La detección de alto rendimiento de los patógenos respiratorios de especímenes animales por PCR nanoescala

El objetivo general de esta metodología de prueba de PCR en tiempo real es detectar patógenos basados en ADN y ARN juntos de una manera de alto rendimiento. El ácido nucleico de las muestras clínicas se preamplificará con un grupo de cebadores común cargado en una placa OpenArray y se analizará para detectar la presencia de patógenos. Este método puede ayudar a promover los esfuerzos de vigilancia de las enfermedades infecciosas en OneHealth.

En comparación con las técnicas tradicionales, este método permite analizar más muestras para más objetivos sin competir entre sí, lo que mejora la eficiencia de las pruebas. El método utiliza una placa de PCR a nanoescala personalizada. Los cebadores y las sondas se imprimen en los bordes de los orificios pasantes y las muestras se cargan mediante un manipulador de líquidos.

Demostraremos el método en muestras clínicas que se están analizando para un panel de patógenos respiratorios de caballos y perros. Para comenzar este procedimiento, diseñe la placa como se describe en el protocolo de texto. La placa utilizada aquí está configurada con 18 objetivos por triplicado.

Agregue medios a los hisopos y lavados traqueales para que haya al menos uno o dos mililitros de líquido. Agite el hisopo y el DMEM vigorosamente en el tubo. A continuación, utilice una pipeta para transferir aproximadamente 1 mililitro de medio a un tubo nuevo.

Agregue 235 microlitros de tampón de lisis y 175 microlitros de muestra a cada tubo de perlas. Proceda con el protocolo del fabricante para extraer el ácido nucleico total. Prepárese para la transcripción inversa y la preamplificación del ácido nucleico o preamplificador como se describe en el protocolo de texto verificando primero el mapa de muestra.

Agregue 8,5 microlitros de mezcla maestra de preamplificador y 5,5 microlitros de muestra de ADN/ARN a cada pocillo de una placa estándar de 96 pocillos utilizando solo el lado izquierdo de la placa. Después de combinar las muestras, los controles positivos y los controles negativos con la mezcla del preamplificador, selle completamente la placa estándar de 96 pocillos con un sello adhesivo transparente. Retire cualquier exceso de sellado con una cuchilla de afeitar para evitar la formación de espacios de sellado durante el ciclismo.

Centrifugar la placa sellada durante 20 segundos con un girador de placas PCR. Verifique que todos los reactivos estén combinados en el fondo de los pocillos de placa. Después de encender un termociclador convencional, seleccione el programa de ciclo de preamplificación e inicie el programa.

Coloque la placa de 96 pocillos en el termociclador solo cuando la parte inferior del termociclador alcance la temperatura requerida para la producción de ADNc monitoreando la lectura de temperatura en la pantalla. Una vez que se complete la ejecución del preamplificador, verifique que la placa haya permanecido sellada. Después de ponerse los guantes dobles y las fundas de las mangas, retire el sello de la placa del preamplificador.

Luego, quítese y deseche con cuidado los guantes exteriores. Diluya los productos de preamplificación del uno al cinco añadiendo 56 microlitros de tampón TE a cada pocillo de columnas del uno al seis de la placa de preamplificación de 96 pocillos y mezclando pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Para ello, vaya solo al primer tope de la pipeta, aspire desde la parte inferior y dispense más arriba, pero no cree burbujas.

Agregue búfer TE a las seis columnas, independientemente de los pozos no utilizados. Prepárese para la transferencia de 384 pocillos a la placa de amplificación como se describe en el protocolo de texto. Una vez completados los pasos de preparación, póngase unos guantes dobles nuevos y bien ajustados y cubremangas.

Debido a las altas tasas de evaporación al pipetear volúmenes bajos, es fundamental dispensar la mezcla maestra y la muestra de manera eficiente y sellar la placa de inmediato. Agregue 2.5 micro litros de mezcla maestra de amplificación a una placa de 384 pocillos. Las placas blancas se utilizan aquí con fines de demostración, pero las placas negras deben usarse para reducir la fatiga visual.

Transfiera 2,5 microlitros del producto de preamplificador diluido a la placa de 384 pocillos de acuerdo con el mapa en el protocolo de texto. Los dados de colores que se muestran aquí ilustran la secuencia de transferencia de una pipeta de canal fijo. Cubra inmediatamente la placa herméticamente con un sello de aluminio.

Deseche los guantes exteriores y las fundas de las mangas. Centrifugar la placa de 384 pocillos durante 20 segundos en el girador de placas PCR. No retire el sello de aluminio, pero coloque la placa de 384 pocillos en el manipulador de líquidos.

Abra el paquete que contiene una placa de amplificación encapsulada y colóquelo con cuidado en el manipulador de líquidos en la primera ranura con el número de serie a la derecha, sostenga la caja por los bordes sin tocar la superficie de la placa. Retire el sello de aluminio de la placa de 384 pocillos dentro del manipulador de líquidos una vez que todo esté en su lugar. Haga clic en siguiente y, a continuación, marque todas las casillas a medida que se complete cada paso.

