Name: La detección de alto rendimiento de los patógenos respiratorios de especímenes animales por PCR nanoescala (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprenda a detectar patógenos respiratorios de ADN y ARN en perros y caballos mediante PCR nanoescala de alto rendimiento. Este método mejora la eficiencia diagnóstica veterinaria y apoya la vigilancia OneHealth.

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El trabajo sobre los ensayos de patógenos respiratorios descritos aquí fue apoyada por los fondos de desarrollo interno de Cornell Centro de Diagnóstico de Salud Animal. Desarrollo de la nanoescala flujo de trabajo PCR y sistemas de aseguramiento de la calidad fue financiado parcialmente (FOA PA-13-244) y realizado en colaboración con el Laboratorio de Investigación Veterinaria de la Administración de Drogas y Alimentos y la Red de Respuesta (FDA Vet-LIRN) con la subvención No. 1U18FD005144- 01. Los gastos de publicación fueron patrocinados por VWR y Quanta Biosciences. Agradecemos a Gabrielle Nickerson, Roopa Venugopalan, Veldina Camo, Xiulin Zhang, Jinzhi Yu, Wang Weihua, y Katrina Walker por su ayuda con la escritura y la revisión del protocolo. Agradecemos a Mike Carroll para filmar las entrevistas del autor. Finalmente Agradecemos al editor y tres revisores anónimos por sus útiles comentarios.

<ol><li>Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+scale+PCR+with+TaqMan+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoliter scale PCR with TaqMan detection.</a> Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).</li>
<li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34 (18), e123(2006).</li>
<li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+mRNA+using+real-time+reverse+transcription+PCR+%28RT-PCR%29%3A+trends+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems.</a> J Mol Endocrinol. 29 (1), 23-39 (2002).</li>
<li>McCall, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+benchmark+for+microRNA+quantification+algorithms+using+the+OpenArray+platform%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A benchmark for microRNA quantification algorithms using the OpenArray platform.</a> BMC bioinformatics. 17 (1), 138(2016).</li>
<li>Pozzi, A., Previtali, C., Cenadelli, S., Gandini, L., Galli, A., Bongioni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+traceability+of+cattle+using+an+OpenArray+genotyping+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic traceability of cattle using an OpenArray genotyping platform.</a> Anim Genet. 47 (1), 133-134 (2016).</li>
<li>Grigorenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+screening+for+blood-borne+viral%2C+bacterial%2C+and+protozoan+parasites+using+an+OpenArray+platform%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Multiplex screening for blood-borne viral, bacterial, and protozoan parasites using an OpenArray platform.</a> J Mol Diagn. 16 (1), 136-144 (2014).</li>
<li>Shu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+%28H1N1%29+pandemic+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J Clin Microbiol. 49 (7), 2614-2619 (2011).</li>
<li>Elia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+equine+herpesvirus+type+1+by+real+time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of equine herpesvirus type 1 by real time PCR.</a> J Virol Methods. 133 (1), 70-75 (2006).</li>
<li>Dreier, J., Störmer, M., Kleesiek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Bacteriophage+MS2+as+an+Internal+Control+in+Viral+Reverse+Transcription-PCR+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of Bacteriophage MS2 as an Internal Control in Viral Reverse Transcription-PCR Assays.</a> J Clin Microbiol. 43 (9), 4551-4557 (2005).</li>
<li>Pusterla, N., Hussey, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+Herpesvirus+1+Myeloencephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Equine+Pract%22%5BJournal%5D)">Equine Herpesvirus 1 Myeloencephalopathy.</a> Vet Clin North Am Equine Pract. 30 (3), 489-506 (2014).</li>
<li>Firth, C., Lipkin, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomics+of+emerging+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">The genomics of emerging pathogens.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 14, 281-300 (2013).</li>
<li>Lecuit, M., Eloit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+whole+genome+NGS+for+infectious+disease+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">The potential of whole genome NGS for infectious disease diagnosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1517-1519 (2015).</li>
<li>Dunne, G., Gurfield, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Veterinary+Diagnostic+Laboratory%2C+a+Model+for+the+One+Health+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Local Veterinary Diagnostic Laboratory, a Model for the One Health Initiative.</a> Vet Clin North Am Small Anim Pract. 39 (2), 373-384 (2009).</li>
<li>Moutailler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infection+of+Ticks%3A+The+Rule+Rather+Than+the+Exception%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Co-infection of Ticks: The Rule Rather Than the Exception.</a> PLOS Negl Trop Dis. 10 (3), e0004539(2016).</li>
</ol>

Marcia Slater y Elen Ortenberg son empleados de Thermo Fisher Scientific Inc., que produce reactivos e instrumentos utilizados en este artículo.

