Name: Utilizando tecnología de impresión 3D se fusiona con la RM Histología: Un protocolo para el Cerebro de seccionamiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: Aprende a alinear imágenes de resonancia magnética con secciones histológicas mediante soportes cerebrales impresos en 3D personalizados. Este protocolo computacional permite correlaciones radiológicas precisas en neuroimagen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

El Programa de Investigación Intramuros del NINDS apoyó este estudio. Agradecemos al Centro de Imágenes de Resonancia Magnética Funcional de los NIH. Agradecemos a Jennifer Lefeuvre y Cecil Chern-Chyi Yen por su asistencia en la adquisición de la resonancia magnética postmortem. Agradecemos a John Ostuni y a la Sección de Instrumentación Central por su ayuda con la impresión 3D. En la Figura 1 de este trabajo se utilizaron instantáneas de MeshLab, una herramienta desarrollada con el apoyo del proyecto 3D-CoForm.

<ol><li>Evans, A. C., Frank, J. A., Antel, J., Miller, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+MRI+in+clinical+trials+of+multiple+sclerosis%3A+comparison+of+image+processing+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">The role of MRI in clinical trials of multiple sclerosis: comparison of image processing techniques.</a> Ann Neurol. 41 (1), 125-132 (1997).</li>
<li>'t Hart, B. A., van Kooyk, Y., Geurts, J. J. G., Gran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primate+autoimmune+encephalomyelitis+model%3B+a+bridge+between+mouse+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Transl+Neurol%22%5BJournal%5D)">The primate autoimmune encephalomyelitis model; a bridge between mouse and man.</a> Ann Clin Transl Neurol. 2 (5), 581-593 (2015).</li>
<li>Ontaneda, D., Hyland, M., Cohen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+new+insights+in+pathogenesis+and+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: new insights in pathogenesis and novel therapeutics.</a> Annu Rev Med. 63, 389-404 (2012).</li>
<li>Guy, J. R., Sati, P., Leibovitch, E., Jacobson, S., Silva, A. C., Reich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Custom+fit+3D-printed+brain+holders+for+comparison+of+histology+with+MRI+in+marmosets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Custom fit 3D-printed brain holders for comparison of histology with MRI in marmosets.</a> J Neurosci Methods. 257, 55-63 (2016).</li>
<li>Breen, M. S., Lazebnik, R. S., Wilson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+registration+of+magnetic+resonance+image+data+to+histological+sections+with+model-based+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional registration of magnetic resonance image data to histological sections with model-based evaluation.</a> Ann Biomed Eng. 33 (8), 1100-1112 (2005).</li>
<li>Dauguet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+stained+histological+slices+and+3D+non-linear+registration+with+in-vivo+MRI+for+whole+baboon+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of stained histological slices and 3D non-linear registration with in-vivo MRI for whole baboon brain.</a> J Neurosci Methods. 164 (1), 191-204 (2007).</li>
<li>McGrath, D. M., Vlad, R. M., Foltz, W. D., Brock, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+note%3A+fiducial+markers+for+correlation+of+whole-specimen+histopathology+with+MR+imaging+at+7+tesla%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Phys%22%5BJournal%5D)">Technical note: fiducial markers for correlation of whole-specimen histopathology with MR imaging at 7 tesla.</a> Med Phys. 37, 2321-2328 (2010).</li>
<li>Schormann, T., Zilles, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+linear+and+nonlinear+transformations%3A+An+integration+of+light+microscopical+and+MRI+data%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Brain+Mapp%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional linear and nonlinear transformations: An integration of light microscopical and MRI data.</a> Hum Brain Mapp. 6, 339-347 (1998).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+MR%2C+fluorescence+and+histology+imaging+strategy+in+a+human+breast+tumor+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Combined MR, fluorescence and histology imaging strategy in a human breast tumor xenograft model.</a> NMR Biomed. 26 (3), 285-298 (2013).</li>
<li>Absinta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmortem+magnetic+resonance+imaging+to+guide+the+pathologic+cut%3A+individualized%2C+3-dimensionally+printed+cutting+boxes+for+fixed+brains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Postmortem magnetic resonance imaging to guide the pathologic cut: individualized, 3-dimensionally printed cutting boxes for fixed brains.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 73 (8), 780-788 (2014).</li>
