Name: La información estructural a partir de una sola molécula de FRET experimentos utilizando el Nano-posicionamiento Sistema Rápido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Aprende a obtener información estructural de biomoléculas mediante FRET de molécula única utilizando el Sistema Rápido de Nano-posicionamiento. Este método combina microscopía TIRF con análisis bayesiano para localizar dominios flexibles.

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Los autores agradecen a B. Gruchmann por los dibujos mecánicos de la cámara de flujo. Además, queremos expresar nuestro agradecimiento a Max Beckers y Florian Drechsler por sus perspicaces comentarios y discusiones sobre el NPS y el motor de muestreo subyacente.

<ol><li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Particle+Cryo-EM+at+Crystallographic+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Particle Cryo-EM at Crystallographic Resolution.</a> Cell. 161, 450-457 (2015).</li>
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<li>Hopfner, K. P., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+nucleic+acid+translocases%3A+lessons+from+structural+biology+and+single-molecule+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of nucleic acid translocases: lessons from structural biology and single-molecule biophysics.</a> Curr Opin Struct Biol. 17, 87-95 (2007).</li>
<li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+AFM+and+applications+to+biomolecular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">High-speed AFM and applications to biomolecular systems.</a> Annu Rev Biophys. 42, 393-414 (2013).</li>
<li>Neuman, K. K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5, 491-505 (2008).</li>
<li>Yildiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+walks+hand-over-hand%3A+single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).</li>
<li>Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Single-Molecule+Fluorescence+Methods+for+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology.</a> Annu Rev Biochem. 77 (1), 51-76 (2008).</li>
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<li>Stryer, L., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+transfer%3A+a+spectroscopic+ruler%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Energy transfer: a spectroscopic ruler.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).</li>
<li>Rasnik, I., Myong, S., Cheng, W., Lohman, T. M., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-binding+Orientation+and+Domain+Conformation+of+the+E.+coli+Rep+Helicase+Monomer+Bound+to+a+Partial+Duplex+Junction%3A+Single-molecule+Studies+of+Fluorescently+Labeled+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA-binding Orientation and Domain Conformation of the E. coli Rep Helicase Monomer Bound to a Partial Duplex Junction: Single-molecule Studies of Fluorescently Labeled Enzymes.</a> J Mol Biol. 336 (2), 395-408 (2004).</li>
<li>Andrecka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+tracking+of+mRNA+exiting+from+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule tracking of mRNA exiting from RNA polymerase II.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 135-140 (2008).</li>
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<li>Margittai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer+reveals+a+dynamic+equilibrium+between+closed+and+open+conformations+of+syntaxin+1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15516-15521 (2003).</li>
<li>Kalinin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+and+benchmark+study+for+FRET-restrained+high-precision+structural+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling.</a> Nat Methods. 9 (12), 1218-1227 (2012).</li>
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<li>Svensson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+trilateration+of+probes+bound+within+functional+ryanodine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">FRET-based trilateration of probes bound within functional ryanodine receptors.</a> Biophys J. 107 (9), 2037-2048 (2014).</li>
<li>Stephenson, J. D., Kenyon, J. C., Symmons, M. F., Lever, A. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+3D+RNA+structure+by+single+molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing 3D RNA structure by single molecule FRET.</a> Methods. (2016), 1-11 (2016).</li>
<li>Lee, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophys J. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li>
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<li>Schuler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+of+protein+structure+and+dynamics+-+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22J+nanoboitechnology%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET of protein structure and dynamics - a primer.</a> J nanoboitechnology. 11, Suppl 1. 1-17 (2013).</li>
<li>Choi, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET-derived+model+of+the+synaptotagmin+1-SNARE+fusion+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (3), 318-324 (2010).</li>
<li>Dale, R. E., Eisinger, J., Blumberg, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orientational+freedom+of+molecular+probes.+The+orientation+factor+in+intramolecular+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer.</a> Biophys J. 26 (2), 161-193 (1979).</li>
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<li>Bennink, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unfolding+individual+nucleosomes+by+stretching+single+chromatin+fibers+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers.</a> Nat Struct Biol. 8 (7), 606-610 (2001).</li>
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<li>Würth, C., Grabolle, M., Pauli, J., Spieles, M., Resch-Genger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+and+absolute+determination+of+fluorescence+quantum+yields+of+transparent+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Relative and absolute determination of fluorescence quantum yields of transparent samples.</a> Nat Protoc. 8 (8), 1535-1550 (2013).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , Springer US. Boston, MA. (2006).</li>