Este procedimiento se ha utilizado para las pruebas de rutina de patógenos respiratorios en nuestro laboratorio en el transcurso de seis meses (2-3 veces a la semana). También hemos tenido éxito utilizando el mismo procedimiento para el perfilado de patógenos entéricos en muestras fecales y bacterias aisladas en una placa personalizada por separado. Una vez que se producen las placas, el personal experimentado puede completar los pasos 2-7 el plazo de un día de trabajo normal. Los pasos más críticos son el sellado adecuado de la placa de preamplificador, la transferencia de muestras preamplificada entre las placas (que se debe hacer rápidamente para evitar la evaporación), y el recubrimiento final de la placa de amplificación. El uso de la hoja de cálculo macro como una guía para el análisis de resultado (comprobación de curvas para muestras y controles) también fue crítica, ya que reduce en gran medida la cantidad de tiempo y trámites necesarios para este proceso. La hoja de cálculo macro proporcionada es un ejemplo; tendría que ser modificado o re-creado para placas con diferentes configuraciones. Esto puede ser fácilmente performed por alguien con conocimientos básicos de hoja de cálculo. Debido a la muy pequeña cantidad de muestra se carga en la placa de amplificación (33 nl), se requiere pre-amplificación. En la optimización de este protocolo (no mostrado), se comparó un número de parámetros de preamplificación incluyendo la mezcla maestra, la adición de cebadores aleatorios, número de ciclos, el tiempo de recocido, y la dilución antes de la amplificación. Cada destino tiene sus propias condiciones óptimas, y los descritos aquí representan aquellos que rindió el mejor límite de detección global de nuestro panel. Este panel cubre una amplia gama de patógenos objetivos y tipos de muestras que se encuentran en las pruebas de diagnóstico veterinario de rutina, pero las modificaciones a los procedimientos de preamplificación puede ser necesario para los diferentes paneles. Las condiciones de amplificación fabricante optimizado se basan en un protocolo estándar basado en sonda de PCR en tiempo real con un 10 min a la activación de la enzima 95 ° C seguido de desnaturalización a 95 ° C y AnnEaling / extensión a 60 ° C. Los cebadores y sondas son pre-impreso en las placas también usando condiciones fabricante optimizados y por lo tanto no requieren de titulación. La combinación de los pasos de transcripción inversa y pre-amplificación para todas las muestras (independientemente del tipo de blanco) era necesario con el fin de mantener la eficacia del flujo de trabajo. Tener todas las muestras a transcripción inversa también es beneficioso para maximizar la sensibilidad. Por otra parte, el uso de una mezcla maestra para el preamplificador que está optimizado para minimizar los inhibidores permite versatilidad en la combinación de diferentes tipos de muestras en la misma placa. El Centro para el Control de Enfermedades (CDC) de ensayo de la matriz de influenza descrito por Shu et al. 7 y adaptado aquí para reacciones a escala de nanolitros es una gripe universal de un ensayo que sea apropiado para el análisis de muestras de humanos y animales de compañía. Fue diseñado para la detección universal de la matriz de genes de todos los virus de la influenza A utilizando rea escala microlitrocciones. Se ha utilizado en todo el mundo como parte de un panel de los CDC sobre Virus de la Influenza Humana y un panel de gripe porcina CDC. El ensayo 8 EHV-1 adaptada aquí detecta un importante patógeno respiratorio de los caballos que pueden causar abortos y las enfermedades neurológicas (revisado por Pusterla y Hussey 10). El significado de la adaptación de estas pruebas a una plataforma de alto rendimiento con un control interno especies independientes es que pueden ser incorporados en un enfoque de vigilancia OneHealth. Habiendo tanto de estos ensayos en una plataforma de pruebas de alto rendimiento facilitará la preparación de emergencia para las instalaciones clínicas, refugios y eventos de rendimiento. Los resultados descritos anteriormente eran representativos de todos los objetivos en la placa con la excepción de Mycoplasma cynos, que mostró considerablemente más variación en el rendimiento analítico. Esto era probablemente debido a la temperatura subóptima de fusión (Tm) de los cebadores, lo que debería ser, idealmente, desde 58 hasta 60 y# 176; C (la sonda ideales Tm es 68-70 ° C). Una limitación de esta plataforma es que se necesita más tiempo para diseñar y fabricar las placas que para ordenar sondas individuales, lo que limita la capacidad de modificar rápidamente secuencias. Otra limitación de PCR en tiempo real en general es la incapacidad para detectar novela o patógenos inesperados. Esto se puede superar, hasta cierto punto mediante el diseño de ensayos que responden a secuencias en múltiples especies, pero metodologías basadas imparciales secuenciación de todo el genoma son más adecuadas para el descubrimiento de nuevos agentes. 11,12 Nanoescala-PCR en tiempo real permite a un nuevo paradigma para el lugar de las pruebas basadas en especie, que es útil para reducir los costes de reactivos y laborales en el diagnóstico molecular de alto rendimiento basado en el síndrome. Las pruebas de panel de gran escala por este enfoque puede facilitar los esfuerzos de vigilancia OneHealth tales como los descritos por Dunne y Gurfield 13 y Moutailler et al. 14. Recolección de muestras de frotis temprano,generalmente dentro de 3 días de la aparición clínica, proporciona la mejor oportunidad para identificar la presencia de patógenos respiratorios. la aparición de enfermedades infecciosas es a menudo impredecible, y las pruebas que se pueden realizar en diferentes especies, sin necesidad de modificación de los reactivos son ideales para la preparación. Las futuras aplicaciones de esta tecnología son propensos a estar en patotipificación, perfiles de resistencia a los antibióticos, y otros paneles de diagnóstico clínico basados ​​en síndromes. Nanoescala-PCR en tiempo real es más útil para la detección rápida y de alto rendimiento de múltiples tipos de muestras y de patógenos, y se complementaría con enfoques imparciales o parcialmente sesgados a base de secuenciación para la identificación de nuevas y emergentes patógenos.