<li>Gaitán, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivenular+brain+lesions+in+a+primate+multiple+sclerosis+model+at+7-tesla+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mult+Scler%22%5BJournal%5D)">Perivenular brain lesions in a primate multiple sclerosis model at 7-tesla magnetic resonance imaging.</a> Mult Scler. 20 (1), 64-71 (2014).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El protocolo descrito aquí permite una comparación exacta entre la RM y secciones histológicas. El protocolo se presenta en un formato unificado que se puede aplicar a los cerebros de seres humanos o animales pequeños, tales como monos tití o roedores. Las diferencias específicas a grande (humana) y pequeñas (de primates no humanos y roedores) cerebros se ponen de relieve, y en el video y las figuras adjuntas que muestran la aplicación en el tití. Aunque el enfoque es sencillo, el método requiere muchos pasos, así como el uso de varios tipos de software. Por otra parte, hay varias cuestiones que puedan afectar a la exactitud de este método son importantes de mencionar. La calidad de imagen de la resonancia magnética in vivo es un factor importante. Para minimizar la disparidad en la resolución de la imagen entre la RM y la histología imágenes digitalizadas, el tamaño de resonancia magnética voxel más pequeño posible se debe utilizar. Este concepto se aplica también a la calidad de imagen de la MRI postmortem. Mientras que el aumento de latiempo de adquisición en MRI postmortem permite mucho más alta resolución de la imagen, la preparación puede introducir artefactos de imagen tales como pérdidas de señal de coordinación relacionados con las burbujas de aire. Estos artefactos pueden ocultar áreas del tejido, así como afectar a su contorno. Por otra parte, las dimensiones del tejido en la autopsia MRI son propensos a ser afectados por el proceso de fijación y duración. Mientras que la in vivo para ex vivo partido de resonancia magnética se puede aproximar estrechamente mediante la utilización de puntos de referencia anatómicos en la configuración de la geometría rebanada durante la adquisición, el registro no lineal todavía sería necesario alcanzar un mayor grado de precisión en la adecuación de esas dos imágenes de resonancia magnética. El diseño del soporte de la máquina de cortar cerebro y es también un paso crucial. En la creación del modelo digital del cerebro, se aplica un algoritmo de suavizado que agranda ligeramente el modelo en relación con el cerebro fijo. Esto permite una fácil inserción del cerebro en su soporte y la máquina de cortar y reduce los bordes afilados en el soporte y# 39; s contorno. Sin embargo, si el modelo es demasiado grande (por ejemplo, en más de un 5%), el cerebro podría moverse durante el postmortem MRI y / o el seccionamiento. Otro punto importante es adaptar el diseño del modelo de cerebro, de modo que el cerebelo está correctamente colocado en el interior del objeto 3D impreso. Esto puede ser particularmente difícil cuando el cerebelo ha sido dañado durante la extracción del cerebro en la autopsia. Cuando la impresión de la máquina de cortar el cerebro y el soporte, del tipo de impresora 3D también deben ser elegidos cuidadosamente. Algunas impresoras de chorro múltiple requieren post-procesado utilizando un horno para eliminar el material de soporte. Si bien estas impresoras pueden producir objetos que son a prueba de agua y relativamente más duradero que las impresoras de escritorio fusionado modelado por deposición (FDM), el proceso de calentamiento para eliminar soportes pueden deformar ligeramente la caja, la creación de lagunas de cuchilla que no son perfectamente perpendicular al contorno cerebro. El proceso cerebral de seccionamiento es otro paso crucial. Antes de cortar THe de todo el cerebro en losas, es importante asegurarse de que el cerebro está sentado firmemente dentro de la máquina de cortar de cerebro: no debe haber movimiento cuando se aplica una ligera presión en el cerebro. Esto hará posible que las cuchillas corten a través del cerebro en el lugar preciso establecido por los investigadores. Una presión continua, equilibrada debe aplicarse a ambos soportes de cuchilla durante el corte. Dependiendo del filo de las cuchillas y la rigidez del tejido, un ligero movimiento de corte transversal podría ser ventajoso para el mantenimiento de superficies de corte planas. El proceso de inclusión en parafina también puede ser una fuente de falta de alineación entre la resonancia magnética y la histología. Si la losa tejido no está sentado plana contra la casete durante el proceso de incrustación, habrá una inclinación entre el plano de corte de la micrótomo y el lugar superficie de la losa. Esto requerirá cortar secciones inutilizables para encontrar una superficie plana en la que está expuesta todo el tejido. Una manera de corregir la inclinaciónes cambiando el ángulo del plano de visualización en el MRI postmortem de alta isotrópico-resolución. Sin embargo, esto es casi imposible de realizar en el vivo MRI en que por lo general se adquiere con la resolución anisotrópico (típicamente gruesas rebanadas coronales). Finalmente, el tejido puede experimentar una cierta deformación durante el período de la fijación con formalina y la incrustación de parafina (contracción), así como durante la preparación de diapositivas (plegable, grietas, arrugas). Algunas de estas deformaciones se pueden corregir poniendo las secciones 4-5 micras en un baño de agua antes de ser transferido en portaobjetos. Otros deformaciones se pueden resolver parcialmente mediante la realización de coregistration imagen deformable de las imágenes digitalizadas histológicos a las imágenes de resonancia magnética post mortem. Sin embargo, lo que minimiza las deformaciones con la práctica cuidadosa y hábil es el método más eficaz de igualar los volúmenes de resonancia magnética a la histología secciones. En conclusión, la metodología presentada aquí permite investigators para evaluar con precisión la patología subyacente de los resultados de la RM. Más en general, es un enfoque prometedor para identificar y / o validar nuevos biomarcadores de resonancia magnética para estudios de investigación que se dirigen a procesos patológicos específicos, tales como la inflamación o la remielinización.