<li>Korkhin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+complex+RNA+polymerases%3A+The+complete+archaeal+RNA+polymerase+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of complex RNA polymerases: The complete archaeal RNA polymerase structure.</a> PLoS Biol. 7 (5), (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Presentamos la configuración y experimental procedimiento para determinar con precisión la eficiencia de FRET entre los colorantes unidos a través de enlazadores flexibles a biomacromoléculas, es decir, ácidos nucleicos y / o proteínas. Con el fin de asegurar mediciones precisas smFRET (Sección 3), es crucial para excluir el aire de la cámara de flujo en cualquier momento durante la medición. Además, asegúrese de no sobrecargar la cámara de flujo con fluoróforos. Los fluoróforos deben estar claramente separados para asegurar el correcto análisis. Como pares smFRET, que no muestran la decoloración del donante tienen que ser excluidos del análisis, asegúrese de que&gt; 80% de las moléculas en el campo de visión se blanquean al final de la película. Para dar cuenta de la falta de homogeneidad en la muestra de la β-factor y el γ-factor de, la corrección de los cross-talk y relativos eficiencias de detección del canal de donante y aceptor, respectivamente, se calculan para cada FRET emparejar individualmente. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Los ajustes de la cámara (tiempo de integración, la ganancia del multiplicador de electrones, la ganancia del preamplificador y de tipo de lectura se describe en la Sección 3.9) debe ajustarse a los valores que dan el mejor compromiso entre la relación señal a ruido, rango dinámico y el tiempo de resolución. Necesitan ser re-ajustado para diferentes experimentos o si se utiliza un hardware diferente. El número de marcos deben ser lo suficientemente alta para asegurar que la mayor parte del donante moléculas lejía dentro del tiempo de observación. Para las mediciones en el espectrómetro de fluorescencia (Secciones 7 a 9) un buen compromiso entre la intensidad de la señal y la resolución espectral de los datos registrados tiene que ser encontrado. Para este fin, las ranuras en la excitación y emisión vía del espectrómetro de fluorescencia tienen que ser adaptados depende del instrumento utilizado y de la concentración de la muestra. Por otra parte, se presenta el método de análisis rápido de NPS para obtener información estructural de macrom transitoria o dinámicoMOLECULAR complejos. NPS se ha aplicado para revelar el camino de la cadena de ADN no plantilla y la posición de los factores de iniciación de la transcripción en el complejo abierto ARN polimerasa archaeal. El uso de la red de más de 60 diferentes medidas de distancia, puso de manifiesto que Fast-NPS, equipado con un motor de muestreo de reciente aplicación (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., y Michaelis, J. en preparación), reduce el tiempo necesario para el análisis de esta red smFRET complejo por ≈2 órdenes de magnitud, en comparación con el método de NPS mundial original de 27. La robustez del algoritmo se basa en un muestreador de Metropolis-dentro-Gibbs combinado con un esquema de templado paralelo. Fast-NPS muestra exacta reproducibilidad de los resultados de la red y es consistente con los resultados publicados anteriormente 30. Existen varios métodos diferentes han sido publicados con el objetivo de inferir información estructural a partir de mediciones smFRET 11 </sarriba&gt;, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. Todos estos enfoques proporcionan sólo un modelo de tinte específico. Por lo tanto, colorantes, que no cumplen con las suposiciones hechas por el modelo respectivo, no se pueden utilizar o conducen a la información estructural falsa. Fast-NPS, por el contrario, permite seleccionar para cada molécula de colorante de un modelo diferente. Esto ayuda a explicar diferente comportamiento conformacional de ambos, la propia molécula de colorante, así como el enlazador utilizado para su fijación. El entorno molecular locales de la molécula de colorante, así como sus propiedades físicas se determinan qué modelo es el más adecuado. Para la red smFRET analizado del complejo de iniciación archaeal, un supuesto isotrópica para todas las moléculas de colorante conduce a una disminución drástica in el tamaño de los volúmenes creíbles en comparación con el modelo clásico. En combinación con una posición dinámica promedio para todos tinte moléculas de la mediana de todos los tamaños de volúmenes creíbles (al 95%) se reduce a menos de 0,5 nm 3. Sin embargo, estos dientes posteriores molécula de colorante ya no responden con sus mediciones smFRET, lo que indica que los supuestos hechos de plomo a la información estructural falsa. En contraste, los posteriores determinados en el modelo clásico son consistentes con las eficiencias smFRET determinados. A medida que la asunción de la posición isotrópico y / o dinámico con un promedio de todos los tintes presentar inconsistencias, Fast-NPS permite priores molécula de colorante en el que cada colorante se le puede asignar uno de los cinco modelos. Cada modelo utiliza el mismo volumen accesible. El algoritmo para el cálculo de las AV tinte hace varias suposiciones. Al principio, la forma espacial del fluoróforo se aproxima por una esfera. Por lo tanto, un diámetro teniendo en cuenta wid del fluoróforoTH, altura y grosor se deben utilizar (Sección 12). Además, la forma del enlazador se aproxima por una varilla flexible. Los valores presentados en la Sección 12 se calcularon para el colorante Alexa 647 unido a través de un enlazador 12-C. Hasta la fecha, no es posible determinar con precisión a priori qué modelo es el más adecuado, teniendo en cuenta una geometría experimental, y por lo tanto todos los modelos debe ser probado. En general, se elige el modelo que da el tamaño posterior más pequeña posible, sin dejar de ser consistente con los datos. Para probar si una selección de modelos es consistente con los datos smFRET, calculamos tanto la posterior y la probabilidad. La consistencia significa que más del 90% de las muestras recogidas de la posterior están dentro del intervalo de confianza del 95% de la probabilidad. Si bien es cierto que cuanto más baja la anisotropía, menor será la incertidumbre distancia, en una red smFRET disposiciones geométricas de las moléculas de colorante también tienen que ser tomadas en cuenta. Así, mientras que rREPRESENTAN moléculas de colorante con una anisotropía baja fluorescencia con un modelo ISO es una primera opción típica, la prueba de consistencia proporciona un medio más directo para seleccionar el modelo de tinte correcto. La elección óptima de los modelos de colorante puede conducir a un aumento drástico en la precisión de localización y al mismo tiempo conservar la coherencia de la red con sus datos de FRET. Para resumir, Fast-NPS permite obtener información estructural y dinámica de grandes complejos macromoleculares. En contraste con los métodos estructurales comunes tales como cristalografía de rayos x o microscopía electrónica de crio esto permite el seguimiento de los complejos altamente flexibles o transitorios, ampliando así en gran medida nuestra comprensión mecanicista de los procesos biológicos complejos.

