Name: La fabricación de un UV-Vis y espectroscopia Raman Plataforma de Inmunoensayo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Aprende a desarrollar un inmunoensayo basado en nanopartículas de oro utilizando espectroscopía UV-Vis y Raman. Este método dual valida resultados y permite la detección de múltiples biomarcadores con alta sensibilidad.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por un Premio Catalizador de Investigación de la Universidad Estatal de Utah. Los autores desean agradecer a Annelise Dykes, Cameron Zabriskie y Donald Wooley por sus contribuciones.

1. Preparación de tampones <ol><li> Phosphate Buffered Saline (PBS) <ol><li> Diluir 50 ml de 10x PBS con 450 ml de agua de grado HPLC para hacer una concentración de 1 x PBS. Filtro estéril la solución con un filtro de 0,22 micras. </li><li> Conserve la solución a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparación de solución salina tamponada con Tris + Tween 20 (TBST) <ol><li> Diluir 50 ml de solución salina tamponada con Tris 10x (TBS) con 450 ml de agua de grado HPLC para hacer una concentración 1x. Añadir 250 l de Tween-20 para un 0,05% (v / v) de Tween-20. Filtro estéril la solución con un filtro de 0,22 micras. </li><li> Almacenar a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparación de albúmina de suero humano (HSA) de solución de bloqueo <ol><li> Pesar 0,45 g de HSA en 15 ml de PBS estéril filtrada 1x para hacer un 3% w / v solución de HSA. agitar hasta disolución de HSA se haya disuelto completamente. </li><li> Almacenar la solución de HSA a 4 ° C. NOTA: albúmina de suero bovino(BSA) también se puede utilizar como una solución de bloqueo. </li></ol></li><li> Preparación de anticuerpo PEGilado solución (PEG-Ab) NOTA: La solución de anticuerpo debe estar libre de proteínas portadoras o estabilizantes tales como BSA, que interferirían con las reacciones de conjugación al competir por la N-hidroxisulfosuccinimida (NHS) sitios de unión. Si el anticuerpo se presenta en una solución de Tris o tampón de glicina, debe someterse a un intercambio de tampón para evitar aminas o sales de amonio de interferir con la reacción de conjugación NHS. Si el anticuerpo está en una forma liofilizada, que se puede resuspender de acuerdo con la recomendación del fabricante a una concentración de 1-10 mg / ml. <ol><li> Para los anticuerpos en un tampón de Tris o glicina, realizar un intercambio de tampón a bicarbonato de sodio 100 mM usando una columna de desalación. Utilice el tampón de 100 mM para elevar el pH a aproximadamente 8,5 para acelerar la reacción de conjugación. </li><li> Hidrato de orto-piridil disulfuro-PEG-NHS (OPSS-PEG-NHS) con 100 mM sodium bicarbonato para un volumen de 1 ml a una concentración de 1 mg / ml o mayor. NOTA: OPSS-PEG-NHS debe hacerse fresco y usado dentro de aproximadamente 20 minutos. El grupo NHS en el OPSS-PEG-NHS tiene una vida media de aproximadamente 20 min en una solución acuosa a pH 8,5. </li><li> Añadir OPSS-PEG-NHS a la solución de anticuerpo en una relación 2: 1 (PEG: anticuerpo) relación de conjugación que se usa para las muestras de ensayo. En un tubo de microcentrífuga separado, añadir OPSS-PEG-NHS a la solución de antígeno en una proporción de 2: 1 de conjugación para ser utilizado para el control. NOTA: La proporción de 2: 1 está asumiendo una eficiencia de conjugación 50%. El objetivo es etiquetar cada anticuerpo con una cadena de PEG. En este paso, el exceso de etiquetado es mejor que en virtud de etiquetado. Utilice la siguiente ecuación para determinar los volúmenes apropiados de OPSS-PEG-NHS y solución de anticuerpos: <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_2.jpg" /> donde V es el volumen, C es la concentración expresada en moléculas o unaticuerpos por ml. Los subíndices PEG y Ab son OPSS-PEG-NHS y el anticuerpo, respectivamente. El volumen final debe ser de aproximadamente 250 l. </li><li> Incubar solución de PEG-Ab a 4 ° C durante 8 horas o durante la noche. Conserve la solución en alícuotas de aproximadamente 25 l trabajo a -20 ° C para limitar los ciclos de congelación y descongelación y asegúrese de usar tubos de unión de baja. </li></ol></li></ol> 2. Preparar UV-Vis / Raman Sondas <ol><li> Preparar la solución AuNP desnuda <ol><li> Preparar una solución de AuNPs 2 ml con una concentración de aproximadamente 1 x 10 11 partículas por ml. <ol><li> Si las AuNPs deben concentrarse, llenar tubos de centrífuga de baja unión con 2.000 l de Stock AuNP y centrifugar a 5000 xg durante 20 minutos o hasta que el sobrenadante es claro. Eliminar el sobrenadante con la pipeta, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento AuNP. </li><li> Se combinan las soluciones AUNP restantes en un tubo y estimar la concentraciónción mediante la obtención de una medición UV-Vis y comparando los valores a concentraciones conocidas ya que esta es una relación lineal. </li></ol></li></ol></li><li> Determine la relación etiquetado reportero apropiado Raman <ol><li> Preparar una solución de trabajo del reportero Raman disuelto en metanol. Esta concentración será dependiente de la reportero utilizado. En este trabajo, preparar yoduro de 3,3 &#39;diethylthiatricarbocyanine (DCTC) a una solución de trabajo de 200 mM. </li><li> Suponiendo un volumen final de 100 l para cada pocillo, añadir una cantidad suficiente de la solución de reportero de trabajo a cada pocillo de la primera fila de una placa de 96 pocillos de manera que el reportero Raman oscilará en concentraciones de 0,2 M a 10 mM. Añadir suficiente agua de grado HPLC a cada pocillo de tal manera que el volumen es de 80 l. Añadir 20 l de AuNP a cada pocillo hacer un volumen final de 100 l para cada pocillo. Un ejemplo se proporciona en la Tabla 1. </li><li> Medir la radiación UV-Vis de 400 a700 nm utilizando una placa de lectura de UV-Vis. La concentración apropiada es la concentración más alta con picos definidos para los espectros UV-Vis. Repita el paso 2.2.2 a concentraciones crecientes hasta que la relación de concentración más alta de reporteros Raman para AuNPs se encuentra. NOTA: El colorante y la forma AuNP, tamaño y fabricante influyen en la concentración apropiada. Por lo tanto, los pasos que se indican deben ser evaluadas y modificadas en función de los componentes utilizados. Este protocolo implicó el uso de un colorante cargado positivamente. Como tal, la unión entre el AuNP y reportero fue mejorado mediante el uso de AuNPs con carga negativa. Esto se hace mediante el uso de citrato AuNPs tapado. Vea la sección de discusión para más detalles. </li></ol></li><li> Encuadernación reportero Raman y PEG-Ab a AUNP <ol><li> Preparar dos 1,5 ml lotes de AuNP y reportero Raman a la concentración previamente determinada, lo que permite el reportero Raman para unirse a los AuNPs durante 30 min a temperatura ambiente.