Con la demanda para la detección rápida y completa de múltiples agentes en el diagnóstico clínico para humanos y animales, métodos de diagnóstico molecular de un solo organismo para la detección de patógenos son difíciles de cumplir si no se utiliza un gran número de muestras que se está probando para una sola enfermedad. En el contexto veterinario, metodologías de diagnóstico de alto rendimiento son particularmente importantes debido a la necesidad adicional para cubrir los patógenos de una amplia variedad de especies. OneHealth enfoques para la gestión de las enfermedades transmitidas por los alimentos y la vigilancia de los patógenos emergentes son ejemplos de necesidades de pruebas que incluyen una serie de bacterias, virus (ADN o ARN basadas), parásitos y hongos. El desafío de la combinación de ensayos para múltiples analitos juntos (multiplexación) con el fin de mejorar la eficiencia de la prueba es una posible pérdida de sensibilidad y una gran carga para la optimización y validación de ensayos. reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real a escala de nanolitros (PCR) es un alternativo a la práctica de multiplexación que permite que muchas reacciones separadas puedan funcionar simultáneamente en la misma muestra 1. La plataforma OpenArray es una aplicación de este principio 2; que combina la tecnología de microarrays con PCR en tiempo real. Basado en el concepto de multiplexación espacial, cada muestra se analiza para un gran número de objetivos en separada agujeros pasantes. Esta plataforma se utilizó inicialmente con la unión de ADN de doble cadena a base de cianina química 2 y ahora está disponible para la química basada en sondas utilizando sondas de enfriamiento 3 oscuras. Esta plataforma ha sido utilizada principalmente para la caracterización genética en los seres humanos y los animales 4 5. Recientemente se ha adaptado para detectar ADN y ARN patógenos de la sangre por Grigorenko et al. 6 mediante un procedimiento de dos etapas de transcripción inversa / pre-amplificación (preamplificador). Se describe aquí un procedimiento basado en preamplificador de un solo paso para la detección de ambos tipos de agentes patógenos en sec respiratoriaretions y una variedad de otros tipos de muestras que se pueden realizar en su totalidad en un día de trabajo normal. Al finalizar el preamplificador de una sola etapa, las muestras se transfirieron a una placa de 384 pocillos, que es el formato aceptado por el sistema de manejo de líquidos automatizado que viene con este nanoescala plataforma PCR. El sistema señala a la mezcla maestra y de la muestra a través de la superficie de hasta 4 placas (192 muestras y controles) a la vez. Después de este proceso de carga, se describe cómo se amplifican muestras y se analizaron usando una hoja de cálculo macro que resume el promedio de 3 repeticiones técnica para cada combinación de muestra / diana en una tabla que quepa en una página impresa. Se estableció un método uniforme para el análisis de ADN y / o ARN extraído de muestras usando esta plataforma. Se extrajeron Una amplia variedad de muestras, transcribe inversa, y pre-amplificado en un formato de 96 pocillos, lo que minimiza la posibilidad de errores. muestras respiratorias analizadas incluyeron muestras nasales, faríngeas profundas hisopos,lavados trans-traqueales, lavado broncoalveolar, y el tejido pulmonar. Dado que algunos de los agentes probados también pueden estar presentes en la sangre periférica o las heces, incorporamos estos tipos de muestras en el procedimiento. Este flujo de trabajo optimizado ayuda a ahorrar tiempo y recursos en comparación con llevar a cabo experimentos en múltiples placas, permitiendo la prueba eficiente a través de patógenos y toxinas detección de genes basados ​​en panel en su lugar de pruebas individuales. El panel respiratoria ha demostrado aquí tenía 18 ensayos cada impresos por triplicado orificios pasantes, con capacidad para 48 muestras por placa. Los patógenos equinos detectados incluyen adenovirus equino 1 y 2, virus de la arteritis equina, virus de la rinitis equina A y B, virus del herpes equino (EHV) tipos 1 y 4, y Streptococcus equi. Los patógenos caninos incluyen coronavirus canino respiratoria (betacoronavirus), el virus del moquillo canino, adenovirus canino, virus de la parainfluenza canina, pneumovirus canino, Bordetella bronchiseptica y Mycoplasma Cynos. UNla gripe universal, también se incluyó un ensayo y un control interno (MS2 ARN del fago).