La determinación de la estructura de una biomolécula es un requisito clave para la comprensión de su función. Dos métodos bien establecidos para la determinación de la estructura son crio-microscopía electrónica y cristalografía de rayos X 1, 2. Hoy en día, ambos métodos proporcionan información estructural de alta resolución con una resolución hasta el nivel de angstrom. Estos dos métodos se han utilizado ampliamente para elucidar la estructura de las grandes biomoléculas tales como los complejos de proteínas. Aunque los métodos existentes constantemente se han mejorado a lo largo de las últimas décadas, la complejidad de las estructuras biológicas sigue planteando un desafío importante para la biología estructural, en particular cuando grandes complejos, dinámicos y transitorios son investigados 3. Con el fin de estudiar la dinámica de complejos macromoleculares y la relación estructura-función en particular, las metodologías de una sola molécula tienen provided información útil 4. Se desarrollaron varias nuevas estrategias para afrontar de manera ortogonal en la adquisición de información estructural y dinámica. Ejemplos son altos AFM velocidad 5, 6 manipulación mecánica, fluorescencia localización microscopía 7, así como de una sola molécula de transferencia de energía de resonancia de Förster (smFRET) 8, 9. Desde muy temprano en FRET que se ha denominado una regla molecular, debido a la dependencia de la distancia en la escala de longitud de biomacromoléculas 10. Una aplicación particularmente interesante de smFRET es utilizar la información de distancia obtenida a partir de mediciones smFRET para inferir información estructural 11, 12, 13, 14, 15 &gt;, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. Debido a la alta resolución temporal de smFRET, la posición de las partes móviles de una estructura de proteína puede ser localizada. Sin embargo, con el fin de extraer información cuantitativa a partir de datos smFRET importantes parámetros de corrección sobre las moléculas de colorante que determinarse durante la medición 24. Con estos factores de corrección, la eficiencia de FRET FRET E se puede calcular utilizando la fórmula <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq1.jpg"> , en la que A y D I Figura 2). El β-factor de cuenta de la diafonía, la fuga de emisión del donante en el canal aceptor y se calcula <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq2.jpg"> donde I 'A e I' d son las intensidades de fluorescencia del donador y la molécula aceptora después de la foto de blanqueo de la molécula aceptora. El γ-factor de corrige la diferencia en las eficiencias de detección relativos en los dos canales, así como las diferencias en el rendimiento cuántico de fluorescencia del donante y el colorante aceptor. Se calcula a partir de cada curva del tiempo individual Nota, que esta descripción descuida excitación directa de la molécula aceptora, que a veces se vuelve importante y tendría que ser corregida para así. Para la determinación de estos factores de corrección es útil para excitar tanto para el donante, así como el aceptor en un esquema de alternancia 25 con el fin de diferenciar entre los cambios de foto-física y dinámica estructural. Con el fin de no sólo lograr eficiencias smFRET cuantitativos, sino también información estructural cuantitativa, se introdujo el Sistema de Posicionamiento Nano-(NPS) en 2008 26. El nombre fue elegido en base a sus similitudes con el sistema de posicionamiento global por satélite (GPS). El NPS es una técnica híbrida que combina smFRET y datos de cristalografía de rayos X para la localización de las posiciones de tinte desconocidos en los complejos biomacromoleculares. La Cestructura rystal sirve como un marco de referencia y los resultados smFRET se utilizan para obtener información de la distancia entre una posición desconocida fluoróforo (antena) y una posición conocida de la estructura cristalina (satélite). En experimentos consecutivos de las distancias entre la antena y varios satélites se miden y la posición de la antena se determina por medio de un esquema de análisis estadísticamente rigurosa basada en la estimación de parámetros Bayesiano. Como resultado, no sólo la posición más probable de la antena se calcula, pero su distribución de la incertidumbre en 3D completa, la llamada posterior, visualizado por volúmenes creíbles. Por otra parte, fuentes de energía nuclear fue ampliado para permitir el análisis de redes completas smFRET 27. El NPS se ha utilizado para resolver una serie de cuestiones importantes de la transcripción eucariótica, es decir, el curso de la DNA aguas arriba, el ADN no molde y el ARNm naciente dentro de la elongación co RNA polimerasa IImplex 12, 28, demuestra también el efecto de los factores de transcripción iniciación 26 y la arquitectura dinámica de un promotor-abierta compleja 29. Además, el NPS se utilizó para elucidar la estructura de la archaeal complejo abierto ARN polimerasa 30 y, en particular, la posición del factor de iniciación de la transcripción TFE, que se une competitivamente al mismo sitio como el factor de elongación de la transcripción SPT4 / 5 31. Desde entonces, una serie de enfoques estructurales basados smFRET se han publicado 15, 18, 21, 23. Al comparar los diferentes métodos estructurales basados ​​smFRET, se hace evidente que la aparente precisión del método depende de la elección particular de los modelos de colorantes altamente. Hay que señalar quemoléculas de colorante pueden mostrar un comportamiento espacial y de orientación diferente en función de su entorno local. Con este fin, Fast-NPS se introdujo 32. Fast-NPS usa un algoritmo de muestreo avanzado reducir los tiempos de cálculo drásticamente. Por otra parte, Fast-NPS permite a uno realizar un análisis estructural y para cada molécula de colorante que el usuario puede elegir entre una serie de cinco modelos distintos de colorantes que se describirá a continuación. El modelo más conservador, denominado clásico, asume que el colorante ocupa sólo una, pero desconocida, posición. En esta posición, el fluoróforo puede girar libremente dentro de un cono, cuyo tamaño está determinado a partir de su respectivo anisotropía de fluorescencia (dependiente del tiempo). La orientación del cono no es conocida, lo que conduce a grandes incertidumbres al convertir eficiencias smFRET medidos en distancias. A este respecto, el modelo es conservadora, ya que conducirá a la precisión más pequeño en comparación con el otro modo de colorantels. Sólo para distancias muy cortas caso de que las suposiciones hechas por el modelo clásico de plomo a una determinación de la posición notoriamente incorrecto. Para valores típicos smFRET, la posición correcta se entrega siempre en el volumen comparativamente grande creíble. Sin embargo, desde una precisión más alta es deseable, es importante desarrollar y probar modelos alternativos de colorantes, que podrían ayudar a mejorar la precisión. Si el colorante gira mucho más rápido que su tiempo de vida de fluorescencia inherente, el llamado modelo ISO se puede aplicar. Aquí, el factor de orientación kappa 2 (necesaria para el cálculo del radio de Förster característica isotrópica <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq4.jpg"> ) Está ajustado a 2/3. Como resultado, los volúmenes creíbles calculadas son casi dos órdenes de magnitud más pequeña en comparación con aquellos en el modelo clásico de 32. En el caso de que el fluoróforo se encuentra en un entorno que permita no sólo reori rápidoentación, pero, además, el movimiento rápidamente en todo su volumen accesible, el modelo meanpos-iso debe ser utilizado. En este modelo, el tinte ocupa efectivamente sólo una posición media, en el que el promedio espacial se explica por una conversión distancia polinomio 15. Este modelo se aplica si, por ejemplo el colorante (comúnmente hidrófobo) se une a una región hidrófila, por ejemplo, el ADN. La aplicación del modelo meanpos-iso conduce a una reducción adicional en el tamaño de los volúmenes creíbles por un factor de aproximadamente dos. Sin embargo, un colorante unido a una proteína puede unirse de forma reversible a varios parches hidrófobos en su volumen estéricamente accesible (AV). Un fluoróforo que conmuta instantáneamente entre estas regiones, pero dentro de una región sufre una rotación libre y el movimiento localizada rápido es mejor descrita por el modelo VAR-meanpos-iso. Para una situación similar en la que el colorante no es libre de girar las var-meanpos aplica modelo. más d etails acerca de estos modelos se pueden encontrar en nuestra reciente publicación 32. Estos modelos ofrecen un amplio repertorio para dar cuenta específicamente para los diferentes ambientes un tinte podría encontrar y aplicar de manera inteligente optimiza la precisión de localización. En Fast-NPS cada molécula de colorante unido a una posición específica se puede asignar a un modelo individual, de tal manera que FRET-socios se les permite tener diferentes modelos. Esto permite el modelado ilimitadas y cerca de la naturaleza. Sin embargo, es importante que uno realiza pruebas estadísticas rigurosas para asegurar que el resultado obtenido por la combinación final modelo es todavía de acuerdo con los datos experimentales. Estas pruebas están incluidas en el software Fast-NPS. Para la aplicación de Fast-NPS a los datos experimentales se requiere la medición de (sólo) tres parámetros de entrada. En primer lugar, el tinte-par específico Förster isotrópica radios (/54782/54782eq5.jpg "/&gt;) Se han determinado. Por lo tanto, el rendimiento cuántico (QY) del colorante donante, los espectros de emisión de fluorescencia del donante y el espectro de absorción del aceptor deben ser medidos. Estas mediciones pueden llevarse a cabo en granel, usando un espectrómetro estándar y un espectrómetro de fluorescencia estándar. Para cada par, la R 0 se calcula entonces utilizando la PhotochemCAD freeware y se puede utilizar en el análisis de NPS. Por otra parte, los (resuelta en el tiempo) anisotropías de fluorescencia de las moléculas de colorante necesitan ser obtenido usando una polarización (y tiempo) espectrómetro de fluorescencia sensible. Sin embargo, los parámetros de entrada más importantes para Fast-NPS son las eficiencias smFRET medidos en una configuración de microscopía de fluorescencia de una sola molécula, tales como un microscopio de fluorescencia de reflexión total interna (TIRFM) . A continuación, presentamos un protocolo paso a paso para la obtención de datos y la aplicación de smFRET Fast-NPS (Figura 1).

