Utilizando tecnología de impresión 3D se fusiona con la RM Histología: Un protocolo para el Cerebro de seccionamiento

El objetivo general de este protocolo es alinear con precisión volúmenes de imágenes de resonancia magnética con secciones de histología mediante la creación de porta-cerebros y cajas cortadoras personalizadas impresas en 3D. Aunque este video se centra en el tejido cerebral extraído del marmoseto, este protocolo puede aplicarse a cualquier cerebro, ya sea de roedor, primate no humano o humano. Prepare una estación de trabajo tal como se describe en el protocolo.

Llene el tubo con Fomblin y gasa hasta la marca de 20 mililitros. Comprima la gasa para eliminar las burbujas de aire en el proceso. Seque suavemente el cerebro del formaldehído.

Luego, inserte el cerebro con la parte frontal hacia el fondo del tubo. Sujete cuidadosamente el cerebro en el tubo utilizando gasa alrededor de los lados del cerebro para fijar su posición. Llene el resto del tubo con gasa y Fomblin.

Retire cuidadosamente las burbujas de aire durante el proceso. Luego asegure la tapa y selle el tubo con parafina. Marque la tapa y la línea con la hendidura interhemisférica.

Luego envuelva el tubo en una toalla de papel e insértelo en la bobina con la marca en la posición central superior. Inserte la bobina en el escáner de MRI. Después de la adquisición y el posprocesamiento, obtenemos una imagen ponderada en T2 que podemos utilizar para crear un modelo digital del cerebro.

Abra la resonancia magnética en la orientación coronal. Luego, utilice las herramientas de transformación para remuestrear la imagen a vóxeles isotrópicos de 1 milímetro. A continuación, aplique un filtro de reducción de ruido no lineal.

Seleccione la tabla de búsqueda de visualizaciones. Luego haga clic en el botón de umbral dual. Arrastre el control deslizante en el gráfico para cubrir todo el cerebro.

Cree una máscara binaria del cerebro utilizando el algoritmo de segmentación Umbral con valores mínimo/máximo. Ingrese el valor ubicado en la esquina inferior izquierda del gráfico de intensidad, justo debajo de la escala, en el cuadro de límite inferior. Luego seleccione Binario y desactive la casilla Umbral inverso.

Seleccione el algoritmo morfológico, Rellenar huecos. Marque Procesar en 2.5D. Para rellenar el espacio entre el cerebro posterior y la corteza, seleccione la línea VOI.

Dibuje una conexión entre el cerebro posterior y la corteza en ambos lados del cerebro en el punto más lateral. Continúe dibujando conexiones de VOI a través del cerebro. Convierta los VOI en una máscara binaria.

Utilice la calculadora de imágenes para combinar las máscaras binarias de VOI y cerebro seleccionando la operación OR. Seleccione Promover el tipo de imagen de destino. Ahora seleccione el algoritmo morfológico: Rellenar huecos.

Y verifique el Proceso en 2.5D. Seleccione el algoritmo Extraer superficie, seleccione Imagen de máscara, ingrese un nombre y luego seleccione el tipo de archivo ply. Los espacios en el cuadro de corte correspondientes a la ubicación del plano de corte se pueden colocar comenzando desde la parte frontal del cerebro, la parte posterior del cerebro o en relación con un área de interés, como las lesiones en la materia blanca que se observan aquí.

Utilizando VOI de cuadro, dibuje un cuadro alrededor del cerebro. Copie y pegue el cuadro en el número de cortes de RM correspondientes al grosor previsto de los espacios entre placas. Luego avance el número de cortes de RM por sección y coloque el cuadro como antes para crear otro espacio entre láminas.

Repita este proceso a través del cerebro. Invierta las VOI de la caja en una máscara binaria. Luego extraiga la superficie utilizando la extracción de superficie como se hizo anteriormente para el cerebro.

Seleccione la máscara binaria del espacio de la cuchilla. Utilice la operación matemática de imagen para multiplicarla por 10.000. Luego, utilice la calculadora de imágenes para sumar la máscara binaria multiplicada a la resonancia magnética isotrópica remuestreada.