</li><li> Añadir el anticuerpo PEGilado (PEG-Ab) a un lote de la solución reportero AuNP y Raman para crear un 200: 1 de anticuerpos a partículas. Esta solución será para las muestras de ensayo. En un tubo de microcentrífuga separado, añadir el antígeno PEGilado para el otro lote de la solución reportero AuNP y Raman en un 200: 1 de anticuerpo a partículas para ser utilizado como el control. Incubar las soluciones para 30 min a temperatura ambiente. NOTA: La proporción de anticuerpos a partículas será específica para las AuNPs y tinte usado y debe ser optimizada para cada caso individual. El objetivo aquí es tener la mayor proporción de anticuerpos para las sondas AUNP que se unen a al tiempo que evita la agregación de las partículas. Utilice la siguiente ecuación para determinar los volúmenes apropiados para agregar juntos: <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_200.jpg" /> donde V es el volumen, C es la concentración expresada en partículas o anticuerpos por ml. La aletaal volumen debe ser de aproximadamente 1,5 ml. </li></ol></li><li> Bloquear los sitios en la superficie AuNP con mPEG-SH restante. <ol><li> Preparar mPEG-SH por disolución sólida metoxi tiol a una concentración 200 mM usando agua. Vortex la solución hasta que mPEG-SH se disuelva completamente. </li><li> Añadir mPEG-SH en un 40,000: 1 relación a la solución AuNP-PEG-Ab hecha en el paso 2.3. Incubar la solución a temperatura ambiente durante 10 min para asegurar que los sitios restantes de la nanopartícula de oro están bloqueadas. Utilice la siguiente ecuación para determinar los volúmenes apropiados para agregar juntos: <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_40000.jpg" /> donde V es el volumen, C es la concentración expresada en partículas o anticuerpos por ml. El volumen final debe ser de aproximadamente 1,5 ml. </li></ol></li><li> Recuperar sondas funcionalizadas Raman. <ol><li> partículas de centrifugar a 5.000 g durante 20 min en baja se unen centrifuge tubos o hasta que el sobrenadante es claro. Eliminar el sobrenadante con la pipeta con cuidado de no molestar a los AuNPs. </li><li> Volver a suspender las partículas con 1 ml de solución de PBS 1x que se hizo anteriormente. Estimar la concentración AuNP por tomar una medición UV-Vis de un pequeño volumen de solución (3 l) y comparar los resultados con las mediciones de una concentración AuNP conocido. Ajustar el volumen de tal manera que la solución final es de al menos 1 x 10 11 partículas por ml. </li><li> Las soluciones se almacenan a 4 ° C hasta que se utiliza para la funcionalización de la placa de inmunoensayo. Utilice las soluciones dentro de una semana. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Los volúmenes de añadir de cada componente (ml) </td></tr><tr><td> DCTC concentración final (mM) </td><td> solución de trabajo DCTC (200 mM) </td><td> AuNP </td><td> Agua </td></tr><tr><td> 0,2 </td&gt; <td> 0,1 </td><td> 20 </td><td> 79.9 </td></tr><tr><td> 0,6 </td><td> 0,3 </td><td> 20 </td><td> 79.7 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0,5 </td><td> 20 </td><td> 79.5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1.0 </td><td> 20 </td><td> 79 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 2.5 </td><td> 20 </td><td> 77.5 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 3.5 </td><td> 20 </td><td> 76.5 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 5.0 </td><td> 20 </td><td> 75 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. DCTC ejemplo dilución. Varias diluciones de DCTC y los volúmenes asociados de Stock DCTC, solución de nanopartículas de oro, y el agua. 3. Inmunoensayo Placa Preparación <ol><li> Unirse al antígeno deseado a la placa de inmunoensayo. <ol><li> Preparar suficiente antígeno diluido (50 g / ml) para llenar los pocillos de poliestireno. Vortex la solución,e inmediatamente añadir la solución a los pocillos de la placa. Permitir que el antígeno se una a las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Lavar los antígenos no unidos. <ol><li> Retire el exceso de solución de antígeno por la solución de vertido en un contenedor de eliminación de la placa y golpear contra una mesa de toallas de papel cubierto. </li><li> Añadir TBST a los pocillos para lavar la superficie a continuación, quitar el lavado de la misma manera como se ha indicado anteriormente. Repita este paso dos veces más. </li></ol></li><li> Bloque restantes sitios de unión en la placa para evitar la unión no específica. <ol><li> Añadir 70 l de solución de bloqueo HSA a cada pocillo de la placa e incubar a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Retirar y enjuagar la placa utilizando el mismo procedimiento que se especifica en el paso 3.2. Cubrir la placa y seco para guardar a 4 ° C hasta que esté listo para su uso posterior. </li></ol></li><li> Funcionalizar placa de inmunoensayo. <ol><li> Añadir 70 l de tque la sonda nanopartículas preparadas en la Sección 2 de la primera columna de una placa de 96 pocillos y diluir columnas subsiguientes usando una dilución 1: 2 en serie. Dejar que la placa se incuba durante al menos 1 hora. Un ejemplo de la forma de preparar la placa de inmunoensayo se da en la Figura 3. </li><li> Lavar la placa con TBST cinco veces como se detalla en los pasos 3.2, asegurándose de disponer de las AuNPs adecuadamente. Después del lavado final, añadir 70 l de 1x PBS a cada pocillo y cubrir con una junta de la placa. NOTA: Las muestras de control deben ser claros. Si se ha producido la unión no específica, las muestras de control tendrán un color parecido a las muestras de ensayo. </li></ol></li><li> Prueba de la sensibilidad del ensayo UV-Vis y espectroscopía Raman. <ol><li> Para cada pocillo, medir la UV-Vis espectros que van de 400 a 700 nm utilizando una placa de lectura de UV-Vis espectrofotómetro. </li><li> El uso de un microscopio Raman invertida, centrar el objetivo en la superficie del pozo que tiene las sondas AUNP. Transmisión