro de flujo de imágenes y abra un único archivo RIF experimental. En la pestaña de compensación, seleccione Crear nueva matriz. El software solicitará la selección de los archivos de un solo color y los fusionará para crear un archivo de matriz que se seleccionará para aplicar la compensación de canal.

Utilice la función Bloques de construcción para configurar los diagramas de puntos adecuados. A continuación, haga clic en la función de estadísticas para acceder a los números de celda de cada puerta. En este experimento representativo, se extrajeron muestras de sangre como se indicó y se midió la concentración de células NK por mililitro de sangre total para cada corredor, y en promedio para cada punto de tiempo.

Tres de cada cuatro corredores presentaron un ligero aumento similar en el recuento de células NK después del ejercicio. Inmediatamente seguido de una disminución brusca, antes de volver lentamente a la normalidad, de 24 a 48 horas después del final del evento. En promedio, el recuento de células NK disminuyó 1,5 horas después del ejercicio, pero volvió a niveles casi normales después de 24 horas.

Después de calcular el recuento de células, se analizó inmediatamente la actividad citotóxica de las células NK, como se acaba de demostrar, con una disminución promedio en la citotoxicidad de las células NK inmediatamente, y 1,5 horas después de la finalización del evento de ejercicio, que aumentó significativamente a las 24 horas después del ejercicio. La citotoxicidad de NK se mantuvo alta en comparación con los niveles previos al ejercicio, aunque no significativamente. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en unas cuatro horas cuando se realiza correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener y caracterizar el recuento de células NK y la actividad citotóxica de muestras de sangre humana de una manera hidrópica reproducible.