Ahora, al seleccionar la vista triplanar, se puede observar un mapa de corte por RM que muestra la ubicación en la que se seccionará el cerebro en tres vistas ortogonales. En Netfabb Professional, seleccione Agregar pieza. Luego seleccione el modelo de separación de corte y los modelos ply del cerebro.

Seleccione el modelo de cerebro y haga clic en el modo de reparación. Utilice el botón de selección de capa para seleccionar el cerebro. Luego, cambie la selección a las otras capas y elimínelas.

Luego aplique la reparación y retire la parte antigua. Con el cerebro seleccionado, elija Mover. Haga clic en el origen y registre los parámetros en las cajas X, Y y Z.

Estos son necesarios para mantener la posición del espacio entre las cuchillas. Haga clic en traducir y cierre la ventana.

Seleccione el modelo de separación de láminas y transládalo utilizando los parámetros registrados en el paso anterior. Seleccione el modelo de cerebro y haga clic en el modo de reparación. Utilice el botón de selección de capa para seleccionar el cerebro.

Luego seleccione Triángulos suaves. Ingrese cuatro como número de iteraciones. Y marque Evitar la reducción de volumen.

Seleccione Reducir triángulos e ingrese 200000 en el cuadro Cantidad objetivo de triángulos. Luego seleccione Reparación automática y realice una reparación predeterminada. Aplique la reparación.

Luego exporte el modelo del cerebro suavizado como un archivo STL. Importe el modelo del cerebro suavizado a Meshmixer. Utilice las herramientas de escultura para suavizar las áreas dibujadas con las VOI de línea.

Y corrija cualquier otro defecto menor en el modelo. Importe el modelo de cerebro editado y suavizado a Netfabb Professional. Luego agregue la pieza, las piezas del cortador de cerebro para marmoset.

Seleccione las carcasas para las piezas. Luego, cambie el nombre de cada pieza según se describe en el protocolo. Utilizando la configuración de selección descrita en el protocolo, haga clic y arrastre las piezas para posicionar el cerebro en el centro del cuadro.

Haga clic y arrastre las partes para ajustar la profundidad del cerebro en el cuadro. Seleccione el modelo de cerebro suavizado y editado, en el modelo recortado del cuadro y seleccione la operación booleana. Haga clic en el modelo de cerebro para que se vuelva rojo.

Y seleccione sustracción booleana. Aplique los cálculos. Marque la casilla para los voladizos que impedirán la colocación adecuada del cerebro.

Consulte la sección suplementaria del protocolo para un método que permita eliminarlos. Seleccione el modelo de separación de la cuchilla y haga clic en mover. Registre en la posición Z.

Esta será la posición del espacio más posterior entre las cuchillas. Luego cierre la ventana. Seleccione la pieza de la cuchilla entre las piezas del cortador de cerebro y haga clic en Mover.

Introduzca el valor Z del paso anterior. Y luego introduzca los valores actuales de las posiciones X e Y. Seleccione la traslación absoluta y traslade.

Haga clic en Duplicar. Si el grosor de la sección es constante, como se muestra aquí, ingrese el número total de cuchillas y el recuento total y el recuento Z, y escriba el grosor de la sección en el cuadro de separación Z. Luego seleccione duplicar.

Seleccione la pieza de la cuchilla del micrótomo de las piezas del cortador de cerebro. Repita los mismos pasos de movimiento y duplicación realizados con la pieza de la cuchilla. Seleccione todas las cuchillas del micrótomo y el soporte principal de la cuchilla y haga clic en la operación booleana.

Seleccione todas las cuchillas del micrótomo para que se vuelvan rojas y haga clic en sustracción booleana. Luego aplique los cálculos. Ingrese al modo de reparación y seleccione reparación automática.

Realice una reparación extendida y aplique la reparación. Exporte el soporte de la cuchilla como un archivo STL. Seleccione todas las cuchillas, las cajas principal y secundaria, y el modelo de cerebro editado y suavizado, y haga clic en la operación booleana.