La resonancia magnética in vivo proporciona una medida no invasiva y sensible de la integridad del tejido a nivel macroscópico. Los cambios en la intensidad de la señal de resonancia magnética observados in vivo son medidas de resultado en muchos ensayos clínicos en curso. 1 Si bien los cambios de intensidad observados a través de la resonancia magnética pueden identificar áreas de anormalidad en el contexto de todo el cerebro, a menudo no son lo suficientemente específicos como para diferenciar los procesos patológicos. Esto es especialmente cierto en el caso de los procesos dinámicos que involucran múltiples patologías. Por ejemplo, en la esclerosis múltiple (EM) o en su modelo animal, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), la inflamación, el edema, la degradación de la mielina, la destrucción axonal, la gliosis y la muerte neuronal se superponen. 2, 3 Para obtener la especificidad necesaria con respecto a la patología subyacente, se debe tener en cuenta el contexto, junto con el conocimiento de la histología de los tejidos anormales identificados por RM.
Sin embargo, incluso en experimentos con animales bien controlados, hacer coincidir la histología con la resonancia magnética in vivo es fundamentalmente un desafío por varias razones. En primer lugar, la diferencia en las escalas dimensionales entre las secciones de histología y la resonancia magnética es de varios órdenes de magnitud. 4 En segundo lugar, para una comparación adecuada, la orientación del plano de corte de la resonancia magnética debe coincidir con el plano de corte del tejido cerebral cuando se corta. Debido a la forma del cerebro, es muy difícil hacer cortes consistentemente rectos y precisos cuando el cerebro está sentado sobre una superficie plana. En tercer lugar, el gran tamaño del cerebro en relación con un área de interés potencialmente pequeña (lesión, tumor, etc.) crea un escenario de "aguja en un pajar" para el patólogo que procesa el tejido. En cuarto lugar, incluso cuando se encuentra el tejido objetivo, comúnmente se procesa de tal manera que hace prácticamente imposible una asociación con los datos originales de la resonancia magnética. Por último, el corte patológico tradicional del tejido cerebral suele ser impreciso e inconsistente, lo que complica aún más la comparación entre los cortes de histología y las imágenes de resonancia magnética. 
 Los intentos anteriores de superar estos desafíos se basaron en el uso de algoritmos de deformación para coregistrar los datos y/o la ubicación de marcadores fiduciales dentro o alrededor del tejido como referencia. 5, 6, 7, 8 El primer enfoque requiere modelos computacionales complejos que son particularmente susceptibles a complicaciones debido al formato de los datos, los artefactos de imágenes y los cambios causados por el procesamiento de tejidos. 4 Por otro lado, este último enfoque introduce la posibilidad de contaminar o dañar el propio tejido. 9
El enfoque descrito aquí mejora la transición entre modalidades mediante el uso de la resonancia magnética postmortem para cerrar la brecha entre la resonancia magnética in vivo y la histología. La resonancia magnética postmortem proporciona imágenes tridimensionales (3D) del cerebro con una resolución más alta que la que se puede lograr in vivo y, además, proporciona los datos necesarios para producir un modelo morfológicamente preciso de la superficie cerebral. Este modelo digital se puede utilizar para crear un soporte personalizado impreso en 3D para el cerebro. Con un posicionamiento cuidadoso, el soporte de cerebro permite una sección precisa del cerebro orientada a la resonancia magnética, lo que reduce la necesidad de algoritmos matemáticos complejos y permite concentrarse en regiones específicas para un muestreo específico. 
Nuestro laboratorio introdujo recientemente nuevos métodos para crear soportes y cortadores de cerebros personalizados utilizando tecnología de resonancia magnética postmortem e impresión 3D para cerebros humanosde 10 y titíes. 4 Los dos métodos permiten una correlación más precisa entre la resonancia magnética y la histología en un entorno de investigación y, en última instancia, permiten una comprensión más profunda de la patología específica que subyace a las anomalías de la resonancia magnética. Los experimentos cuidadosamente diseñados, en los que se toman muestras del cerebro repetidamente a lo largo del tiempo in vivo, pueden proporcionar un contexto para la interpretación de la patología, lo que a su vez puede agregar especificidad a la interpretación de la resonancia magnética. Aquí, presentamos un protocolo modificado en un marco unificado que se puede aplicar a cualquier tejido cerebral, ya sea que provenga de primates no humanos, roedores o humanos. Proporcionamos instrucciones detalladas, y un video correspondiente, para el seccionamiento de titíes. Aunque el protocolo general se aplica a cualquier tipo de cerebro, debido a las diferencias en la adquisición de resonancias magnéticas y el tamaño del tejido, así como a los desafíos encontrados cuando se trata de tipos específicos de cerebro, existen algunas diferencias en el enfoque según el tipo de cerebro que se procesa. En esta presentación, las secciones con "humano" denotarán diferencias en el protocolo específico del cerebro humano.

