La información estructural a partir de una sola molécula de FRET experimentos utilizando el Nano-posicionamiento Sistema Rápido

El objetivo general del sistema de nanoposicionamiento rápido es proporcionar información estructural en tiempo real de las biomoléculas mediante la combinación de experimentos FRET de una sola molécula con un análisis estadístico riguroso. Este método responde a preguntas clave en el campo de la biología estructural, como la localización de dominios flexibles en macromoléculas donde no se pueden aplicar las herramientas estándar de la biología estructural. La principal mejora de NPS rápido en comparación con otras herramientas estructurales basadas en FRET es que se pueden comparar diferentes modelos de tinte utilizando no solo las posiciones más probables, sino también una distribución de probabilidad tridimensional.

La principal ventaja de esta técnica es que combina datos estructurales de la base de datos de proteínas con mediciones cuantitativas de fluorescencia de una sola molécula. Para comenzar el procedimiento, ensamble una cámara de flujo y un portamuestras. Para preparar los tornillos de entrada y salida, enrosque el tubo de silicona en tornillos de lengüeta hueca y corte el tubo en línea recta en cada extremo con una cuchilla de afeitar.

Atornille los tornillos de lengüeta al portamuestras. Alinee los orificios deslizantes de cuarzo de la cámara de flujo con las roscas del portamuestras. Apriete suavemente los tornillos del soporte de vidrio para fijar la cámara de flujo en su lugar.

Enrosque trozos de tubo de silicona de 20 centímetros de largo en los tornillos de entrada y salida. Lave la cámara de flujo con 500 microlitros de PBS. A continuación, enjuague la cámara de flujo con 100 microlitros de solución de neutravidina en PBS, asegurándose de que se forme una gota en el extremo del tubo de entrada para evitar que el aire entre en la cámara de muestras.

Cierre los tubos de entrada y salida después de cada manipulación para excluir el aire de la cámara de flujo. Incubar la cámara durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego, lave la solución de neutravidina con 500 microlitros de PBS.

Agregue una gota de aceite de inmersión en el prisma y enrosque el prisma en la cámara de muestras. Los datos de FRET de una sola molécula se adquieren utilizando un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total. Inicie el software de la cámara y el software del piezomotor del escenario.

Monte la cámara en la platina del micrómetro del microscopio TIRF horizontalmente, lo más recta posible, y de tal manera que se cruce con los tres láseres. Agregue líquido de inmersión y enfoque el objetivo del microscopio verificando las reflexiones IR. Establezca los parámetros de la cámara, la ruta del archivo y los parámetros de incremento automático.

Inicie la transmisión de la cámara en vivo y blanquee la fluorescencia de fondo usando los tres láseres con intensidades completas. A continuación, baje las intensidades del láser. Luego, cargue 100 microlitros de una solución de perlas fluorescentes en la cámara.

Espere 10 minutos para que las cuentas se adhieran a la superficie de la cámara. Grabe una película con un campo de visión de 50 a 100 cuentas y realice un análisis de lote con un umbral de búsqueda de picos alto. Cargue el archivo de película y elija dos cuentas con centros distintos en esquinas opuestas del campo de visión.

Selecciona los píxeles de máxima intensidad en esas cuentas. Retire y limpie el prisma. Prepare una segunda cámara de muestra y atornille el soporte del prisma a la cámara.

Monte la cámara en la etapa del micrómetro. A continuación, cargue 100 microlitros de una solución de 50 a 100 picomolares de muestra biotinilada marcada con fluorescencia en la cámara. Espere a que las moléculas se unan a la superficie de la cámara.

Al mismo tiempo, haga clic en Tomar señal para iniciar la grabación y encender el láser de excitación del donante. Ajuste la potencia del láser para asegurarse de que al menos el 80% de las moléculas en el campo de visión estén blanqueadas, luego, mueva la cámara para mostrar un área sin blanquear y grabe la próxima película. Blanquea el resto de la cámara de muestras de esta manera.

Después de las mediciones en el microscopio TIRF, los datos adquiridos de FRET de una sola molécula deben analizarse para obtener la eficiencia media de FRET. Realice un análisis por lotes de las películas de donante y aceptor de la muestra. A continuación, cargue los archivos de película por lotes en el software de análisis de datos.

Haga clic en el botón NO seleccionado para indicar las fases FRET individuales. Haga clic en el comienzo del período FRET, luego en el punto de tiempo en el que la intensidad del aceptor disminuye debido al blanqueo y, finalmente, en el punto de tiempo en el que la intensidad del donante disminuye debido al blanqueo. En la siguiente ventana, seleccione Sí para mantener el seguimiento de la eficiencia de FRET seleccionado.

Una vez que se haya analizado cada molécula, guarde las trazas y analice la próxima película. Una vez completado el análisis, ejecute un script para combinar los resultados de FRET. Importe el archivo FRET combinado de fotogramas en el software de análisis de datos utilizando la opción de entrada predeterminada.