<table><tbody><tr><td>Reactivo lítico Zap-OGlobin II</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546138</td><td>Reactivo opcional para la preparación de muestras de sangre.</td></tr><tr><td>Kit de extracción (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>AM1840</td> Se <td>pueden sustituir otros kits de extracción apropiados para los tipos de muestra deseados. Este kit viene con PBS, tampón de lisis y tampón de lavado.</td></tr><tr><td>2x Mezcla de RT-qPCR de un solo paso (qScript, XLT, RT-qPCR de un paso, ToughMix)</td><td>Quanta Biosciences</td><td>95134-500</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de cebadores específicos de genes,</td><td>pedido personalizado de IDT</td><td></td><td>Puede ser generado por el usuario o comprado con las placas de amplificación.</td></tr><tr><td>Mezcla de cebador aleatorio</td><td>New England Biolabs</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>Placa estándar de 96 pocillos</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>N8010560</td><td>Puede ser cualquier placa que quepa en la máquina de PCR convencional utilizada.</td></tr><tr><td>Mezcla maestra de amplificación (mezcla maestra OpenArray)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4462164</td><td></td></tr><tr><td>Sello adhesivo transparente</td><td>Thermo-Fisher</td><td>430611</td><td></td></tr><tr><td>Sello de lámina</td><td>Placa de 384</td> pocillos <td>Excel Scientific AF-100</td><td></td></tr><tr>Placa<td>de</td> amplificación <td>4482221</td><td></td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td></tr><tr><td>(placa QuantStudio 12K Flex OpenArray)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4470813</td><td>Se puede personalizar con cualquier ensayo que cumpla con las condiciones estándar de TaqMan.</td></tr><tr><td>Kit</td><td>de accesorios Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4469576</td><td>Contiene las tapas de la caja, los tapones y el líquido de inmersión.</td></tr><tr><td>Consejos AccuFill</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems Máquina de</td><td></td> amplificación 4457246 <td></td></tr><tr><td>(Sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 12K Flex)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td></td> 4471090 <td></td></tr><tr><td>Manipulador de líquidos (sistema OpenArray AccuFill)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td></td><td>4457243 Se compra con la máquina de amplificación.</td></tr><tr><td>Software de diseño de imprimación (Primer Express)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4363991</td><td>Consulte las instrucciones del fabricante para conocer las especificaciones detalladas de la imprimación y la sonda.</td></tr><tr><td>Programa de análisis de imágenes (ImageJ)</td><td>NIH</td><td></td><td>Disponible en http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Programa de hojas de cálculo (Excel)</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Disponible en</td></tr><tr><td>https://products.office.com/en-us/excel DMEM</td><td>Thermo-Fisher/Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Disruptor tisular (TissueLyser II)</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador convencional (Veriti)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td>Se puede utilizar cualquier termociclador convencional con tapa calefactada.</td></tr><tr><td>Spinner de placas PCR</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>Este dispositivo tiene una sola velocidad (2.500 rpm); el rotor arranca cuando se cierra la tapa y se detiene cuando se pulsa el botón.</td></tr><tr><td>Tampón TE</td><td>Millipore</td><td>8890-100ML</td><td>10 mM Clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano, 1 mM Ácido etilendiaminotetraacético, pH 8,0</td></tr></tbody></table>

la detección de alto rendimiento de los patógenos respiratorios de especímenes animales por pcr nanoescala

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

En tiempo real a escala de nanolitros PCR utiliza multiplexado espacial para permitir que varios ensayos que se ejecutan en paralelo en una sola placa sin los inconvenientes típicos de la combinación de reacciones juntos. Hemos diseñado y evaluado un panel basado en este principio para identificar rápidamente la presencia de agentes patógenos comunes en perros y caballos con enfermedad respiratoria aguda. Este manuscrito describe un flujo de trabajo de PCR de diagnóstico a escala nanométrica para la preparación de muestras, amplificación y análisis de secuencias de patógenos objetivo, centrándose en los procedimientos que son diferentes de reacciones escala microlitro. En el panel respiratorio presentado, 18 ensayos se establecieron cada uno por triplicado, con capacidad para 48 muestras por placa. Una extracción y pre-amplificación de flujo de trabajo universal, se ha optimizado para la preparación de muestras de alto rendimiento para acomodar múltiples matrices y patógenos basados ​​en ADN y ARN. Los datos representativos se presentan para una diana de ARN (influenza A matriz) y una diana de ADN (virus del herpes equino1). La capacidad de probar con rapidez y precisión para un grupo amplio, basado en el síndrome de patógenos es una herramienta valiosa para mejorar la eficiencia y la ergonomía de las pruebas de diagnóstico y para el diagnóstico de la enfermedad respiratoria aguda y la gestión.