exteriorner un espectro de Raman del pozo. Recoger un espectro que va desde 1.800 cm -1 a 400 cm -1. Repita este paso para todos los pozos. </li><li> El uso de un software apropiado espectral, realice una orden de corrección de línea de base polinómica 11ª para los espectros Raman y un polinomio de orden 3º de la radiación UV-Vis. </li><li> El uso de un software apropiado espectral, normalizar el Raman y UV-Vis. Ajuste el valor máximo de la escala 1 y todos los demás valores en consecuencia. Para normalizar los espectros Raman, seleccione un pico de poliestireno único y establezca su valor en 1 y la escala de todos los demás valores en consecuencia. </li><li> El uso de un software apropiado espectral, lleve a cabo la integración de picos para cada espectro. Para los espectros de Raman, el pico que representa el reportero Raman debe estar en una región ausente de los picos de poliestireno. Para llevar a cabo la integración de picos, especifique los límites integrales para el pico deseado y registrar el área del pico deseado para todas las muestras incluyendo los controles. </li><li> plAT el área promedio pico de interés como una función del logaritmo de la concentración AuNP con barras de error para cada punto que indica su desviación estándar asociada. Montar estos puntos de calibración a una curva logística de 4 parámetros. </li><li> Determinar el valor medio de la pieza en bruto por el promedio del área del pico de interés para una muestra en blanco. Determinar la desviación típica de estas zonas; esta es la desviación estándar de la pieza en bruto. </li><li> Para el mismo pico analizado en el paso anterior, encontrar la desviación estándar de que el área del pico para la concentración más baja. </li><li> Calcular el límite del límite de espacio en blanco y el inferior de prueba como se especifica en la sección de resultados Representante. Utilice estos valores con las curvas de calibración para determinar la 4PL LLOD en términos de concentración AuNP. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIsraelsen%2C+ND+%22Sci.+World+J%22">Sci. World J</a>. , e124582(2015).</li>
<li>Wang, Y., Schlücker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+and+synthesis+of+SERS+labels%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Rational design and synthesis of SERS labels.</a> Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Yan, B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERS+tags%3A+novel+optical+nanoprobes+for+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis.</a> Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Immunoassay+Handbook%3A+Theory+and+applications+of+ligand+binding%2C+ELISA+and+related+techniques%22">The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques</a>. , Elsevier Science: Oxford. Waltham, MA. (2013).</li>
<li>Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCox%2C+KL+%22Assay+Guid.+Man%22">Assay Guid. Man</a>. , [Accessed: 28-Mar-2016] 
 <a target="_blank" href="
	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/
	">
	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/
	</a> (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ELISA+development+guide%22">ELISA development guide</a>. , [Accessed: 28-Mar-2016] 
 <a target="_blank" href="https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf">https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf</a> (2016).</li>
<li>Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+Raman-labeled+nanoparticles+for+a+dual-modality%2C+light+scattering+immunoassay+on+a+polystyrene+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate.</a> J. Biol. Eng. 10, (2016).</li>
<li>Menges, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMenges%2C+F+%22Spekwin32+-+optical+spectroscopy+software.+Version+1.72.1%22">Spekwin32 - optical spectroscopy software. Version 1.72.1</a>. , [Accessed: 28-Mar-2016] 
 <a target="_blank" href="http://www.effemm2.de/spekwin/">http://www.effemm2.de/spekwin/</a> (2016).</li>
<li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li>
<li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+Antibody+Binding+on+Protein+Microarrays+using+Microarray+Nonlinear+Calibration%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration.</a> BioTechniques. 54, 257-264 (2013).</li>
<li>Armbruster, D. A., Pry, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limit+of+blank%2C+limit+of+detection+and+limit+of+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Biochem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation.</a> Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EP17-A2%3A+Evaluation+of+Detection+Capability+for+Clinical+Laboratory+Measurement+Procedures%3B+Approved+Guideline%22">EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline</a>. 32. No 8, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, 19087, USA. 
 <a target="_blank" href="http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html">http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html</a> (2012).</li>
<li>Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+assessing+the+reliability+of+molecular+diagnostics+based+on+multiplexed+SERS-coded+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles.</a> Plos One. 8 (4), e62084(2013).</li>
<li>Sinha, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+binding+potential+of+cell-surface+receptors+in+fresh+excised+specimens+via+dual-probe+modeling+of+SERS+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles.</a> Sci. Rep. 5, 8582(2015).</li>
<li>Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+tumor+cells+using+targeted+surface-enhanced+Raman+scattering+nanoparticles+and+magnetic+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment.</a> J. Biomed. Opt. 19, 056014(2014).</li>
<li>Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silica-coated+dimers+of+silver+nanospheres+as+surface-enhanced+Raman+scattering+tags+for+imaging+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells.</a> Interface Focus. 3 (3), 20120092(2013).</li>
<li>McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+surface-enhanced+Raman+tags%3A+individual+nanorods+for+measurements+from+the+visible+to+the+infrared+%28514-1064+nm%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Nano%22%5BJournal%5D)">Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm).</a> Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