Cierre la puerta del manipulador de líquidos e inicie inmediatamente el proceso de llenado. Permanezca junto al manipulador de líquidos e inmediatamente proceda al siguiente paso una vez que la placa esté llena. Mientras el manipulador de líquidos está funcionando, retire la película protectora de la parte inferior de la tapa de la caja.

Deje la película superior en su lugar. Imprima la cinta roja tirando ligeramente para liberarla del adhesivo. Retire la placa de amplificación cargada del manipulador de líquidos y colóquela suavemente en la prensa de placas con el número de serie a la derecha.

Coloque la tapa encima de la placa con el extremo con muescas a la derecha y el adhesivo en la parte inferior. Tire hacia abajo de la palanca de presión de la placa cerrándola con cuidado, la luz parpadeará durante 20 segundos. No toque la prensa de placas durante este tiempo.

Una vez que la luz se vuelva verde fija, levante la palanca y retire con cuidado la placa sellada sosteniéndola por los bordes. Mientras sostiene la placa de amplificación sellada verticalmente por los bordes de la caja, inserte inmediatamente la punta de la jeringa en el puerto de carga en el extremo de la caja, luego dispense el líquido de inmersión lentamente con un movimiento suave y continuo para llenar el espacio entre la placa y la tapa. Deje una pequeña burbuja de aire en la esquina una vez que la placa esté sumergida.

Mientras continúa sosteniendo la placa verticalmente por los bordes, selle el puerto de carga insertando el tapón en el puerto y girando el tapón en el sentido de las agujas del reloj, aplique suficiente presión hasta que el mango se rompa. Limpie la carcasa con una toallita sin pelusa que haya sido rociada a fondo con etanol. Para secar la funda, límpiala hacia abajo con una toallita limpia.

Lleve la placa sellada a la máquina de amplificación. En la pestaña de instrumentos, seleccione consola de instrumentos. Seleccione la máquina de amplificación y luego haga clic en el botón de abrir la puerta.

Coloque la placa de amplificación en la primera ranura del adaptador de placa, verificando que el adaptador esté correctamente alineado con uno en la esquina superior izquierda. Oriente la placa con el código de barras hacia arriba y hacia la parte delantera del instrumento. Después de hacer clic en el botón de cerrar la puerta, navegue hasta la pestaña de inicio en la parte inferior de la pantalla.

En el menú de ejecución, seleccione OpenArray. Haga clic en obtener identificaciones de placa. Para comenzar la ejecución, haga clic en iniciar ejecución.

Abra una hoja de cálculo que contenga la macro de resultados. En el archivo de datos exportado, haga clic con el botón derecho en la pestaña en la parte inferior de la pantalla y seleccione mover o copiar. En el campo para reservar, seleccione macro de resultados.

A continuación, haga clic en mover para finalizar y marque la casilla creada como copia. Finalmente, haga clic en Aceptar. Elimine la pestaña de exportación anterior y, a continuación, cambie el nombre de la pestaña recién agregada a exportación.

Haga clic en ver, luego en macros, seleccione macro y, a continuación, haga clic en ejecutar. A continuación, repita esto para Macro2 haciendo clic en ver, luego en macros, seleccionando Macro2 y haciendo clic en ejecutar. En el software de la máquina de amplificación, verifique las curvas de cada muestra y contrólelas a la tabla de macros seleccionando el gráfico de análisis/amplificación en el lado izquierdo de la pantalla.

A continuación, seleccione la pestaña de muestra y haga clic en cada muestra para confirmar que hay dos o tres curvas de amplificación positivas para cada uno de los resultados positivos de la tabla. Las lecturas de fluorescencia se trazan en función de los ciclos de amplificación para ilustrar que la PCR en tiempo real se realizó con éxito. La mayoría de las muestras alcanzaron niveles umbral relativos entre los ciclos dos y 25 de la reacción de PCR en tiempo real.

trazan curvas estándar ejecutadas en tres días diferentes para demostrar la linealidad y el rango de amplificación utilizando controles positivos. Los valores umbral del ciclo se representan en función del logaritmo en base 10 del número de copias del patrón de ácido nucleico. Las dos macros completarán los nombres de las muestras en la primera columna y el promedio de los tres valores de Ct para cada objetivo para aquellos con resultados positivos.

Los objetivos que no se amplificaron aparecen en blanco en esta tabla. Se muestran los resultados cuantitativos para 10 muestras clínicas y cuatro controles de rutina, como es el caso aquí, el control de amplificación negativo debe ser negativo para todos los objetivos y el control de extracción negativo solo debe contener el control interno. Una muestra de este conjunto muestra un control interno fallido, lo que indica la presencia de inhibidores en la muestra.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un experimento de PCR a nanoescala. Este procedimiento facilitará la ejecución de paneles basados en el síndrome en el diagnóstico veterinario. Este método se puede adaptar para incluir ensayos sobre los agentes causales de muchas enfermedades infecciosas diferentes.