<table><tbody><tr><td>7T/30cm USR AVIII Bruker MRI Bruker</td><td>Biospin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>38 mm Bruker Biospin bobina de volumen Bruker Biospin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fomblin</td><td>Solvay Solexis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon Tubos de Centrífuga, Polipropileno, Estéril</td><td>Corning</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Esponjas de gasa</td><td>Fisher Scientrific</td><td>13-761-52</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M Película de laboratorio multiusos</td><td>Bemis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica RM2235 micrótomo rotativo&nbsp;</td><td>Cuchillas</td> desechables Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Leica, perfil bajo (819)</td><td>Acetato violeta Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cresyl, 0,1 % acuoso</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>26089-01</td><td></td></tr><tr><td>Luxol Fast Blue, 0,1 % en alcohol al 95 %</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>26056-15</td><td></td></tr><tr><td>ETOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker 2 Extended&nbsp;</td><td>Ultimaker.75</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>kg Marca oficial Ultimaker PLA&nbsp; Filamento, 2,85 mm, Plata Metalizado</td><td>Ultimaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen 2 (Blue Edition)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Netfabb Professional 5.0.1</td><td>Netfabb</td><td>http://www.netfabb.com/professional.php</td><td></td></tr><tr><td>Meshmixer 10.9.332</td><td>Autodesk</td><td>http://www.meshmixer.com/download.html</td><td></td></tr><tr><td>Mipav 7.2</td><td>NIH CIT</td><td>http://mipav.cit.nih.edu</td><td></td></tr><tr><td>Cura</td><td>Ultimaker</td><td>https://ultimaker.com/en/products/cura-software</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizando tecnología de impresión 3d se fusiona con la rm histología: un protocolo para el cerebro de seccionamiento

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

La resonancia magnética (RM) permite la delineación entre tejido normal y anormal a escala macroscópica, muestreando un volumen completo de tejido tridimensionalmente. Si bien la resonancia magnética es una herramienta extremadamente sensible para detectar anomalías en los tejidos, la asociación de los cambios de señal con un proceso patológico subyacente no suele ser sencilla. En el sistema nervioso central, por ejemplo, la inflamación, la desmielinización, el daño axonal, la gliosis y la muerte neuronal pueden inducir hallazgos similares en la resonancia magnética. Como tal, la interpretación de las resonancias magnéticas depende del contexto y, por lo tanto, la correlación radiológico-histopatológica es de suma importancia. Desafortunadamente, el corte patológico tradicional del tejido cerebral a menudo es impreciso e inconsistente, lo que complica la comparación entre los cortes de histología y la resonancia magnética. Este artículo presenta una metodología novedosa para seccionar con precisión los tejidos cerebrales de los primates y, por lo tanto, permitir una coincidencia precisa entre la histología y la resonancia magnética. El protocolo detallado descrito en este artículo ayudará a los investigadores a aplicar este método, que se basa en la creación de cortadores de cerebros impresos en 3D. Ligeramente modificado, se puede implementar fácilmente para cerebros de otras especies, incluidos los humanos.