En el protocolo detallado, hay varios puntos críticos para abordar. Una cuestión es la elección del reportero Raman y nanopartículas de oro. Aunque el protocolo fue escrito para ser adaptado para su uso individual, el Raman reportero DCTC fue utilizado como un ejemplo. DCTC es un reportero de carga positiva y se une a superficies tales como citrato AuNPs capsulado cargado negativamente. Este protocolo puede ser adaptado para la prensa de carga negativa mediante el uso de nanopartículas de oro con una carga superficial p...

inmunoensayos de tipo sándwich típicos detectar indirectamente la presencia de un antígeno usando dos anticuerpos. El anticuerpo de captura se une a una superficie sólida y forma un complejo anticuerpo-antígeno cuando en la proximidad de un antígeno apropiado. Un anticuerpo de detección se presentó a continuación y se une al antígeno. Después del lavado, el anticuerpo / antígeno / restos complejo de anticuerpo y se detecta por el anticuerpo de detección marcado tal como se demuestra en la Figura 1A. Detección típica se realiza por un detector fluorescente o colorimétrico, lo que limita la multiplexación a 10 analitos debido a picos anchos espectrales 2,3. Por el contrario, los sistemas basados en Raman tienen picos de emisión mucho más estrechas que resultan en las capacidades de multiplexación mejoradas con fuentes que afirman la detección simultánea de hasta 100 analitos 2,3. Muchas fuentes bibliográficas están disponibles que cubren aspectos importantes relacionados con inmunoensayos 4 - 6, como paso a pasodetalles para crear kits ELISA personalizadas. Desafortunadamente, estos protocolos son para la detección fluorescente o colorimétrico, lo que limita la capacidad de multiplexación de inmunoensayos personalizados. Para hacer frente a esta necesidad, se presenta un procedimiento detallado para fabricar el / Raman inmunoensayo UV-Vis previamente publicado 7 para un inmunoensayo directo como se ilustra en la Figura 1B. Este protocolo incluye la fabricación de sondas basados en nanopartículas de oro funcionalizada, que se ilustra en la Figura 2. El procedimiento para hacer las sondas / UV-Vis Raman comienza por reporteros Raman unión a la superficie de nanopartículas de oro (AuNPs). Los AuNPs son entonces funcionalizados con anticuerpos que se asocian con polietilenglicol (PEG). sitios de unión restantes en la AuNPs se bloquean por la unión de tiol metoxi polietilenglicol (mPEG-SH) para AuNPs para evitar la posterior unión no específica durante el análisis. Las sondas AUNP preparados se prueban mediante la unión a antígenosfijado a los pocillos de una placa de poliestireno, como se ilustra en la Figura 1B. Tras lavar la placa, las sondas AUNP se detectan utilizando espectroscopia UV-Vis, mientras que los reporteros Raman asociados se detectan con la espectroscopia Raman. La combinación de datos UV-Vis y espectral Raman proporciona dos métodos de análisis, la mejora de las capacidades de este inmunoensayo.