Los resultados se muestran en las figuras 1 y 2 para un ensayo representativo de ARN (matriz de influenza) y ensayo de ADN (EHV-1) con una combinación de controles positivos y muestras clínicas presentadas para las pruebas de diagnóstico de rutina. Las señales de fluorescencia emitida a lo largo de esta reacción típicas se muestran en la Figura 1, que representa gráficamente los valores de fluorescencia primas por ciclo. Todos los valores de ciclo umbral (Ct) relativa fueron generados automáticamente por el software de la máquina de amplificación. La fluorescencia de fondo se utiliza como un indicador separado para la evaluación de la calidad de carga en lugar de incorporarlo en las lecturas de fluorescencia antes de calcular los valores de Ct. El límite analítico de detección (LOD) para cada objetivo se calcula en base a la media general de los valores de Ct en el nivel de detección del 95%, más 2 desviaciones estándar en una piscina de controles paratodos los objetivos. La dilución más alta que al menos 95% de las réplicas fueron positivos para los ensayos representativos fue de 50 copias; detección de 5 copias fue exitosa en 50% de repeticiones. Ni ensayo se detectó a continuación una copia. Los límites de detección para el ensayo de ARN y ADN se calcularon en los valores de Ct de 21.92 y 20.05. Estos valores se consideraron los puntos de corte para los valores de informes positivos vs. sospechoso (potencialmente no repetible). Otros aspectos del rendimiento analítico de los objetivos se evaluó utilizando diluciones seriadas de controles positivos agrupados ejecutan en tres días diferentes (Figura 2). Las eficiencias promedio de los ensayos de ARN y ADN representativas fueron 101,1% y 106,6%; la eficiencia media global para todos los objetivos fue 101,3%. Los ensayos también tuvieron una buena linealidad (R 2&gt; 0,98). La variación dentro de la replicación a través de los orificios pasantes normalmente estaba dentro de desviaciones estándar de 0,2 para ambas muestras clínicas unacontroles d. No se observó reactividad cruzada entre cualquiera de los objetivos. Los resultados finales de hoja de cálculo en el archivo suplementario muestra resultados cuantitativos representativos de 10 muestras de diagnóstico clínico y 4 controles. Las muestras clínicas son un subconjunto de los tipos de muestras de exámenes de rutina incluyendo hisopos nasales / orofaríngeos, tejido pulmonar, y las muestras fecales. Un (equino) muestra fecal en este conjunto muestra un control interno MS2 fallido, lo que indica la presencia de inhibidores en la muestra. Normalmente, esto se consiguió por dilución de la muestra eluida y / o re-extracción. Como es el caso aquí, el control de amplificación negativo debe ser negativo para todos los destinos, y el control negativo de extracción debe contener solamente el control interno. En el conjunto clínico, las muestras producidas valores de Ct para betacoronavirus, Bordetella bronchiseptica, virus del moquillo canino A, virus de la parainfluenza canina, pneumovirus canina, y la influenzaA. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54781/54781fig1.jpg" /> Figura 1. gráficas de amplificación. Las lecturas de fluorescencia se representan frente a ciclos de amplificación para el ensayo de ARN (A) y ensayo de ADN (B). Los triángulos se muestran denotando valores de Ct. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781figure2.jpg" /> Figura 2. Las curvas de calibración. Las curvas de calibración del ensayo de ARN y ADN probado en tres días diferentes se representan con el fin de demostrar la linealidad y rango de amplificación usando los controles positivos. Ciclo umbral valores (Ct) se representan frente a log (10) del número de copias de ARN (A) o ADN ( <strong&gt; B) estándar. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="tabla 1" src="/files/ftp_upload/54781/54781table1.jpg" /> Tabla 1. esquemática de los lugares de la placa y de destino de amplificación. Las placas utilizadas para las pruebas de PCR en tiempo real a escala nanométrica en esta plataforma son microscopio de diapositivas de tamaño y están dispuestos en 48 submatrices de 64 a través de agujeros pasantes, con un total de 3.072 orificios pasantes para las reacciones individuales. Un subconjunto se muestra aquí, con 18 metas, por triplicado. Cada muestra se añade a una submatriz por el manipulador de líquidos. Las placas se recubren con compuestos hidrófilos e hidrófobos para retener reactivos a través de los agujeros a través de la tensión superficial. El chip de acero inoxidable está &quot;fotolitográfica modelado y grabado en húmedo para formar una matriz rectilínea de 3.072 micro-mecanizados, 320 micras diamete. r agujeros de 33 nl de cada &quot;2 Las abreviaturas para los objetivos son los siguientes: BCOR, coronavirus respiratorio canino (betacoronavirus); BORD, Bordetella CAV bronchiseptica, adenovirus canino; CPIV, virus de la parainfluenza canina; CPNV, pneumovirus canino; DISTA / B, canino virus del moquillo A y B; EADV1 / 2, adenovirus equino medio; EAV, el virus de la arteritis equina; EHV1 / 4, herpesvirus equino tipo 1/4; ERVA / B, equino virus rinitis A / B; IVM, influenza A matriz; MCYNOS, Mycoplasma cynos; MS2, el control interno (MS2 ARN del fago); SEQU, Streptococcus equi. <img alt="Tabla 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781table2.jpg" /> Se muestra la Tabla 2. Mapa de la transferencia de la Plata. Un mapa de transferencia de placa de un código de colores para el uso de una pipeta de 8 canales para transferir fijo de la placa de preamplificador de 96 pocillos a la placa de 384 pocillos. Alternativamente, una pipeta ajustable puede ser utilizada. El mismo procedimiento se realiza cada vez independientemente de h<html> ow muchas muestras están en la placa. <img alt="archivo suplementario" src="/files/ftp_upload/54781/54781sup.jpg" /> Archivo suplementario. Un archivo de hoja de cálculo habilitado para macros que contiene dos macros de resultados de formato en una tabla resumen (como se describe en el protocolo) se proporciona. Una tabla de resultados típicos generados por las macros se incluye en el archivo (en Resultados Finales). Las dos macros llenarán los nombres de las muestras en la primera columna (hasta 48 muestras) y el promedio de los tres valores de Ct para cada objetivo para las personas con resultados positivos; tenga en cuenta que los objetivos que no se amplifican aparecen en blanco en esta tabla. Esto se puede imprimir fácilmente en una hoja de papel y se utiliza como una referencia para la comprobación de los datos en bruto de manera eficiente. En la pestaña de resultados finales, se muestran resultados representativos para 10 muestras clínicas y 4 controles. Las abreviaturas de los nombres de ensayo se indican en la leyenda de la Tabla 1.www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para descargar este archivo.