<table><tbody><tr><td colspan="4">Preparación de la cámara de flujo</fuerte></td></tr><tr><td>Portamuestras metálico personalizado</td><td>autoconstruido</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de vidrio de cuarzo, 76&nbsp; mm x 26 y nbsp; mm</td><td>Technical Glass Products</td><td>26007</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos, 60 mm x 24&nbsp; mm</td><td>Detergente 101242</td><td></td><td></td>Marienfeld</tr><tr><td>, Hellmanex II</td><td>Hellma</td><td>320.001</td><td></td></tr><tr><td>agua ultrapura de Synergy UV</td><td>Millipore</td><td>2512600</td><td></td></tr><tr><td>Zepto limpiador de plasma</td><td>Diener</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>(3-aminopropil)-trietoxisilano, p.a.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>metoxi valerato de PEG-succinimidilo, 5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>MPEG-SVA-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>valerato de PEG-succinimidilo biotinilado, 5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>BIOTINA-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Biocarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761 Sigma&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127 Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>película de sellado (Nescofilm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12981805</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tubo de silicona flexible, 0.8&nbsp; mm ID, 2.4&nbsp; mm de diámetro exterior</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics</td><td>720958</td><td></td></tr><tr><td>tubo de polietileno de diámetro fino, 0,58 mm de diámetro interior, 0,96 mm de diámetro exterior (Smiths Medical)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12665497</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Life Technologies</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microscopio de fluorescencia de reflexión interna total</td></tr><tr><td>Nd:YAG Laser, 532 nm</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td>EXLSR-532-100-CDRH</td><td></td></tr><tr><td>Láser de estado sólido bombeado por diodo, 491 nm, Láser de diodo Calypso</td><td>Cobolt</td><td>904010050</td><td></td></tr><tr><td>643 nm, Espejo</td> dicroico iBeam <td>smart Toptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td><td></td></tr><tr>, Espejo<td>dicroico 532 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-540</td><td></td></tr><tr><td>, 476 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-476z</td><td></td></tr><tr><td>Filtro sintonizable acústico-óptico</td><td>AA Lente cilíndrica</td> plano-convexa <td>AOTFnC-VIS</td><td></td>optoelectrónica</tr><tr><td>, f = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1703L1-A</td><td></td></tr><tr><td>cilíndrica plano-cóncava, f = -300&nbsp; mm</td><td>Prisma Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, PS 991</td><td>Lente de enfoque Thorlabs</td><td>PS991</td><td></td></tr><tr><td>, f = 75&nbsp; mm</td><td>Bomba de</td> jeringa <td>Thorlabs LA1608-B</td><td></td></tr><tr><td>, PHD 2000</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2002</td><td></td></tr><tr><td>2 motores paso a paso, Z812B</td><td>Thorlabs</td><td>Z812B</td><td></td></tr><tr><td>actuador piezoeléctrico, PE4</td><td>Thorlabs</td><td>PE4</td><td></td></tr><tr><td>Láser de diodo IR</td><td>Edmund Optics</td><td>CPS808</td><td>parte del sistema de enfoque automático</td></tr><tr><td>espejo dicroico, 775 DCXR</td><td>Chroma</td><td>775 DCXR</td><td></td></tr><tr><td>detector de detección de posición (PSD), PDP90A</td><td>Thorlabs</td><td>PDP90A</td><td>parte del sistema de enfoque automático</td></tr><tr><td>objetivo de inmersión en agua, Plan Apo 60X WI, NA 1.2</td><td>Nikon</td><td></td><td>MRD07601</td></tr><tr><td>espejo dicroico, 645 DCXR</td><td>Chroma</td><td>645 DCXR</td><td>parte de la ruta de emisión</td></tr><tr><td>filtro de emisión, 3RD550-510</td><td>Omega Optical</td><td>3RD550-510</td><td>canal verde en la ruta de emisión</td></tr><tr><td>filtro de emisión, 3RD660-760</td><td>Omega Optical</td><td>3RD660-760</td><td>canal rojo en la vía de emisión</td></tr><tr><td>Cámara EMCCD, iXon+ DU897EBV</td><td>Andor</td><td>AND-20-00032</td><td></td></tr><tr><td>Cámara EMCCD, iXon3 DU897D-BV</td><td>Andor</td><td>AND-20-000141</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Miscelánea</td></tr><tr><td>Varian 50</td><td>Cary</td><td></td><td>Espectrómetro UV-VIS</td></tr><tr><td>Espectrómetro de fluorescencia</td><td>Fluorolog2</td><td>SPEX</td><td></td></tr><tr><td>Solis (V4.15)</td><td>Andor</td><td></td><td>software de control para la cámara EM-CCD</td></tr><tr><td>Utilidad de usuario apta&nbsp; (V1.022)</td>Software <td>de control Thorlabs</td><td></td><td>para los motores piezoeléctricos</td></tr><tr><td>Norland Adhesivo óptico 68</td><td>Adhesivo Thorlabs</td><td></td>PC-AFN-0.8 Rojo Nilo Kisker Biotech perlas fluorescentes <td></td></tr><tr><td></td><td>multispec recubiertas de avidina&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr>Lenguaje de computación técnica <td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>para software escrito custon</td></tr><tr><td>Origin (V9.0)</td><td>Originlab</td><td></td><td>software de análisis de datos y gráficos científicos</td></tr><tr><td>Hellma 105-202-15-40</td><td>Hellma</td><td>105-202-15-40</td><td>cubeta de absorción de 1&nbsp; longitud de paso</td></tr><tr><td>en cm Hellma 105-251-15-40</td><td>Cubeta</td> de fluorescencia Hellma <td>105-251-15-40</td><td>con longitud de paso de 3 mm</td></tr></tbody></table>

