SILAC basada en proteómica Caracterización de exosomas del VIH-1 en células infectadas

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar el proteoma exosomal de células infectadas por VIH-1. Este método puede ayudar a responder a la pregunta clave en el campo de la biología de exosomas, como el efecto de las tensiones externas en la composición del proteoma del exosoma. La principal ventaja de esta técnica es que se puede aprender incluso con una formación limitada en proteómica y biología de exosomas.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la infección por el VIH, también se puede aplicar a otros estudios de enfermedades, como las infecciones bacterianas. En este experimento se utiliza la línea celular H9, aunque se pueden utilizar varias líneas celulares siempre que se encuentren en fase de proliferación activa y sean susceptibles a la condición de prueba elegida. Siembre dos veces 10 hasta la sexta etapa: nueve células en cada uno de los dos matraces de cultivo celular.

Cultive una población en 10 mililitros de medio marcado que contenga un 10% de FBS estilizado, 100 miligramos por litro de L-lisina marcada con C13 y 100 miligramos por litro de L-arginina marcada con C13 y N15. Cultive la otra población en 10 mililitros de medio sin marcar con 10% de FBS, L-lisina y L-arginina estilizados. Cultive las células durante seis duplicaciones, momento en el que las proteínas de las células en el medio marcado están marcadas en más del 99% con aminoácidos pesados.

Agregue medios nuevos o cambie los medios a intervalos de tiempo regulares según el tipo de celdas. Al final del etiquetado, aumente el volumen de cultivo a 30 mililitros para acomodar el crecimiento de más células. Infecte las células marcadas con la cepa NL4-3 del VIH-1 utilizando un protocolo estándar de infección por VIH-1.

Agregue una cantidad adecuada de virus a las células e incube durante 48 horas mientras las células no marcadas continúan creciendo en medio no marcado sin infección por VIH-1. Al final de la infección por VIH-1, los sobrenadantes de ambas poblaciones celulares se recolectan para el aislamiento de exosomas. Recoger los sobrenadantes de los cultivos en tubos cónicos de 50 mililitros evitando las células.

Centrifugar durante 10 minutos a 300 veces g y cuatro grados centígrados para eliminar las células restantes. Recoja los sobrenadantes en tubos cónicos nuevos de 50 mililitros y centrifugue durante 10 minutos a 2.000 veces g para eliminar las células muertas. Transfiera los sobrenadantes resultantes a tubos comerciales compatibles con rotores que puedan soportar la ultracentrifugación.

Asegúrese de equilibrar los tubos de ultracentrífuga. Centrifugar los tubos durante 30 minutos a 10.000 veces g para eliminar los restos celulares. Recoja los sobrenadantes en nuevos tubos de ultracentrífuga.

Centrifugar durante 70 minutos a 100.000 veces g. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender cada gránulo rico en exosomas en cinco mililitros de PBS fresco y transfiera la solución a un tubo de ultracentrífuga nuevo.

Vuelva a centrifugar durante 70 minutos a 100.000 veces g. Después del giro final, desecha el sobrenadante. Los gránulos celulares ya están listos para la extracción de proteínas.

Para comenzar este procedimiento, disuelva cada gránulo exosomal aislado en 100 a 200 microlitros de fer-pa-lai-ses y tampón de extracción con inhibidores de proteasa agregados que pueden inhibir una gama completa de proteasas. Centrifugar las soluciones disueltas durante 10 minutos a 13.000 veces g y cuatro grados centígrados. Transfiera los sobrenadantes aclarados a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Después de cuantificar la concentración de proteínas de cada muestra mediante ensayos estándar, mezcle cantidades iguales de proteínas de las muestras marcadas y no marcadas. Aplique la mezcla igual en un gel de cuatro a 20%SDS-PAGE durante 30 minutos. Tiñe el gel con azul de Coomassie seguido de una tinción.

Con una cuchilla de afeitar, corte el carril de muestra del gel, luego corte el carril de gel en 10 a 15 piezas iguales. Coloque cada pieza en un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 mililitros para un total de 10 a 15 tubos, y continúe con el procedimiento de extracción de proteínas como se describe en el protocolo de texto. Los procedimientos para el análisis de datos proteómicos no se demostrarán, pero se resumen en este diagrama de flujo.