El flujo de trabajo de este método se resume en la figura 1. Una vez que se corta el cerebro, una comparación visual entre las imágenes de RM e imágenes de las superficies superficiales de las losas muestra un buen partido orientación a través de múltiples placas (Figura 2). Después de que las losas se incluyeron en parafina, que se seccionan en un microtomo y se tiñeron. Una comparación más exhaustiva entre el post-mortem de resonancia magnética de alta resolución y de las secciones histológicas teñidas demuestra una coincidencia exacta y consistente a través de todas las estructuras del cerebro tití (Figura 3). En este modelo animal de la esclerosis múltiple, los animales desarrollan lesiones de sustancia blanca repartidos por toda la sustancia blanca cerebral. Estas lesiones se pueden detectar de manera no invasiva mediante la realización de resonancia magnética. Figura 4 demuestra la capacidad de esta técnica para dilucidar el sustrato patológico de los resultados de la RM. Las pequeñas lesiones detectadas en la RM in vivo puederealizar un seguimiento tanto en la autopsia resonancia magnética y la histología. Como se muestra en las inserciones, desmielinización dentro de las lesiones es uno de los principales componentes que impulsan el cambio de señal MR (hiperintensidad en comparación con el tejido circundante). La histología postmortem y resonancia magnética también puede mostrar lesiones perdido en la RM in vivo (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig1.jpg" /> Figura 1. Flujo de trabajo para la creación de un cuadro de la máquina de cortar tití cerebro. El cerebro se fija con formalina (A1) y un MRI ponderada en T2 se adquiere con voxels isotrópicos de 150 micras en el borde (A2). Las imágenes se procesan y thresholded para crear una máscara binaria (A3). La superficie se vuelve entonces en el software de modelado 3D (A4). Una resta booleano entre una plantilla de la máquina de cortar y el modelo de cerebro crea un modelo digital de la máquina de cortar de cerebro (B1). El cuadro de la máquina de cortar el cerebro se imprime en una impresora 3D (B2). Entonces, el cerebro se coloca firmemente en la caja de la máquina de cortar dede corte (B3). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig2.jpg" /> Figura 2. De izquierda a derecha: En vivo resonancia magnética, MRI post mortem, y la fotografía losa de tejido. Se establecieron planos de cortado basado en el MRI postmortem (B) y visualmente en comparación con el correspondiente in vivo MRI rebanada (A). a continuación, se cortó el cerebro, y se encontraron las losas resultantes para ser coherente (C). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig3.jpg" /> Figura 3. RM de alta resolución y la histología postmortemsección de acople. Las losas fueron incluidos en parafina, cortadas con un microtomo en 4 secciones micras, y se tiñeron con violeta rápido de cresilo y azul (B). Las secciones fueron emparejados visualmente con el 100 micras T2 * ponderadas MRI basado en estructuras del cerebro (A). Los detalles de la adquisición de esta imagen están en la sección complementaria del protocolo y en la Tabla 1. Las estructuras cerebrales: (1) la flecha roja = cápsula interna, flecha azul = comisura anterior; (2) Houthaven putamen, flecha azul = tracto óptico; (3) Houthaven caudado, flecha azul = hipocampo; (4) Houthaven cuerpo calloso, flecha azul = acueducto cerebral; (5) flecha roja = colículo inferior, flecha azul = tracto piramidal. El recuadro de trazos en B1 indica una rebanada cuando, de forma durante el corte de cerebro o de la inclusión en parafina, un error causado una ligera rotación alrededor del eje Y, lo que lleva a falta de coincidencia de la comisura anterior a la izquierda. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una</a>versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig4.jpg" /> Figura 4. El seguimiento de las lesiones de resonancia magnética in vivo para la sección histología. La resonancia magnética in vivo mostró ninguna evidencia convincente de hiperintensidad de señal anormal que sugiera lesiones, ya sea en el tracto óptico (A1). Sin embargo, la alta resolución de la RM postmortem muestra líneas intensas hiper claras en ambas vías ópticas (A2). El ayuno azul / violeta de cresilo mancha de una sección de la histología 4 micras, muestra que las áreas hiperintensas visto en la ex vivo de resonancia magnética se mielina (A3). En la sustancia blanca cerebral, la resonancia magnética in vivo muestra sutil hiperintensidad bilateral (B1, ampliada en los recuadros). Las áreas hiperintensas son más evidentes en la autopsia resonancia magnética (B2) de alta resolución. La mancha LFB de una sección histología 4 micras muestra que estas áreas se desmielinizadas (B3). Después de la comparación con la línea base in vivo resonancia magnética y una mancha de hematoxilina-eosina y, del lado derecho se determinó que es una anormalidad anatómica, no una lesión desmielinizante. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="archivos de código suplementarios" src="/files/ftp_upload/54780/54780supplementalfiles.jpg" /> Archivos de código suplementarios. Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54780/Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a> Brain_Slicer_Parts_Human.stl: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54780/Brain_Slicer_Parts_Human.stl" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a> Cap_Insert.stl: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54780/Cap_Insert.stl" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

El objetivo general de este protocolo es para alinear con precisión los volúmenes de imágenes magnéticas resonancia nuclear (RMN) con secciones histológicas a través de la creación de los titulares del cerebro en 3D impresos personalizados y cajas de la máquina de cortar.

Utilizando tecnología de impresión 3D se fusiona con la RM Histología: Un protocolo para el Cerebro de seccionamiento