la información estructural a partir de una sola molécula de fret experimentos utilizando el nano-posicionamiento sistema rápido

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

La transferencia de energía de resonancia de Förster de una sola molécula (smFRET) se puede utilizar para obtener información estructural sobre complejos biomoleculares en tiempo real. De este modo, se utilizan múltiples mediciones de smFRET para localizar una posición desconocida del colorante dentro de un complejo proteico mediante trilateración. Con el fin de obtener información cuantitativa, el Sistema de Nano-Posicionamiento (NPS) utiliza el análisis de datos probabilísticos para combinar la información estructural de la cristalografía de rayos X con los datos de fluorescencia de una sola molécula para calcular no solo la posición más probable, sino la distribución de probabilidad tridimensional completa, denominada posterior, que indica la incertidumbre experimental. El concepto se generalizó para el análisis de redes smFRET que contienen numerosas moléculas de colorante. La última versión de NPS, Fast-NPS, presenta un nuevo algoritmo que utiliza la estimación de parámetros bayesianos basada en el muestreo de Monte Carlo de la cadena de Markov y el templado paralelo que permite el análisis de grandes redes smFRET en un tiempo comparativamente corto. Además, Fast-NPS permite el cálculo de la posterior eligiendo uno de los cinco modelos diferentes para cada colorante, que dan cuenta del diferente comportamiento espacial y orientacional que exhiben las moléculas de colorante debido a su entorno local.
Aquí presentamos un protocolo detallado para obtener datos smFRET y aplicar el Fast-NPS. Proporcionamos instrucciones detalladas para la adquisición de los tres parámetros de entrada de Fast-NPS: los valores de smFRET, así como el rendimiento cuántico y la anisotropía de las moléculas de colorante. Recientemente, el NPS se ha utilizado para dilucidar la arquitectura de un complejo promotor abierto de arqueas. Estos datos se utilizan para demostrar la influencia de los cinco modelos diferentes de colorantes en la distribución posterior.