<table><tbody><tr><td>Nanopartícula de oro de 60 nm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15708-6</td><td>Se trata de nanopartículas de oro recubiertas de citrato. Por favor, consulte la discusión para conocer la relación entre el reportero Raman y la carga superficial de AuNP y su importancia para la selección adecuada del reportero AuNP y/o Raman.</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>339000000</td><td></td></tr><tr><td>Tris Solución salina tamponada (10x) pH 7.5</td><td>Scy Tek</td><td>TBD999</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtración de tapa de botella</td><td>VWR</td><td>97066-202</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polisorbato 20)</td><td>Scy Tek</td><td>TWN500</td><td>Se utiliza como agente emulsionante para las etapas de lavado.</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato 10x concentrado, pH 7.4</td><td>Scy Tek</td><td>PBD999</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Tube 2.0&nbsp; ml</td><td>Los tubos Eppendorf 22431102</td><td></td><td>tubos LoBind evitan la unión de proteínas y AuNPs a las superficies de los tubos.</td></tr><tr><td>Tubo LoBind de proteínas 0.5&nbsp; ml</td><td>Los tubos Eppendorf 22431064</td><td></td><td>tubos LoBind evitan la unión de proteínas y AuNPs a las superficies de los tubos.</td></tr><tr><td>Dispositivos de microplacas UniSeal</td><td>GE Healthcare</td><td>7704-0001</td><td>Se utiliza para sellar y almacenar placas funcionalizadas.</td></tr><tr><td>Placa de ensayo, con tapa de baja evaporación, fondo plano de 96 pocillos</td><td>Costar</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado HPLC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-4L</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-yoduro de dietiltiatricarbocianina (DTTC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>381306-250MG</td><td>Raman reportero</td></tr><tr><td>mPEG-Thiol, MW 5,000 - 1 gramo</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td>MPEG-SH-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>OPSS-PEG-SVA, MW 5.000 - 1&nbsp; gramo</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td>OPSS-PEG-SVA-5000-1g</td><td>OPSS-PEG-SVA tiene un extremo NHS.</td></tr><tr><td>IgG de ratón, control de molécula entera</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31903</td><td>Antígeno</td></tr> de <tr><td>cabra anti-IgG de ratón (H + L) Anticuerpo secundario adsorbido cruzado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31164</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>Solución de bloqueo de albúmina sérica humana</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1887-1G</td> En <td>su lugar, se puede utilizar albúmina de suero bovino.</td></tr><tr><td>Mini centrífuga</td><td>Fisher Schientific</td><td>12-006-900</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-Vis</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-Vis</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>Columnas de desalinización</td><td>Thermor Scientific</td><td>87766</td><td></td></tr><tr><td>Fabricación propia 785&nbsp; Unidad de microscopio Raman invertido</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Un microscopio Raman invertido es el mejor para enfocar correctamente la superficie de la placa de pocillo. De lo contrario, se utilizará un aumento muy bajo debido a la altura de la placa de 96 pocillos. Se utilizó un sistema construido internamente, ya que era más barato que comprar a un proveedor. Sin embargo, se puede utilizar cualquier sistema de microscopio Raman invertido disponible en el mercado.</td></tr></tbody></table>

la fabricación de un uv-vis y espectroscopia raman plataforma de inmunoensayo

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

Los inmunoensayos se usan para detectar proteínas en base a la presencia de anticuerpos asociados. Debido a su amplio uso en la investigación y la práctica clínica, una gran infraestructura de los instrumentos y materiales de inmunoensayo se puede encontrar. Por ejemplo, 96 y 384 pocillos placas de poliestireno están disponibles comercialmente y tienen un diseño estándar para acomodar máquinas espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis) de diferentes fabricantes. Además, una amplia variedad de inmunoglobulinas, etiquetas de detección, y agentes de bloqueo para diseños personalizados de inmunoensayos tales como ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA) están disponibles. A pesar de la infraestructura existente, kits de ELISA estándar no cumplen todas las necesidades de investigación, lo que requiere el desarrollo de inmunoensayo individualizado, que puede ser costoso y consume mucho tiempo. Por ejemplo, kits de ELISA tienen baja multiplexación (detección de más de un analito a la vez) capacidades, ya que por lo general dependen de la fluorescencia o la colmétodos orimetric para la detección. Colorimétricos y análisis basados ​​fluorescentes tienen una capacidad limitada de multiplexación debido a picos anchos espectrales. Por el contrario, los métodos basados ​​en la espectroscopia Raman tienen una capacidad mucho mayor para la multiplexación debido a picos de emisión estrechos. Otra de las ventajas de la espectroscopia Raman es que los reporteros Raman experimentan significativamente menos photobleaching que las etiquetas fluorescentes 1. A pesar de las ventajas que tienen sobre la prensa Raman etiquetas fluorescentes y colorimétricos, protocolos para fabricar los inmunoensayos basados ​​en Raman son limitadas. El propósito de este trabajo es proporcionar un protocolo para preparar sondas funcionalizadas para utilizar en conjunción con placas de poliestireno para la detección directa de analitos por análisis UV-Vis y espectroscopía Raman. Este protocolo permitirá a los investigadores a adoptar un enfoque do-it-yourself para la futura detección de múltiples análisis al mismo tiempo aprovechar la infraestructura ya establecida.