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

El objetivo general de este protocolo es alinear con precisión volúmenes de imágenes de resonancia magnética con secciones de histología mediante la creación de porta-cerebros y cajas cortadoras personalizadas impresas en 3D. Aunque este video se centra en el tejido cerebral extraído del marmoseto, este protocolo puede aplicarse a cualquier cerebro, ya sea de roedor, primate no humano o humano. Prepare una estación de trabajo tal como se describe en el protocolo.Llene el tubo con Fomblin y gasa hasta la marca de 20 mililitros. Comprima la gasa para eliminar las burbujas de aire en el proceso. Seque suavemente el cerebro del formaldehído.Luego, inserte el cerebro con la parte frontal hacia el fondo del tubo. Sujete cuidadosamente el cerebro en el tubo utilizando gasa alrededor de los lados del cerebro para fijar su posición. Llene el resto del tubo con gasa y Fomblin.Retire cuidadosamente las burbujas de aire durante el proceso. Luego asegure la tapa y selle el tubo con parafina. Marque la tapa y la línea con la hendidura interhemisférica.Luego envuelva el tubo en una toalla de papel e insértelo en la bobina con la marca en la posición central superior. Inserte la bobina en el escáner de MRI. Después de la adquisición y el posprocesamiento, obtenemos una imagen ponderada en T2 que podemos utilizar para crear un modelo digital del cerebro.Abra la resonancia magnética en la orientación coronal. Luego, utilice las herramientas de transformación para remuestrear la imagen a vóxeles isotrópicos de 1 milímetro. A continuación, aplique un filtro de reducción de ruido no lineal.Seleccione la tabla de búsqueda de visualizaciones. Luego haga clic en el botón de umbral dual. Arrastre el control deslizante en el gráfico para cubrir todo el cerebro.Cree una máscara binaria del cerebro utilizando el algoritmo de segmentación Umbral con valores mínimo/máximo. Ingrese el valor ubicado en la esquina inferior izquierda del gráfico de intensidad, justo debajo de la escala, en el cuadro de límite inferior. Luego seleccione Binario y desactive la casilla Umbral inverso.Seleccione el algoritmo morfológico, Rellenar huecos. Marque Procesar en 2.5D. Para rellenar el espacio entre el cerebro posterior y la corteza, seleccione la línea VOI.Dibuje una conexión entre el cerebro posterior y la corteza en ambos lados del cerebro en el punto más lateral. Continúe dibujando conexiones de VOI a través del cerebro. Convierta los VOI en una máscara binaria.Utilice la calculadora de imágenes para combinar las máscaras binarias de VOI y cerebro seleccionando la operación OR. Seleccione Promover el tipo de imagen de destino. Ahora seleccione el algoritmo morfológico: Rellenar huecos.Y verifique el Proceso en 2.5D. Seleccione el algoritmo Extraer superficie, seleccione Imagen de máscara, ingrese un nombre y luego seleccione el tipo de archivo ply. Los espacios en el cuadro de corte correspondientes a la ubicación del plano de corte se pueden colocar comenzando desde la parte frontal del cerebro, la parte posterior del cerebro o en relación con un área de interés, como las lesiones en la materia blanca que se observan aquí.Utilizando VOI de cuadro, dibuje un cuadro alrededor del cerebro. Copie y pegue el cuadro en el número de cortes de RM correspondientes al grosor previsto de los espacios entre placas. Luego avance el número de cortes de RM por sección y coloque el cuadro como antes para crear otro espacio entre láminas.Repita este proceso a través del cerebro. Invierta las VOI de la caja en una máscara binaria. Luego extraiga la superficie utilizando la extracción de superficie como se hizo anteriormente para el cerebro.Seleccione la máscara binaria del espacio de la cuchilla. Utilice la operación matemática de imagen para multiplicarla por 10.000. Luego, utilice la calculadora de imágenes para sumar la máscara binaria multiplicada a la resonancia magnética isotrópica remuestreada.Ahora, al seleccionar la vista triplanar, se puede observar un mapa de corte por RM que muestra la ubicación en la que se seccionará el cerebro en tres vistas ortogonales. En Netfabb Professional, seleccione Agregar pieza. Luego seleccione el modelo de separación de corte y los modelos ply del cerebro.Seleccione el modelo de cerebro y haga clic en el modo de reparación. Utilice el botón de selección de capa para seleccionar el cerebro. Luego, cambie la selección a las otras capas y elimínelas.Luego aplique la reparación y retire la parte antigua. Con el cerebro seleccionado, elija Mover. Haga clic en el origen y registre los parámetros en las cajas X, Y y Z.Estos son necesarios para mantener la posición del espacio entre las cuchillas. Haga clic en traducir y cierre la ventana.Seleccione el modelo de separación de láminas y transládalo utilizando los parámetros registrados en el paso anterior. Seleccione el modelo de cerebro y haga clic en el modo de reparación. Utilice el botón de selección de capa para seleccionar el cerebro.Luego seleccione Triángulos suaves. Ingrese cuatro como número de iteraciones. Y marque Evitar la reducción de volumen.Seleccione Reducir triángulos e ingrese 200000 en el cuadro Cantidad objetivo de triángulos. Luego seleccione Reparación automática y realice una reparación predeterminada. Aplique la reparación.Luego exporte el modelo del cerebro suavizado como un archivo STL. Importe el modelo del cerebro suavizado a Meshmixer. Utilice las herramientas de escultura para suavizar las áreas dibujadas con las VOI de línea.Y corrija cualquier otro defecto menor en el modelo. Importe el modelo de cerebro editado y suavizado a Netfabb Professional. Luego agregue la pieza, las piezas del cortador de cerebro para marmoset.Seleccione las carcasas para las piezas. Luego, cambie el nombre de cada pieza según se describe en el protocolo. Utilizando la configuración de selección descrita en el protocolo, haga clic y arrastre las piezas para posicionar el cerebro en el centro del cuadro.Haga clic y arrastre las partes para ajustar la profundidad del cerebro en el cuadro. Seleccione el modelo de cerebro suavizado y editado, en