La transcripción es el primer paso en la expresión génica en todos los organismos. En Archaea, la transcripción se lleva a cabo por un solo RNA polimerasa (RNAP). En comparación con los eucariotas, la RNAP arqueas tiene un parecido estructural sorprendente con sus homólogos eucariotas mientras que con un simple maquinaria transcripcional. Por lo tanto, Archaea se puede utilizar como un sistema modelo para estudiar la iniciación de la transcripción eucariótica por la ARN polimerasa II (Pol II). Recientemente, la arquitectura completa del complejo abierta arqueas ARN polimerasa se ha determinado a partir de una sola molécula FRET y NPS. Los datos del análisis de fuentes de energía nuclear se utilizó para construir un modelo del complejo promotor completa arqueas abierta, que proporciona información útil sobre el mecanismo de iniciación de la transcripción. Para dilucidar esta estructura, se midieron las eficiencias smFRET entre moléculas de colorante de antena desconocidos ubicados dentro de la com promotor abiertocompleja y varias moléculas de colorante de satélites conocidos que fueron incorporados en cinco sitios de referencia en el RNAP, cuyas posiciones son conocidas a partir de estructuras cristalográficas (AP-ID: 2WAQ) 37. Los colorantes de antena se adjunta a una cualquiera de las diferentes posiciones en el ADN no plantilla, TFB, TBP o TFE. La red completa que se utiliza en este estudio consistía en más de 60 distancias medidas. La figura 7 muestra el modelo del complejo promotor abierto archaeal completa construido a partir del análisis de NPS. Está formado por el promotor de doble hebra de ADN (azul claro y oscuro), la ARN polimerasa (gris) y el inicio de la transcripción factores de TBP (púrpura), TFB (verde) y TFE (amarillo). El modelo se superpone con los resultados del análisis de fuentes de energía nuclear, los volúmenes creíbles, que se calcula utilizando el modelo clásico (A), el modelo ISO (B), el modelo meanpos-iso (C), el modelo VAR-meanpos-iso (D) y las var-meanpos modelo (E). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig1.jpg"> Figura 1: Flujo de trabajo de la adquisición y el procesamiento de los parámetros necesarios para el cálculo rápido de fuentes de energía nuclear. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig2.jpg"> Figura 2: Ejemplar intensidad de fluorescencia tiempo rastro de un evento smFRET. Las intensidades de fluorescencia del donante (verde) y la molécula aceptora (rojo) que muestra las tres fases características, a saber, I: smFRET, II: fluorescencia del donante después de photobleaching aceptor, III: fluorescencia de fondo después de photobleaching donante.g2large.jpg "target =" _ blank "&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig3.jpg"> Figura 3: Ilustración esquemática de la cámara de flujo para los experimentos smFRET. La cámara de flujo se monta sobre un soporte de metal personalizado con los titulares de vidrio acrílico. El sándwich de diseño de la cámara de flujo comprende un cristal de cuarzo (sílice fundida) deslice con dos agujeros para la fijación de tubos de entrada y salida, una película de sellado y un cubreobjetos que cierra la cámara de flujo. El prisma de iluminación TIRF se monta sobre la mitad inferior de la cámara de flujo. tornillos pestaña huecas proporcionan la entrada y salidas de la cámara de flujo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img> alt = "Figura 4" src = "/ files / ftp_upload / 54782 / 54782fig4.jpg" /&gt; Figura 4: Preparación del portaobjetos de vidrio de cuarzo y la película de sellado. dibujo mecánico de la lámina de vidrio de cuarzo que indica las posiciones de los agujeros (en milímetros). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig5.jpg"> Figura 5: Dibujo mecánico de la cámara de flujo. Las medidas para el soporte del prisma de aluminio, acrílicos titulares de vidrio y marco de montaje de aluminio se dan en milímetros. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> igura 6 "src =" / files / ftp_upload / 54782 / 54782fig6.jpg "/&gt; Figura 6: Representación esquemática de la configuración de TIRF de tipo prisma utilizado para los experimentos smFRET. Las abreviaturas de los componentes ópticos: A, de apertura; DM, espejo dicroico; F, filtro de emisión; L, la lente; M, espejo; O, objetiva; P, prisma; PSD, sensible a la posición de fotodiodos; S, muestra; PS, la etapa de posicionamiento; T, telescopio. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig7.jpg"> Figura 7: Resultados de la simulación de los diferentes supuestos del modelo. Todas las imágenes muestran el ARN archaeal polimerasa (AP-ID: 2WAQ, vista desde arriba) junto con el modelo de la promotora de ADN (tDNA y ntDNA en azul y cian, respectivamente), PDD (púrpura), TFB (verde) y TFE (amarillo)en el arqueas abrir compleja 30. Los volúmenes creíbles se superponen a los resultados de la simulación NPS de (A) el modelo clásico, (B) el modelo ISO, (C) el modelo meanpos-iso, (D) el modelo VAR-meanpos-iso y (E) de la var -meanpos modelo. Todos los volúmenes se muestran en el 68% de credibilidad. El las redes var-meanpos clásico y son consistentes con los datos smFRET. Por el contrario, las redes donde por todos los tintes se elige el iso, iso-meanpos o el modelo VAR-meanpos-iso son incompatibles con los datos medidos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Presentamos la configuración y el procedimiento experimental para obtener datos smFRET de grandes redes de donantes-aceptores con un microscopio TIRF. El análisis paso a paso de estas mediciones con el software de inferencia bayesiana Fast-NPS proporciona información estructural de alta resolución mediante la aplicación de modelos de colorantes adaptados.

La información estructural a partir de una sola molécula de FRET experimentos utilizando el Nano-posicionamiento Sistema Rápido