En este estudio, se utilizaron 60 partículas de oro nm para espectroscopía UV-Vis. UV-Vis espectros de absorción de 400 a 700 nm fueron recogidos y las áreas de los picos correspondientes a cada concentración AuNP se determinaron usando un software de análisis espectral de código abierto 8. Antes de pico de integración, los espectros recogidos se sometió a corrección de línea base usando un ajuste polinómico de tres puntos. Áreas de los picos se utilizaron para generar una curva de calibración logarítmica com...

Las sondas ópticas basadas en nanopartículas han sido diseñadas como un vehículo para la detección de antígenos utilizando espectroscopía Raman y UV-Vis. Aquí describimos un protocolo para preparar dichas sondas para un inmunoensayo de espectroscopía UV-Vis/Raman de tal manera que incorporen futuras capacidades de multiplexación.

La fabricación de un UV-Vis y espectroscopia Raman Plataforma de Inmunoensayo

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

El objetivo general de este protocolo es demostrar el desarrollo de un inmunoensayo basado en nanopartículas de oro personalizables, capaz de ser analizado mediante espectroscopía UV-Visible y Raman. El uso de dos métodos ópticos proporciona una validación interna del ensayo y aumenta su flexibilidad. Este método responde preguntas clave sobre el desarrollo de un inmunoensayo basado en nanopartículas de oro.Y explica cómo la funcionalización de la nanopartícula utilizada en este ensayo influirá en la absorción óptica y la dispersión de la luz. Este protocolo es único porque incorpora materiales disponibles en laboratorios de investigación típicos para fabricar una plataforma de inmunoensayo que puede personalizarse según las necesidades individuales de cada investigación. El inmunoensayo se basa en espectroscopía UV-Vis y Raman.Usar la espectroscopía Raman es mejor que los métodos fluorescentes o colorimétricos, ya que tiene anchos de banda más estrechos, lo que permite la detección simultánea de múltiples biomarcadores. Para comenzar, hidrate el agente bifuncional de reticulación o el PEG-NHS de piridilo disulfuro en 100 mL de bicarbonato de sodio. El extremo orto de piridilo se unirá a la superficie de la nano partícula de oro y el extremo NHS reaccionará con la amina primaria en la superficie de la proteína una vez activado.Asegúrese de preparar la solución de reticulación aproximadamente 20 minutos antes de su uso. A continuación, agregue el reticulador bifuncional a la solución de anticuerpo en una relación de conjugación de 2 a 1. Asegúrese de que la solución de anticuerpo esté libre de proteínas portadoras que puedan interferir con la reacción.En un tubo de microcentrífuga aparte, agregue el agente de reticulación bifuncional a la solución de antígeno en la misma proporción que se utilizará para el control. La proporción de 2 a 1 supone una eficiencia de conjugación del 50 %. El objetivo es etiquetar cada anticuerpo con una sola cadena de peg.En este paso, es preferible una etiquetación excesiva a una insuficiente. Finalmente, incubar la solución de anticuerpo pegilado a cuatro grados Celsius durante ocho horas. Almacenar alícuotas de 25 microlitros de la solución en tubos de baja unión a menos 20 grados Celsius para limitar los ciclos de congelación y descongelación.Utilice cada alícuota según sea necesario. Para preparar las sondas de Raman, primero prepare dos lotes de 1,5 mL de nanopartículas de oro sobre el reportero de Raman con las concentraciones determinadas según se describe en el protocolo de texto adjunto. Esto se realiza combinando las soluciones del reportero de Raman y de las nanopartículas de oro y permitiendo que se unan durante treinta minutos a temperatura ambiente.Luego, agregue la solución de anticuerpo pegilado a una de las soluciones de nanopartículas de oro marcadas con el reportero para crear una proporción de 200 a 1 de anticuerpos por partículas. Esta solución será para las muestras de prueba. En un tubo diferente de microcentrifugado, agregue un antígeno pegilado a la otra solución de nanopartículas de oro marcadas con el reportero en una proporción de 200 a 1 de antígeno por partículas, que se utilizará como control.Incube ambas soluciones durante treinta minutos a temperatura ambiente. A continuación, bloquee los sitios restantes en la superficie de la nano partícula. Para lograr esto, primero disuelva el tiol de metoxipolietilenglicol sólido hasta una concentración de 200 micromolar utilizando agua HPLC.Vortex la solución hasta que el tiol se disuelva completamente. Luego, agregue la solución de tiol en una proporción de 40.000 a 1 a las soluciones de anticuerpos pegilados unidos a nanopartículas y incube la mezcla a temperatura ambiente durante diez minutos para asegurar que los sitios restantes en la nanopartícula de oro