el modelo recortado del cuadro y seleccione la operación booleana. Haga clic en el modelo de cerebro para que se vuelva rojo.Y seleccione sustracción booleana. Aplique los cálculos. Marque la casilla para los voladizos que impedirán la colocación adecuada del cerebro.Consulte la sección suplementaria del protocolo para un método que permita eliminarlos. Seleccione el modelo de separación de la cuchilla y haga clic en mover. Registre en la posición Z.Esta será la posición del espacio más posterior entre las cuchillas. Luego cierre la ventana. Seleccione la pieza de la cuchilla entre las piezas del cortador de cerebro y haga clic en Mover.Introduzca el valor Z del paso anterior. Y luego introduzca los valores actuales de las posiciones X e Y. Seleccione la traslación absoluta y traslade.Haga clic en Duplicar. Si el grosor de la sección es constante, como se muestra aquí, ingrese el número total de cuchillas y el recuento total y el recuento Z, y escriba el grosor de la sección en el cuadro de separación Z. Luego seleccione duplicar.Seleccione la pieza de la cuchilla del micrótomo de las piezas del cortador de cerebro. Repita los mismos pasos de movimiento y duplicación realizados con la pieza de la cuchilla. Seleccione todas las cuchillas del micrótomo y el soporte principal de la cuchilla y haga clic en la operación booleana.Seleccione todas las cuchillas del micrótomo para que se vuelvan rojas y haga clic en sustracción booleana. Luego aplique los cálculos. Ingrese al modo de reparación y seleccione reparación automática.Realice una reparación extendida y aplique la reparación. Exporte el soporte de la cuchilla como un archivo STL. Seleccione todas las cuchillas, las cajas principal y secundaria, y el modelo de cerebro editado y suavizado, y haga clic en la operación booleana.Utilice la ventana de selección de piezas para volver rojas todas las piezas, excepto la caja principal. Luego seleccione la resta booleana. Aplique los cálculos.Ingrese al modo de reparación y marque la casilla para identificar bordes afilados que podrían lesionar el cerebro. Estos pueden repararse en el modo de reparación de Netfabb o mediante las herramientas de escultura en Meshmixer.Luego seleccione Reparación automática. Realice una Reparación extendida. A continuación, aplique la reparación.Exporte la caja cerebral como un archivo STL. En Cura, seleccione Cargar e importe la Caja Cerebral. Haga clic en el botón Girar.Luego, haga clic y arrastre para colocar la caja plana. Edite la configuración de impresión tal como se muestra en el protocolo. A continuación, guarde la trayectoria de la herramienta.Siga el mismo procedimiento para el soporte de la cuchilla y también duplique el objeto. Luego guarde la trayectoria de la herramienta. Después de aplicar una capa fina de pegamento sobre la plataforma de impresión, imprima la caja para el cerebro y los soportes de cuchilla en la impresora 3D utilizando la configuración descrita en el protocolo.Después de que finalicen las impresiones, se puede preparar el cerebro para el corte. Configure una estación de trabajo según se describe en el protocolo. Coloque cuidadosamente el cerebro en la caja y asegúrese de que esté firmemente en su lugar.Coloque las cuchillas del micrótomo en el portacuchillas, en las ranuras correspondientes de la caja. Con guantes de protección puestos, presione firmemente hacia abajo sobre los portacuchillas. Aplique presión lenta y equilibrada para cortar el cerebro.Retire los bloques uno a la vez, comenzando desde la parte frontal del cerebro. Aunque este enfoque es sencillo, el método requiere muchos pasos, así como el uso de varios tipos de software, y los investigadores deben familiarizarse con las interfaces de usuario antes de comenzar el procedimiento. Este flujo de trabajo resume el protocolo para fabricar la caja cortadora de cerebro de marmoseta.El cerebro se fija con formalina y se adquiere una resonancia magnética ponderada en T2 a 150 micrones. Las imágenes se procesan y umbralizan para crear una máscara binaria. Luego, la superficie se renderiza en software de modelado 3D.Una sustracción booleana entre una plantilla cortadora y el modelo cerebral crea el modelo digital del cortador cerebral. Luego, la caja cortadora se imprime en una impresora 3D. A continuación, el cerebro se coloca firmemente dentro de la caja cortadora para su sección.Una vez que el cerebro está seccionado, una comparación visual entre las imágenes de MRI in vivo y post mortem y las fotografías de las superficies superficiales de los bloques revela una buena coincidencia de orientación en múltiples bloques. Una comparación más detallada entre la MRI post mortem de alta resolución y las secciones histológicas teñidas con CV-LFB de múltiples bloques cerebrales demuestra una coincidencia precisa y consistente en todas las estructuras del cerebro del marmoseto. En este modelo animal de esclerosis múltiple, los animales desarrollan lesiones en la sustancia blanca distribuidas por todo el cerebro.Mediante esta técnica, lesiones pequeñas detectadas mediante resonancia magnética in vivo pueden rastrearse tanto en cortes de resonancia magnética post mortem como en secciones de histología. La histología y la resonancia magnética post mortem también pueden revelar lesiones que pasaron desapercibidas en la resonancia magnética in vivo. En este caso, la resonancia magnética in vivo no mostró evidencia concluyente de una señal hipointensa normal que sugiriera lesiones en ninguno de los dos trayectos ópticos.Sin embargo, en la resonancia magnética post mortem, se observaron hiperintensidades de señal en el tracto óptico. Y estas áreas correspondieron directamente con las lesiones mielinizadas observadas en la sección histológica con LFB CV. Por lo tanto, en conclusión, la metodología presentada aquí permite a los investigadores evaluar con precisión la patología subyacente a los hallazgos de resonancia magnética.Consideramos que es un enfoque prometedor para identificar nuevos biomarcadores de enfermedades que afectan al cerebro y de procesos patológicos específicos, como la inflamación y la remielinización.