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

El objetivo general del sistema de nanoposicionamiento rápido es proporcionar información estructural en tiempo real de las biomoléculas mediante la combinación de experimentos FRET de una sola molécula con un análisis estadístico riguroso. Este método responde a preguntas clave en el campo de la biología estructural, como la localización de dominios flexibles en macromoléculas donde no se pueden aplicar las herramientas estándar de la biología estructural. La principal mejora de NPS rápido en comparación con otras herramientas estructurales basadas en FRET es que se pueden comparar diferentes modelos de tinte utilizando no solo las posiciones más probables, sino también una distribución de probabilidad tridimensional.La principal ventaja de esta técnica es que combina datos estructurales de la base de datos de proteínas con mediciones cuantitativas de fluorescencia de una sola molécula. Para comenzar el procedimiento, ensamble una cámara de flujo y un portamuestras. Para preparar los tornillos de entrada y salida, enrosque el tubo de silicona en tornillos de lengüeta hueca y corte el tubo en línea recta en cada extremo con una cuchilla de afeitar.Atornille los tornillos de lengüeta al portamuestras. Alinee los orificios deslizantes de cuarzo de la cámara de flujo con las roscas del portamuestras. Apriete suavemente los tornillos del soporte de vidrio para fijar la cámara de flujo en su lugar.Enrosque trozos de tubo de silicona de 20 centímetros de largo en los tornillos de entrada y salida. Lave la cámara de flujo con 500 microlitros de PBS. A continuación, enjuague la cámara de flujo con 100 microlitros de solución de neutravidina en PBS, asegurándose de que se forme una gota en el extremo del tubo de entrada para evitar que el aire entre en la cámara de muestras.Cierre los tubos de entrada y salida después de cada manipulación para excluir el aire de la cámara de flujo. Incubar la cámara durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego, lave la solución de neutravidina con 500 microlitros de PBS.Agregue una gota de aceite de inmersión en el prisma y enrosque el prisma en la cámara de muestras. Los datos de FRET de una sola molécula se adquieren utilizando un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total. Inicie el software de la cámara y el software del piezomotor del escenario.Monte la cámara en la platina del micrómetro del microscopio TIRF horizontalmente, lo más recta posible, y de tal manera que se cruce con los tres láseres. Agregue líquido de inmersión y enfoque el objetivo del microscopio verificando las reflexiones IR. Establezca los parámetros de la cámara, la ruta del archivo y los parámetros de incremento automático.Inicie la transmisión de la cámara en vivo y blanquee la fluorescencia de fondo usando los tres láseres con intensidades completas. A continuación, baje las intensidades del láser. Luego, cargue 100 microlitros de una solución de perlas fluorescentes en la cámara.Espere 10 minutos para que las cuentas se adhieran a la superficie de la cámara. Grabe una película con un campo de visión de 50 a 100 cuentas y realice un análisis de lote con un umbral de búsqueda de picos alto. Cargue el archivo de película y elija dos cuentas con centros distintos en esquinas opuestas del campo de visión.Selecciona los píxeles de máxima intensidad en esas cuentas. Retire y limpie el prisma. Prepare una segunda cámara de muestra y atornille el soporte del prisma a la cámara.Monte la cámara en la etapa del micrómetro. A continuación, cargue 100 microlitros de una solución de 50 a 100 picomolares de muestra biotinilada marcada con fluorescencia en la cámara. Espere a que las moléculas se unan a la superficie de la cámara.Al mismo tiempo, haga clic en Tomar señal para iniciar la grabación y encender el láser de excitación del donante. Ajuste la potencia del láser para asegurarse de que al menos el 80% de las moléculas en el campo de visión estén blanqueadas, luego, mueva la cámara para mostrar un área sin blanquear y grabe la próxima película. Blanquea el resto de la cámara de muestras de esta manera.Después de las mediciones en el microscopio TIRF, los datos adquiridos de FRET de una sola molécula deben analizarse para obtener la eficiencia media de FRET. Realice un análisis por lotes de las películas de donante y aceptor de la muestra. A continuación, cargue los archivos de película por lotes en el software de análisis de datos.Haga clic en el botón NO seleccionado para indicar las fases FRET individuales. Haga clic en el comienzo del período FRET, luego en el punto de tiempo en el que la intensidad del aceptor disminuye debido al blanqueo y, finalmente, en el punto de tiempo en el que la intensidad del donante disminuye debido al blanqueo. En la siguiente ventana, seleccione Sí para mantener el seguimiento de la eficiencia de FRET seleccionado.Una vez que se haya analizado cada molécula, guarde las trazas y analice la próxima película. Una vez completado el análisis, ejecute un script para combinar los resultados de FRET. Importe el archivo FRET combinado de fotogramas en el software de análisis de datos utilizando la opción de entrada predeterminada.Represente los datos como un histograma y utilice la herramienta de ajuste de curva no lineal para ajustarlos a un gaussiano. El valor de excedido es la principal eficiencia de FRET. Utilice UV, VIS y espectroscopia fluorescente para determinar el radio de Forster isotrópico y los valores de anisotropía en estado estacionario para cada colorante.El sistema de nanoposicionamiento se inspiró en el conocido GPS, ya que localizamos una posición desconocida, la antena, con varias posiciones conocidas, los satélites. Para comenzar el análisis de NPS, inicie el software FastNPS y cree un nuevo archivo de trabajo. Para definir las prioridades de posición de las antenas y satélites etiquetados, en la ventana ModelDyePrior, introduzca la resolución espacial de la posición que se está definiendo.Excluya el interior de la macromolécula cargando el archivo PDB centrado correspondiente. Introduzca el diámetro del tinte y la distancia de esqueletización. Rellene las coordenadas de posición mínima y máxima de la posible ubicación del tinte.Si la posición que se está definiendo es un satélite, seleccione la fijación de tinte a través de un enlazador flexible e introduzca las coordenadas del átomo desde el archivo PDB centrado. Rellene la longitud y el diámetro del enlazador. Haga clic en calcular volumen accesible, guarde la posición anterior y expórtela para su visualización.Repita este proceso para todos los satélites y antenas. Una vez que se hayan definido las posiciones, abra la ventana Definir medición y cree una nueva molécula de tinte. Cargue la posición anterior asociada con ese tinte.Rellene la anisotropía de fluorescencia, seleccione un modelo de tinte adecuado y active el tinte. Repite este proceso hasta que se hayan definido todos los tintes. A continuación, cree una nueva medida.Seleccione un par FRET de los tintes definidos. Introduzca la eficiencia FRET de una sola molécula con error y el radio de Forster isotrópico de este par de colorantes, y active la medición. Repite esto para todos los pares de tintes.A continuación, abra la ventana de cálculo. Si los tintes se han asignado a diferentes modelos, seleccione Definido por el usuario. De lo contrario, seleccione el modelo que desea usar para todos los tintes.Realice el cálculo y abra la ventana de resultados. Al utilizar FastNPS, es importante recordar que hay que adaptar los modelos a todos los tintes para minimizar los volúmenes creíbles y, por supuesto, mantener la coherencia. Si la consistencia es inferior al 90 %, haga clic en Consistencia detallada e identifique los tintes comunes a las entradas con menos del 90 % de consistencia.Abra la ventana Definir medición y cambie el modelo del tinte en cuestión. Vuelva a ejecutar el cálculo en el modo Definido por el usuario. Exporte los volúmenes creíbles de los tintes individualmente o como un lote.Abra los archivos de densidad en el software de visualización y ajuste la credibilidad al nivel deseado. Se midieron las eficiencias de FRET de una sola molécula entre moléculas de antena desconocidas y varias moléculas satélite conocidas dentro de un complejo promotor abierto de ARN polimerasa de arqueasa. El análisis NPS de estos datos determinó los volúmenes creíbles de estas moléculas de colorante en relación con el complejo promotor abierto de ARN polimerasa de arqueasa.Se utilizaron cinco modelos diferentes en los que se utilizaron las moléculas de colorante y se compararon los resultados. Los volúmenes creíbles fueron consistentes con los datos medidos cuando se calcularon con modelos que asumían que el tinte solo puede rotar libremente dentro de un cono de orientación desconocida. El modelo clásico en particular es el más conservador, ya que supone además que el tinte está en un lugar fijo.Esto crea un volumen creíble relativamente grande, pero el volumen generalmente encierra la posición correcta. Los modelos de mayor precisión utilizan la suposición de que el tinte es completamente libre de rotar dentro de su vida útil de fluorescencia. El modelo iso, al igual que el modelo clásico, asume que el tinte está en una posición fija dentro del volumen accesible.El modelo meanpos-iso supone un promedio dinámico en todas las posiciones posibles. Si bien los volúmenes creíbles de los modelos ISO son mucho menores que los calculados por los modelos no ISO, son inconsistentes con los datos medidos. Queríamos desarrollar una técnica que nos permitiera capturar información estructural dinámica de complejos transitorios, un problema que no podía ser abordado por las herramientas estructurales existentes.Una vez que se han registrado los datos de FRET de una sola molécula, el análisis FastNPS se realiza en un par de horas, lo que permite una comparación rápida de diferentes modelos de tintes. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar posteriormente otros métodos, como las simulaciones de MD, con el fin de obtener modelos estructurados que sean consistentes con los datos experimentales de FRET de una sola molécula.