queden bloqueados. A continuación, recupere las sondas de Raman funcionalizadas centrifugando las partículas en tubos de centrifuga de baja unión hasta que el sobrenadante esté claro.Retire el sobrenadante mediante pipeteo, pero tenga cuidado de no perturbar las nanopartículas. Luego, re-suspenda las nanopartículas con 1 mL de PBS. Estime la concentración de nanopartículas de oro tomando una medición UV visible de aproximadamente 3 microlitros de la solución y compare los resultados con los obtenidos a partir de una concentración conocida de nanopartículas de oro, ya que esta es una relación lineal.Si las nano partículas no están suficientemente bloqueadas, se agruparán debido a las fuerzas de adhesión entre partículas, lo que indica que los reactivos se agregaron en concentraciones incorrectas. Normalmente, la solución tiene un color rojo intenso, pero la agregación produce un matiz grisáceo. Ajuste los volúmenes de manera que las soluciones finales tengan al menos 1 × 10¹¹ partículas por mililitro y almacene las soluciones a cuatro grados Celsius hasta que se utilicen para funcionalizar la placa de ensayo amino.Utilice estas soluciones dentro de una semana. Primero, prepare suficiente antígeno diluido para llenar los pocillos de poliestireno. Luego, vortexe la solución e inmediatamente añádala a los pocillos de la placa.Deje que el antígeno se una a las placas durante una hora a temperatura ambiente. Luego, elimine la solución excesiva de antígeno volcando la solución y golpeando la placa contra una superficie cubierta con una toalla de papel. Añada TBST a los pocillos para lavar la superficie, luego elimine el lavado volcando nuevamente la solución y golpeando la placa contra una superficie cubierta con una toalla de papel.A continuación, bloquee los sitios de unión restantes en la placa para evitar la unión no específica mediante la adición de 70 microlitros de solución bloqueadora de HSA a cada pocillo de la placa e incubar la placa a temperatura ambiente durante treinta minutos. Luego, retire la solución bloqueadora y enjuague la placa tres veces con TBST como se demostró previamente. Después de eliminar el último enjuague, cubra la placa y almacénela seca a cuatro grados Celsius hasta su uso posterior.Añada 140 microlitros de las nanopartículas de sonda previamente preparadas en la primera columna de una placa de 96 pocillos. Coloque las nanopartículas de prueba en las primeras cinco filas y luego las nanopartículas de control en las últimas tres filas. Añada 70 microlitros de PBS a todas las demás columnas.Diluya cada columna utilizando una dilución seriada 1 a 2. Comience tomando 70 microlitros de la primera columna y mezclándolos con la segunda. Luego tome 70 microlitros de la segunda columna y añádalos a la tercera, y así sucesivamente.Deje que la placa incube durante al menos una hora. Luego, retire las sondas de nanopartículas no unidas y lave la placa cinco veces con TBST, como se demostró previamente. Después del último lavado, agregue 70 microlitros de PBS a cada pocillo y cubra la placa con un sellador para placas.Verifique que las muestras de control estén claras. Si ha ocurrido unión no específica, las muestras de control tendrán un color similar al de las muestras de prueba. Para cada pocillo, utilice un espectrofotómetro de lectura de placas UV-Visible para medir los espectros UV-Visible en el rango de 400 a 700 nanómetros.Utilizando un microscopio Raman invertido, enfoque el objetivo sobre la superficie del pocillo que contiene las sondas de nanopartículas de oro. Obtenga un espectro Raman del pocillo. Recolecte un espectro que abarque desde 1800 cm⁻¹ hasta 400 cm⁻¹ y repita este procedimiento para cada pocillo.Finalmente, siga los pasos de la sección final del protocolo de texto adjunto para determinar la sensibilidad del montaje. Se prepararon partículas de oro de 60 nanómetros como se describe en este video. Luego, se analizaron mediante espectroscopía UV-Visible y espectroscopía Raman.Las áreas de los picos donde se determinó cada concentración de nanopartículas de oro se analizaron mediante un software de análisis espectral de código abierto, y se utilizaron para generar una curva de calibración logarítmica como la que se muestra aquí. A partir de estos datos, se encontró que el límite inferior de detección fue de 3,5 picomolar para la detección UV-Visible y de 1,7 picomolar al utilizar espectroscopía Raman. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo personalizar inmunoensayos basados en sondas de nanopartículas utilizando espectroscopía UV-Vis y Raman.

fabricating-a-uv-vis-and-raman-spectroscopy-immunoassay-platform

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Cuantitativo, de alto rendimiento, en tiempo real, y sin etiquetas de detección biomolecular (ADN, proteínas, etc) sobre...