utilizing-3d-printing-technology-to-merge-mri-with-histology-protocol

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Utilizando resonancias magnéticas (humanas), software de imágenes 3D y análisis inmunohistológicos, documentamos los cambios en los ventrículos laterales del cerebro. El mapeo longitudinal en 3D de los cambios en el volumen del ventrículo lateral y la caracterización de los cambios celulares periventriculares que ocurren en el cerebro humano debido al envejecimiento o la enfermedad se modelan en ratones.

Modelado 3D del lateral Ventrículos y histológico Caracterización de Tejidos periventricular en los seres humanos y de ratón

El uso de múltiples ángulos para cortar el cerebro pup ratón, mejoramos sobre una rebanada cerebral agudo descrito previamente-que captura las conexiones entre la mayoría de las principales estructuras del mesencéfalo y el prosencéfalo auditivas.

Modificación de un Colliculo-tálamo-cortical del ratón Cerebro Loncha, incorporación de la impresión 3-D de la Cámara Componentes e Imagen óptica multi-escala

Este artículo describe un método sencillo para preparar pequeños cerebros animales micro-CT en la proyección de imagen, en que las lesiones se pueden cuantificar y electrodos con alta precisión en el contexto de todo el cerebro.

Un método basado en el Micro-CT para caracterizar las lesiones y la localización de electrodos en cerebros de animales pequeños

Este artículo presenta un protocolo experimental que utiliza la tecnología de escaneo 3D que une dos escalas espaciales: la escala espacial macroscópica de la anatomía de todo el cerebro fotográfica a &gt;100 m y la escala espacial microscópica de las distribuciones neuronales utilizando inmunohistoquímica y un sistema de matriz de multielectrodos y otros métodos (10 m).

Tecnología de escaneo 3D Bridging Microcircuits e Macroscale Brain Images en 3D Novel Embedding Overlapping Protocol

Introducimos un protocolo semiautomático para el análisis de formas en estructuras cerebrales, incluida la segmentación de imágenes mediante software abierto, y más análisis de formas en grupo mediante un paquete de modelado automatizado. Aquí, demostramos cada paso del protocolo de análisis de forma 3D con segmentación hipocampal a partir de imágenes de RM cerebral.

Modelado de formas tridimensionales y análisis de estructuras cerebrales

La esclerosis múltiple es una enfermedad desmielinante inflamatoria sin cura. El análisis del tejido cerebral proporciona pistas importantes para entender la patogénesis de la enfermedad. Aquí discutimos la metodología y el análisis posterior del tejido cerebral de la ESCLEROSIs recogido a través de un programa único de autopsia rápida en funcionamiento en la Clínica Cleveland.

Programa integral de autopsias para individuos con esclerosis múltiple

El protocolo describe la fabricación de impresiones tridimensionales completamente coloreadas de modelos de cráneo anatómico específicos del paciente que se utilizarán para la simulación quirúrgica. Se explican los pasos cruciales para combinar diferentes modalidades de imagen, segmentación de imágenes, extracción de modelos tridimensionales y producción de impresiones.

Impresión 3D multicolor de tumores intracraneales complejos en neurocirugía

El método descrito a continuación tiene como objetivo proporcionar un protocolo completo para la preparación de neurocirugía de primates no humanos (NHP) utilizando una novedosa combinación de métodos de impresión tridimensionales (3D) y extracción de datos por resonancia magnética.

Una caja de herramientas basada en RMN para la planificación neuroquirúrgica en primates no humanos

El protocolo proporciona un método detallado de imágenes neuronales en cortes cerebrales utilizando un método de limpieza de tejidos, ScaleSF. El protocolo incluye la preparación del tejido cerebral, la clarificación del tejido, el manejo de rodajas despejadas y la microscopía de escaneo láser confocal de las estructuras neuronales desde los niveles mesoscópicos hasta los microscópicos.

Un método de limpieza de tejidos para imágenes neuronales de escalas mesoscópicas a microscópicas

A pesar del papel crucial del plexo coroideo en el cerebro, los estudios de neuroimagen de esta estructura son escasos debido a la falta de herramientas fiables de segmentación automatizada. El presente protocolo tiene como objetivo garantizar la segmentación manual del plexo coroideo de referencia que pueda servir de base para futuros estudios de neuroimagen.

Segmentación manual del plexo coroideo humano mediante resonancia magnética cerebral

El presente protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para la limpieza óptica rápida y simultánea, el marcaje multirredondo y la reconstrucción volumétrica en 3D de decenas de secciones cerebrales humanas postmortem mediante la combinación de la técnica de transformación tisular corta (S WITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-tiodiethanol [TDE]) con imágenes de microscopía de fluorescencia de lámina de luz en un protocolo rutinario de alto rendimiento.

Aclarado óptico y etiquetado para microscopía de fluorescencia de lámina de luz en imágenes cerebrales humanas a gran escala

Aprende a alinear imágenes de resonancia magnética con secciones histológicas mediante soportes cerebrales impresos en 3D personalizados. Este protocolo computacional permite correlaciones radiológicas precisas en neuroimagen.

Utilizando tecnología de impresión 3D se fusiona con la RM Histología: Un protocolo para el Cerebro de seccionamiento

Explorar más videos