pruebas de alto rendimiento de ADN y ARN patógenos basados ​​por nanoescala PCR se describe el uso de un canino sindrómica y el panel de PCR respiratoria equina.

La detección de alto rendimiento de los patógenos respiratorios de especímenes animales por PCR nanoescala

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

El objetivo general de esta metodología de pruebas de PCR en tiempo real es detectar simultáneamente patógenos basados en ADN y ARN de manera de alto rendimiento. El ácido nucleico proveniente de muestras clínicas será previamente amplificado con un conjunto común de cebadores cargado en una placa OpenArray y analizado para determinar la presencia de patógenos. Este método puede contribuir a impulsar los esfuerzos de vigilancia OneHealth para enfermedades infecciosas.En comparación con las técnicas tradicionales, este método permite analizar más muestras para más dianas sin que compitan entre sí, mejorando así la eficiencia del análisis. El método utiliza una placa de PCR personalizada a escala nanométrica. Los cebadores y las sondas se imprimen en los bordes de los orificios pasantes y las muestras se cargan mediante un manipulador de líquidos.Demostraremos el método en especímenes clínicos que se están analizando para un panel de patógenos respiratorios de caballos y perros. Para comenzar este procedimiento, diseñe la placa según se describe en el protocolo escrito. La placa utilizada aquí está configurada con 18 dianas en tríplica.Añada medio a los hisopos y lavados traqueales para que haya al menos uno a dos mililitros de líquido. Vortexe vigorosamente el hisopo y el DMEM en el tubo. Luego, use una pipeta para transferir aproximadamente 1 mililitro de medio a un tubo nuevo.Añada 235 micro litros de tampón de lisis y 175 micro litros de muestra a cada tubo con perlas. Continúe con el protocolo del fabricante para extraer el ácido nucleico total. Prepárese para la transcripción inversa y la preamplificación del ácido nucleico o preamp según se describe en el protocolo textual, primero verificando el mapa de muestras.Añada 8.5 µL de la mezcla maestra de preamplificación y 5,5 µL de la muestra de ADN/ARN a cada pocillo de una placa estándar de 96 pocillos utilizando únicamente el lado izquierdo de la placa. Después de combinar las muestras, los controles positivos y los controles negativos con la mezcla de preamplificación, selle completamente la placa estándar de 96 pocillos con un sello adhesivo transparente. Retire cualquier exceso de sello usando una cuchilla de afeitar para evitar la formación de espacios en el sello durante los ciclos.Centrifugue la placa sellada durante 20 segundos utilizando un centrífugo para placas PCR. Verifique que todos los reactivos se hayan reunido en el fondo de los pocillos de la placa. Después de encender un termociclador convencional, seleccione el programa de ciclado de preamplificación e inicie el programa.Coloque la placa de 96 pocillos en el termociclador solo cuando la parte inferior del termociclador alcance la temperatura requerida para la producción de ADNc, monitoreando la lectura de temperatura en la pantalla. Una vez finalizada la amplificación previa, verifique que la placa haya permanecido sellada. Después de ponerse dobles guantes y protectores de mangas, retire el sello de la placa de amplificación previa.Luego, retire con cuidado y deseche los guantes externos. Diluya los productos de preamplificación uno a cinco añadiendo 56 micro litros de tampón TE a cada pocillo de las columnas uno a seis de la placa de preamplificación de 96 pocillos y mezclando mediante pipeteo arriba y abajo. Para ello, vaya únicamente hasta el primer paro de la pipeta, aspire desde el fondo y libere el líquido más arriba, pero sin crear burbujas.Añada tampón TE a las seis columnas independientemente de los pocillos no utilizados. Prepárese para la transferencia a la placa de amplificación de 384 pocillos según se describe en el protocolo escrito. Tras completar los pasos de preparación, colóquese guantes dobles nuevos bien ajustados y protectores de mangas.Debido a las altas tasas de evaporación al pipetear volúmenes bajos, es fundamental dispensar la mezcla maestra y la muestra de manera eficiente y sellar la placa inmediatamente. Añada 2.5 micro litros de la mezcla maestra de amplificación a una placa de 384 pocillos. Las placas blancas se utilizan aquí con fines demostrativos, pero se deben usar placas negras para reducir la fatiga visual.Transfiera 2,5 µL del producto de preamplificación diluido a la placa de 384 pocillos según el mapa indicado en el protocolo escrito. Los dados de colores mostrados aquí ilustran la secuencia de transferencia para una pipeta de canal fijo. Cubra inmediatamente la placa herméticamente con un sello de aluminio.Deseche los guantes externos y las fundas de manga. Centrifugue la placa de 384 pocillos durante 20 segundos en el centrífugo para placas PCR. No retire el sello de aluminio, sino coloque la placa de 384 pocillos en el dispensador automático de líquidos.Abra el paquete que contiene la placa de amplificación encapsulada y colóquela cuidadosamente en el manipulador de líquidos en la primera ranura con el número de serie a la derecha; sostenga el estuche por los bordes sin tocar la superficie de la placa. Retire el sello de aluminio de la placa de 384 pocillos dentro del manipulador de líquidos una vez que todo esté en su lugar. Haga clic en siguiente y luego marque todas las casillas a medida que se complete cada