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Investigando individual molécula de adhesión por espectroscopia de fuerza atómica

Recientemente se han desarrollado varios biosensores de fuerza basados en FRET, que permiten la resolución de la fuerza intracelular específica de la proteína. En este protocolo, demostramos cómo uno de estos sensores, diseñado para el enlazador de la proteína del complejo nucleoesqueleto-citoesqueleto (LINC) Nesprin-2G, se puede utilizar para medir las fuerzas de actomiosina en el complejo nuclear LINC.

Un protocolo para el uso de Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) y forzar Biosensores para medir fuerzas mecánicas en todo el complejo nuclear de LINC

Aquí se presenta un protocolo para experimentos FRET de alta precisión en el nivel de una sola molécula. Además, esta metodología puede usarse para identificar tres estados conformacionales en el dominio de unión al ligando del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinar las distancias exactas es el primer paso hacia la construcción de modelos estructurales basados ​​en experimentos FRET.

FRET de alta precisión a nivel de molécula única para la determinación de estructuras de biomoléculas

Datos de este protocolo la construcción y operación de un microscopio de seguimiento en tiempo real 3D sola partícula capaz de seguimiento nanoescala fluorescente puntas de prueba a altas velocidades difusivos y tasas de conteo de fotones baja.

Un protocolo para el seguimiento en tiempo real 3D sola partícula

La mejora de la fluorescencia inducida por proteínas de una sola molécula resuelta en el tiempo es un útil sensor de proximidad espectroscópico de fluorescencia sensible a los cambios estructurales locales en las proteínas. Aquí mostramos que se puede usar para descubrir conformaciones locales estables en α-sinucleína, que también se conoce como globularmente no estructurada e inestable cuando se mide utilizando la regla FRET de mayor alcance.

Utilizando la mejora de la fluorescencia inducida por proteínas resueltas en el tiempo para identificar conformaciones locales estables un monómero α-sinucleína a la vez

Este artículo presenta un método para el análisis espaciotemporal de sondas móviles basadas en la transferencia de energía de resonancia de Förster (smFRET) de una sola molécula utilizando microscopía de fluorescencia de campo amplio. El kit de herramientas de software recientemente desarrollado permite la determinación de trazas de tiempo smFRET de sondas en movimiento, incluida la eficiencia FRET correcta y las posiciones moleculares, como funciones del tiempo.

Análisis espaciotemporal bidimensional automatizado de sondas MÓVILES FRET de una sola molécula

Este protocolo describe la aplicación de la microscopía de fuerza atómica y la espectroscopia infrarroja a nanoescala para evaluar el rendimiento de la espectroscopia infrarroja fototérmica a nanoescala en la caracterización de muestras multipoliméricas tridimensionales.

Avances en espectroscopía infrarroja a nanoescala para explorar sistemas poliméricos multifásicos

Aprende a obtener información estructural de biomoléculas mediante FRET de molécula única utilizando el Sistema Rápido de Nano-posicionamiento. Este método combina microscopía TIRF con análisis bayesiano para localizar dominios flexibles.

La información estructural a partir de una sola molécula de FRET experimentos utilizando el Nano-posicionamiento Sistema Rápido

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