Biomoleculares de detección utilizando el sensor de reflectancia de imágenes interferométricas (IRIS)

En este video, describimos el método de inmunoensayo directo basado en espectroscopia Raman para detectar antígenos objetivo específicos. Los anticuerpos, que se adsorben en la superficie de las nanopartículas de oro unidas a las sondas Raman, interactúan con los antígenos objetivo y producen un espectro Raman específico, que posteriormente se detecta.

Un inmunoensayo directo basado en espectroscopia Raman para detectar un antígeno específico

Describimos la fabricación y caracterización de sistemas nanobiológicos que interactúan sustratos nanoestructurados con proteínas inmovilizadas y aptámeros. Se describen los pasos experimentales relevantes que involucran la fabricación litográfica de sustratos nanoestructurados, la biofuncionalización y la caracterización de espectroscopia Raman mejorada en superficie (SERS). Se demuestra la detección de SERS de proteínas inmovilizadas en superficie y el sondaje de la unión proteína-ligando y...

Surface Enhanced Raman Spectroscopy detección de biomoléculas mediante EBL Fabricados Nanoestructurados Sustratos

Se presenta un procedimiento para la fabricación y la realización de la superficie a base de filtro de Raman espectroscópico (SERS) de ensayo mejorado para la detección de contaminantes químicos (es decir, ferbam pesticidas y antibiótico ampicilina).

Una superficie basada en el filtro mejorado de Raman espectroscópico Ensayo para la detección rápida de contaminantes químicos

Nos detalle un método para fabricar dispositivos microfluídicos basados ​​en papel tridimensionales para su uso en el desarrollo de inmunoensayos. Nuestro enfoque de conjunto de dispositivo es un tipo de múltiples capas, la fabricación aditivo. Demostramos un inmunoensayo sándwich para proporcionar resultados representativos de estos tipos de dispositivos basados ​​en papel.

La fabricación de dispositivos de microfluidos basados ​​en papel tridimensional para inmunoensayos

Este protocolo describe la fabricación de una cinta pequeña, lista para usar que se puede aplicar para detección visual de varios ácidos nucleicos en una prueba individual, que es fácil de operar. En este enfoque, una gama capilar fue utilizada para la detección multiplex y altamente eficiente de los objetivos de la OMG.

Detección visual de los ácidos nucleicos múltiples en un arreglo de capilares

Corriente de multiplexado de diagnóstico para detectar los Zika, chikungunya y dengue virus requieren preparación compleja y costosa instrumentación y son difíciles de usar en entornos de bajos recursos. Se muestra un diagnóstico que utiliza amplificación isotérmica con sondas desplazable filamento blanco específico para detectar y diferenciar estos virus con alta sensibilidad y especificidad.

La amplificación isotérmica multiplexada basado en plataforma de diagnóstico para detectar Zika, Chikungunya y Dengue 1

Este protocolo presenta una plataforma integrada de espectroscopia de masas (MS) de Raman que es capaz de lograr una resolución de una sola célula. La espectroscopia de Raman se puede utilizar para estudiar la respuesta celular a los medicamentos, mientras que la EM se puede utilizar para el análisis específico y cuantitativo de la toma de drogas y el metabolismo.

Una plataforma integrada de espectroscopia y espectrometría de masas de Raman para estudiar la admisión, el metabolismo y los efectos de fármacos de una sola célula

El microfluídico digital basado en electrohumección es una técnica que utiliza un cambio impulsado por voltaje en el ángulo de contacto aparente de una gota de volumen de microlitros para facilitar su manipulación. La combinación de esto con perlas magnéticas funcionalizadas permite la integración de múltiples operaciones de unidades de laboratorio para la preparación de muestras y la identificación de patógenos utilizando el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Plataforma de microfluídico digital basada en electrohumección para el ensayo automatizado de inmunoabsorbentes ligados a enzimas

Este artículo propone una nueva generación de plataformas analíticas multiparamétricas con mayor rendimiento para la caracterización de subconjuntos de vesículas extracelulares. El método se basa en una combinación de métodos de biodetección multiplexada con análisis metrológicos y morfomecánicos por microscopía de fuerza atómica, junto con espectroscopia Raman, para calificar objetivos vesiculares atrapados en un biochip de microarray.

Plataforma analítica multimodal en un chip de resonancia de plasmón de superficie multiplexada para el análisis de subconjuntos de vesículas extracelulares

Aquí presentamos un protocolo para analizar pequeñas vesículas extracelulares (sEVs) individuales utilizando espectroscopía Raman mejorada en superficie sin etiquetar (SERS), permitiendo diagnósticos y evaluaciones mínimamente invasivas de las enfermedades como vehículos terapéuticos de administración.

Explorando la aplicación de la biodetección basada en dispersión Raman mejorada en superficies de sEVs individuales en el diagnóstico y terapias de enfermedades

Aprende a desarrollar un inmunoensayo basado en nanopartículas de oro utilizando espectroscopía UV-Vis y Raman. Este método dual valida resultados y permite la detección de múltiples biomarcadores con alta sensibilidad.

La fabricación de un UV-Vis y espectroscopia Raman Plataforma de Inmunoensayo

Explorar más videos