paso.Cierre la puerta del manipulador de líquidos e inmediatamente comience el proceso de llenado. Permanezca junto al manipulador de líquidos y pase inmediatamente al siguiente paso una vez que la placa esté llena. Mientras el manipulador de líquidos está en funcionamiento, retire la película protectora de la parte inferior de una tapa del estuche.Deje la película superior en su lugar. Prepare la cinta roja tirando ligeramente para separarla del adhesivo. Retire la placa de amplificación cargada del manipulador de líquidos y colóquela suavemente en la prensa de placas con el número de serie a la derecha.Coloque la tapa encima de la placa con el extremo ranurado hacia la derecha y el adhesivo hacia abajo. Baje cuidadosamente la palanca de la prensa de placas hasta cerrarla; la luz parpadeará durante 20 segundos. No toque la prensa de placas durante este tiempo.Una vez que la luz se vuelva verde continua, levante la palanca y retire cuidadosamente la placa sellada sosteniéndola por los bordes. Mientras sostiene la placa de amplificación sellada verticalmente por los bordes del estuche, inserte inmediatamente la punta de la jeringa en el puerto de carga en el extremo del estuche y luego desprenda lentamente el fluido de inmersión en un movimiento suave y continuo para llenar el espacio entre la placa y la tapa. Deje una pequeña burbuja de aire en una esquina una vez que la placa esté sumergida.Mientras continúa sosteniendo la placa verticalmente por los bordes, selle el puerto de carga insertando el tapón en el puerto y girándolo en sentido horario; aplique presión suficiente hasta que la manija se rompa. Limpie la carcasa con una toallita libre de pelusas que haya sido rociada completamente con etanol. Para secar la carcasa, pásela hacia abajo con una toallita limpia.Lleve la placa sellada a la máquina de amplificación. En la pestaña del instrumento, seleccione la consola del instrumento. Seleccione la máquina de amplificación y luego haga clic en el botón de puerta abierta.Coloque la placa de amplificación en la primera ranura del adaptador de placas, verificando que el adaptador esté correctamente alineado con un uno en la esquina superior izquierda. Oriente la placa con el código de barras hacia arriba y en dirección frontal del instrumento. Después de hacer clic en el botón de cerrar puerta, navegue hasta la pestaña de inicio en la parte inferior de la pantalla.Bajo el menú de ejecución, seleccione OpenArray. Haga clic en obtener IDs de placa. Para iniciar la ejecución, haga clic en iniciar ejecución.Abra una hoja de cálculo que contenga la macro de resultados. En el archivo de datos exportado, haga clic con el botón derecho en la pestaña en la parte inferior de la pantalla y seleccione mover o copiar. En el campo destino, seleccione la macro de resultados.Luego, haga clic en mover al final y marque la casilla etiquetada como crear copia. Finalmente, haga clic en aceptar. Elimine la pestaña de exportación anterior y luego cambie el nombre de la pestaña recién agregada a exportación.Haga clic en Ver, luego en Macros, seleccione la macro y haga clic en Ejecutar. A continuación, repita este proceso para Macro2 haciendo clic en Ver, luego en Macros, seleccione Macro2 y haga clic en Ejecutar. En el software de la máquina de amplificación, revise las curvas de cada muestra y control comparándolas con la tabla de macros seleccionando Análisis/Gráfico de amplificación en el lado izquierdo de la pantalla.A continuación, seleccione la pestaña de muestras y haga clic en cada muestra para confirmar que hay dos o tres curvas de amplificación positivas para cada uno de los resultados positivos en la tabla. Las lecturas de fluorescencia se representan frente a los ciclos de amplificación para ilustrar que la PCR en tiempo real se realizó con éxito. La mayoría de las muestras alcanzaron niveles umbral relativos entre los ciclos 2 y 25 de la reacción de PCR en tiempo real.Se representan gráficas de curvas estándar obtenidas en tres días diferentes para demostrar la linealidad y el rango de amplificación utilizando controles positivos. Los valores del umbral de ciclo se grafican frente al logaritmo en base 10 del número de copias del estándar de ácido nucleico. Las dos macros completarán los nombres de las muestras en la primera columna y el promedio de los tres valores de Ct para cada diana en aquellos casos con resultados positivos.Los blancos que no se amplificaron aparecen vacíos en esta tabla. Se muestran los resultados cuantitativos para 10 muestras clínicas y cuatro controles de rutina; como es el caso aquí, el control negativo de amplificación debe ser negativo para todos los blancos y el control negativo de extracción debe contener únicamente el control interno. Una muestra en este conjunto presenta un control interno fallido, lo que indica la presencia de inhibidores en la muestra.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un experimento de PCR a escala nanométrica. Este procedimiento facilitará la realización de paneles basados en síndromes en diagnósticos veterinarios. Este método puede adaptarse para incluir ensayos para agentes causales de muchas enfermedades infecciosas diferentes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Un sistema integrado de chip microfluídico termoplástico ha sido desarrollado para su uso como un diagnóstico molecular. El chip realiza la extracción de ácido nucleico, la transcriptasa inversa y la PCR. Los métodos para fabricar y ejecutar el chip se describen.