Las proteínas extraídas se analizan primero mediante cromatografía líquida, espectroscopia de masas en tándem y se evalúa la calidad de los datos. A continuación, los datos se tratan previamente mediante la eliminación de proteínas que tienen menos de dos péptidos cuantificados. A continuación, se identifican las proteínas significativamente reguladas al alza y a la baja.

Por último, se comparan las réplicas de los candidatos significativos para lograr la coherencia y se fusionan los datos de todas las réplicas. Para comenzar la caracterización de las proteínas identificadas, utilice sus números de acceso al GenBank o UniProt ID para buscar en las bases de datos de exosomas actuales. ExoCarta se utilizará en esta demostración.

Haga clic en consultar e introduzca el nombre del gen o la proteína, o el número de accesión. Cualquier evidencia en exosomas verifica que las proteínas candidatas se han encontrado previamente en exosomas y agrega una capa de confianza de que los candidatos están realmente en exosomas. A continuación, busque los candidatos en la base de datos de interacción entre el VIH-1 y las proteínas humanas.

En la entrada del nombre de dominio de la proteína, introduzca los nombres o números de acceso del candidato y haga clic en buscar. Los resultados de la búsqueda pueden proporcionar información sobre las interacciones entre el VIH-1 y las proteínas candidatas, y sugerir cuáles de las candidatas podrían estar realmente asociadas al VIH-1. El tercer paso es obtener una visión global de los candidatos utilizando una ontología genética o un software de análisis GO como fun-brich.

En Análisis de enriquecimiento, haga clic en agregar conjunto de datos y cargue los números de acceso de GenBank o los ID de UniProt de los candidatos, luego seleccione el tipo de gráfico para visualizar el análisis de GO. Los resultados del análisis GO se visualizan en forma de gráficos circulares que proporcionan información sobre las proteínas candidatas en las áreas de proceso biológico, componente celular y función molecular. El siguiente paso es identificar los términos GO estadísticamente sobrerrepresentados a través del análisis DAVID.

Haga clic en la herramienta de anotación funcional, introduzca la lista de candidatos y seleccione el identificador del gen, como el ID de UniProt. Una vez completada la búsqueda, haga clic en la página de resultados del resumen de anotaciones en la categoría de ontología genética para ver los términos GO enriquecidos, los valores p y otros parámetros. Por último, investigar las posibles interacciones proteína-proteína y las posibles vías bioquímicas utilizando la base de datos STRING, de acceso abierto.

Ingrese la identificación o secuencia de la proteína en el cuadro de búsqueda designado y seleccione la especie correcta para el análisis. Haga clic en Buscar. Los resultados darán información sobre las asociaciones directas e indirectas.

Las 10 principales coincidencias conocidas para el candidato exosomal que se muestran en los resultados deben tenerse en cuenta para una selección significativa de candidatos. Se muestran los resultados representativos de un análisis DAVID de un conjunto de 14 proteínas. El enriquecimiento del proceso biológico indicó que los procesos relacionados con la muerte celular se enriquecen significativamente.

El enriquecimiento de componentes celulares muestra muchas proteínas con un origen intracelular, y el enriquecimiento de la función molecular identificó un papel en la unión de proteínas para la mayoría de los candidatos. Se seleccionó la cadena B de L-lactato deshidrogenasa o LDHB como el candidato más significativo, y el análisis STRING identificó a los 10 principales socios que interactúan con LDHB. La mayoría de los socios de LDHB también estaban funcional y localmente relacionados con los exosomas en el VIH-1.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una semana si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar cada paso a la temperatura y las condiciones adecuadas. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el aislamiento por afinidad, para confirmar las predicciones del análisis bioinformático.

Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino para que las investigaciones en el campo exosomal exploraran los cambios en el proteoma exosomal asociados a las infecciones por VIH-1 en biología. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar exosomas de cultivos celulares, analizar sus proteomas e investigar su asociación con el VIH. No olvide que trabajar con el VIH u otro agente infeccioso puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de equipo de protección personal mientras se realiza este procedimiento.