Represente los datos como un histograma y utilice la herramienta de ajuste de curva no lineal para ajustarlos a un gaussiano. El valor de excedido es la principal eficiencia de FRET. Utilice UV, VIS y espectroscopia fluorescente para determinar el radio de Forster isotrópico y los valores de anisotropía en estado estacionario para cada colorante.

El sistema de nanoposicionamiento se inspiró en el conocido GPS, ya que localizamos una posición desconocida, la antena, con varias posiciones conocidas, los satélites. Para comenzar el análisis de NPS, inicie el software FastNPS y cree un nuevo archivo de trabajo. Para definir las prioridades de posición de las antenas y satélites etiquetados, en la ventana ModelDyePrior, introduzca la resolución espacial de la posición que se está definiendo.

Excluya el interior de la macromolécula cargando el archivo PDB centrado correspondiente. Introduzca el diámetro del tinte y la distancia de esqueletización. Rellene las coordenadas de posición mínima y máxima de la posible ubicación del tinte.

Si la posición que se está definiendo es un satélite, seleccione la fijación de tinte a través de un enlazador flexible e introduzca las coordenadas del átomo desde el archivo PDB centrado. Rellene la longitud y el diámetro del enlazador. Haga clic en calcular volumen accesible, guarde la posición anterior y expórtela para su visualización.

Repita este proceso para todos los satélites y antenas. Una vez que se hayan definido las posiciones, abra la ventana Definir medición y cree una nueva molécula de tinte. Cargue la posición anterior asociada con ese tinte.

Rellene la anisotropía de fluorescencia, seleccione un modelo de tinte adecuado y active el tinte. Repite este proceso hasta que se hayan definido todos los tintes. A continuación, cree una nueva medida.

Seleccione un par FRET de los tintes definidos. Introduzca la eficiencia FRET de una sola molécula con error y el radio de Forster isotrópico de este par de colorantes, y active la medición. Repite esto para todos los pares de tintes.

A continuación, abra la ventana de cálculo. Si los tintes se han asignado a diferentes modelos, seleccione Definido por el usuario. De lo contrario, seleccione el modelo que desea usar para todos los tintes.

Realice el cálculo y abra la ventana de resultados. Al utilizar FastNPS, es importante recordar que hay que adaptar los modelos a todos los tintes para minimizar los volúmenes creíbles y, por supuesto, mantener la coherencia. Si la consistencia es inferior al 90 %, haga clic en Consistencia detallada e identifique los tintes comunes a las entradas con menos del 90 % de consistencia.

Abra la ventana Definir medición y cambie el modelo del tinte en cuestión. Vuelva a ejecutar el cálculo en el modo Definido por el usuario. Exporte los volúmenes creíbles de los tintes individualmente o como un lote.

Abra los archivos de densidad en el software de visualización y ajuste la credibilidad al nivel deseado. Se midieron las eficiencias de FRET de una sola molécula entre moléculas de antena desconocidas y varias moléculas satélite conocidas dentro de un complejo promotor abierto de ARN polimerasa de arqueasa. El análisis NPS de estos datos determinó los volúmenes creíbles de estas moléculas de colorante en relación con el complejo promotor abierto de ARN polimerasa de arqueasa.

Se utilizaron cinco modelos diferentes en los que se utilizaron las moléculas de colorante y se compararon los resultados. Los volúmenes creíbles fueron consistentes con los datos medidos cuando se calcularon con modelos que asumían que el tinte solo puede rotar libremente dentro de un cono de orientación desconocida. El modelo clásico en particular es el más conservador, ya que supone además que el tinte está en un lugar fijo.

Esto crea un volumen creíble relativamente grande, pero el volumen generalmente encierra la posición correcta. Los modelos de mayor precisión utilizan la suposición de que el tinte es completamente libre de rotar dentro de su vida útil de fluorescencia. El modelo iso, al igual que el modelo clásico, asume que el tinte está en una posición fija dentro del volumen accesible.

El modelo meanpos-iso supone un promedio dinámico en todas las posiciones posibles. Si bien los volúmenes creíbles de los modelos ISO son mucho menores que los calculados por los modelos no ISO, son inconsistentes con los datos medidos. Queríamos desarrollar una técnica que nos permitiera capturar información estructural dinámica de complejos transitorios, un problema que no podía ser abordado por las herramientas estructurales existentes.

Una vez que se han registrado los datos de FRET de una sola molécula, el análisis FastNPS se realiza en un par de horas, lo que permite una comparación rápida de diferentes modelos de tintes. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar posteriormente otros métodos, como las simulaciones de MD, con el fin de obtener modelos estructurados que sean consistentes con los datos experimentales de FRET de una sola molécula.