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Cuantificación y caracterización del genoma completo del ARN del SARS-CoV-2 en muestras de aguas residuales y aire

Aquí, presentamos un flujo de trabajo rápido y rentable para caracterizar los genomas del virus de la rabia (RABV) utilizando tecnología de nanoporos. El flujo de trabajo está destinado a apoyar la vigilancia genómica a nivel local, proporcionando información sobre los linajes circulantes del RABV y su ubicación dentro de las filogenias regionales para guiar las medidas de control de la rabia.

Secuenciación del genoma completo para la caracterización rápida del virus de la rabia mediante tecnología de nanoporos

Presentamos dos kits internos de RT-qPCR de un solo paso basados en sondas para virus respiratorios comunes. El primer ensayo es para SARS-CoV-2 (N), influenza A (H1N1 y H3N2) e influenza B. El segundo es para SARS-Cov-2 (N) y MERS (UpE y ORF1a). Estos ensayos se pueden implementar con éxito en cualquier laboratorio especializado.

Desarrollo de ensayos multiplex de RT-qPCR en tiempo real para la detección de SARS-CoV-2, influenza A/B y MERS-CoV

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Detección rápida de patógenos bacterianos que causan infecciones del tracto respiratorio inferior a través de la amplificación isotérmica mediada por bucle basada en chips microfluídicos

Aquí, describimos un procedimiento simple y rápido para detectar ADN de patógenos de abejas, como Lotmaria passim y Nosema ceranae, utilizando una lisis celular lista para la amplificación, amplificación de polimerasa recombinasa y ensayos CRISPR/Cas12a.

Detección in situ de ADN de parásitos tripanosomátidos y Nosema ceranae mediante lisis alcalina acoplada al sistema RPA/CRISPR/Cas12a

Aprenda a detectar patógenos respiratorios de ADN y ARN en perros y caballos mediante PCR nanoescala de alto rendimiento. Este método mejora la eficiencia diagnóstica veterinaria y apoya la vigilancia OneHealth.

La detección de alto rendimiento de los patógenos respiratorios de especímenes animales por PCR nanoescala

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