Utilice la ventana de selección de piezas para volver rojas todas las piezas, excepto la caja principal. Luego seleccione la resta booleana. Aplique los cálculos.

Ingrese al modo de reparación y marque la casilla para identificar bordes afilados que podrían lesionar el cerebro. Estos pueden repararse en el modo de reparación de Netfabb o mediante las herramientas de escultura en Meshmixer.

Luego seleccione Reparación automática. Realice una Reparación extendida. A continuación, aplique la reparación.

Exporte la caja cerebral como un archivo STL. En Cura, seleccione Cargar e importe la Caja Cerebral. Haga clic en el botón Girar.

Luego, haga clic y arrastre para colocar la caja plana. Edite la configuración de impresión tal como se muestra en el protocolo. A continuación, guarde la trayectoria de la herramienta.

Siga el mismo procedimiento para el soporte de la cuchilla y también duplique el objeto. Luego guarde la trayectoria de la herramienta. Después de aplicar una capa fina de pegamento sobre la plataforma de impresión, imprima la caja para el cerebro y los soportes de cuchilla en la impresora 3D utilizando la configuración descrita en el protocolo.

Después de que finalicen las impresiones, se puede preparar el cerebro para el corte. Configure una estación de trabajo según se describe en el protocolo. Coloque cuidadosamente el cerebro en la caja y asegúrese de que esté firmemente en su lugar.

Coloque las cuchillas del micrótomo en el portacuchillas, en las ranuras correspondientes de la caja. Con guantes de protección puestos, presione firmemente hacia abajo sobre los portacuchillas. Aplique presión lenta y equilibrada para cortar el cerebro.

Retire los bloques uno a la vez, comenzando desde la parte frontal del cerebro. Aunque este enfoque es sencillo, el método requiere muchos pasos, así como el uso de varios tipos de software, y los investigadores deben familiarizarse con las interfaces de usuario antes de comenzar el procedimiento. Este flujo de trabajo resume el protocolo para fabricar la caja cortadora de cerebro de marmoseta.

El cerebro se fija con formalina y se adquiere una resonancia magnética ponderada en T2 a 150 micrones. Las imágenes se procesan y umbralizan para crear una máscara binaria. Luego, la superficie se renderiza en software de modelado 3D.

Una sustracción booleana entre una plantilla cortadora y el modelo cerebral crea el modelo digital del cortador cerebral. Luego, la caja cortadora se imprime en una impresora 3D. A continuación, el cerebro se coloca firmemente dentro de la caja cortadora para su sección.

Una vez que el cerebro está seccionado, una comparación visual entre las imágenes de MRI in vivo y post mortem y las fotografías de las superficies superficiales de los bloques revela una buena coincidencia de orientación en múltiples bloques. Una comparación más detallada entre la MRI post mortem de alta resolución y las secciones histológicas teñidas con CV-LFB de múltiples bloques cerebrales demuestra una coincidencia precisa y consistente en todas las estructuras del cerebro del marmoseto. En este modelo animal de esclerosis múltiple, los animales desarrollan lesiones en la sustancia blanca distribuidas por todo el cerebro.

Mediante esta técnica, lesiones pequeñas detectadas mediante resonancia magnética in vivo pueden rastrearse tanto en cortes de resonancia magnética post mortem como en secciones de histología. La histología y la resonancia magnética post mortem también pueden revelar lesiones que pasaron desapercibidas en la resonancia magnética in vivo. En este caso, la resonancia magnética in vivo no mostró evidencia concluyente de una señal hipointensa normal que sugiriera lesiones en ninguno de los dos trayectos ópticos.

Sin embargo, en la resonancia magnética post mortem, se observaron hiperintensidades de señal en el tracto óptico. Y estas áreas correspondieron directamente con las lesiones mielinizadas observadas en la sección histológica con LFB CV. Por lo tanto, en conclusión, la metodología presentada aquí permite a los investigadores evaluar con precisión la patología subyacente a los hallazgos de resonancia magnética.

Consideramos que es un enfoque prometedor para identificar nuevos biomarcadores de enfermedades que afectan al cerebro y de procesos patológicos específicos, como la inflamación y la remielinización.