Name: Análisis de los vasos coronarios en los corazones embrionarias aclarados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprende el método de aclarado tisular BABB para analizar vasos coronarios en corazones embrionarios de ratón mediante microscopía confocal. Esta técnica permite visualizar estructuras vasculares en profundidad sin seccionar.

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El trabajo fue financiado por el corazón Foundation&#39;and británica apoyada por el Instituto Nacional para la Investigación de la Salud Centro de Investigación Biomédica en el Hospital Great Ormond Street para niños NHS Foundation Trust y el University College de Londres.

Toda la investigación con animales se llevó a cabo de acuerdo con las directrices institucionales bajo licencia del Ministerio del Interior del Reino Unido. 1. La disección y la fijación de los corazones embrionarias <ol><li> La eutanasia a un ratón temporizado-embarazada en el día requerido utilizando una técnica de sacrificio éticamente aprobadas, por ejemplo, CO 2 narcosis seguido por dislocación cervical, y retirar los sacos embrionarios 14, colocándolos en una placa de 10 cm Petri llena de salina tamponada con fosfato (PBS) . </li><li> El uso de un microscopio de disección y pinzas, abrir cuidadosamente hasta los sacos uterinos y quitar cada embrión, cortar el cordón umbilical y la eliminación de la bolsa de la yema. </li><li> Para los propósitos de genotipado, quitar la cola del embrión y colocar en un tubo de 1.5 ml para la extracción de lisis / ADN después. </li><li> Con el fin de eliminar el corazón, PIN cada embrión a cabo en su parte posterior en un 35 mm placa de Petri de elastómero recubierto de silicona rellena-PBS, usando pasadores minutien de acero inoxidable. Con unas pinzas finas, CArefully abrir el pecho y cortar los grandes vasos, anterior al corazón. Luego de llegar detrás del corazón con las pinzas, agarre detrás de los vasos del corazón y tirar suavemente para quitar el corazón; los pulmones también pueden venir lejos al mismo tiempo. </li><li> Transferir el corazón a un nuevo máximo 35 mm placa de Petri que contiene PBS y el uso de unas pinzas finas para recortar el tejido pulmonar, si es necesario. A continuación, transferir el corazón a un pocillo de una placa de 48 pocillos lleno de PBS frío. </li><li> Después de recoger todos los corazones en la placa de 48 pocillos, aspirar el PBS con una pipeta Pasteur de plástico de punta fina y reemplazar con 0,5 ml de paraformaldehído al 4% (PFA). PRECAUCIÓN: PFA es una alergenicidad conocida, carcinogénico y toxicidad. <ol><li> Fix E11.5 - 12,5 corazones durante 15 minutos, corazones E13.5 durante 20 minutos y E14.5 - 15.5 corazones durante 30 minutos, en PFA al 4% a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Aspirar el PFA con una pipeta Pasteur de plástico de punta fina y enjuagar los corazones 2x en PBS frío. CAUTION: PFA es peligroso y debe eliminarse de acuerdo con las normas institucionales. </li><li> Si no se utiliza inmediatamente para toda la inmunotinción de montaje (véase la sección 2), se deshidratan los corazones mediante la realización de sucesivos lavados de 5 min en las siguientes soluciones: metanol al 25% / 75% de PBS, el 50% de metanol / 50% de PBS, el 75% de metanol / 25 % PBS. PRECAUCIÓN: El metanol es tóxico, use guantes. Almacenar los corazones a -20 ° C en metanol al 100%. </li></ol> 2. Todo el montaje inmunotinción de los corazones embrionarias con anticuerpos anti-PECAM1 NOTA: Los anticuerpos anti-PECAM1 funcionan bien para la tinción de los vasos coronarios (véase el paso 2.4), pero cualquier marcador pan-endotelial que proporciona una señal robusta sería adecuado. <ol><li> Si el uso de los corazones que han sido almacenados en 100% de metanol, transferir a tubos de 1,5 ml de microcentrífuga y rehidratar mediante la realización de sucesivas lavados 5 min en las siguientes soluciones: 75% de metanol / 25% de PBS, 50% de metanol / 50% de PBS y 25% metanol / 75% de PBS. </li&gt; <li> Permeabilizar los corazones mediante la realización de 3 x 10 min lavados en 0,5 a 1,0 ml de PBST (PBS / 0,1% Tween-20), que gira a la temperatura ambiente. </li><li> Bloquear los corazones mediante la rotación durante 1 hora a temperatura ambiente en 1,0 ml 10% de suero de cabra en PBST. </li><li> Eliminar el tampón de bloqueo con un plástico pipeta Pasteur de punta fina o la punta de la pipeta 1.000 l y reemplazar con 400 - 500 l nuevo bloque que contiene el anticuerpo primario anti-PECAM1 diluido 1:50. Rotar los tubos durante la noche a 4 ° C. </li><li> Al día siguiente, aspirar el anticuerpo bloque / primaria con una pipeta Pasteur de plástico de punta fina o la punta de la pipeta 1.000 l y llevar a cabo al menos 6 x 1 hr lavados en 1,0 ml de PBST, la rotación de los tubos a temperatura ambiente. </li><li> Reemplazar el último lavado con tampón de bloqueo fresco que contenía el anticuerpo secundario fluoróforo conjugado diluido 1: 500, y se incuba durante la noche a 4 ° C, con la rotación. Proteger de la luz envolviendo los tubos en papel de aluminio. </li><li> Al día siguiente, aspirar el bloque / seganticuerpo secun- con una pipeta Pasteur de plástico de punta fina y llevar a cabo al menos 6 x 1 hr lavados en 1,0 ml de PBST, la rotación de los tubos a temperatura ambiente. </li><li> Almacenar los corazones a 4 ° C (protegido de la luz) hasta que se necesite. </li></ol> 3. Preparación de las soluciones de compensación y platos Microscopía NOTA: Cuando la formación de imágenes en corazones Babb es vital que ninguno de la solución Babb entra en contacto con los componentes del microscopio. Para ello, el siguiente protocolo contiene instrucciones para la preparación de platos de elastómero de sellado de silicona adecuados para microscopía de fluorescencia, que se pueden preparar con mucha antelación. El elastómero de silicona proporciona una barrera para contener el Babb y evitar que potencialmente se filtre entre la parte inferior y los lados de vidrio de policarbonato del plato. <ol><li> Para preparar los platos impregnados de elastómero de silicona, tomar placas de cultivo con fondo de vidrio óptico y colocar una tapa de un vial de 4 ml tornillo superior (aproximadamente 1,5 cm de diámetro) En el centro de cada plato. Nota: Esto formar un pozo para la muestra cuando el elastómero se aplica al plato. </li><li> Llenar los platos con elastómero de silicona hasta una profundidad de aproximadamente 0,5 cm, usando un cartucho aplicador para mezclar los dos componentes ya que se aplican, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Deje secar durante al menos 24 horas, asegurándose de que la tapa del frasco permanece en el centro de cada plato. NOTA: Utilice gafas de seguridad para evitar el contacto accidental del elastómero de silicona con los ojos. </li><li> Después de curar el elastómero, quitar el tapón del vial de cada plato, Esto dejará un pozo central, donde la muestra para formar una imagen puede ser colocado en contacto directo con el fondo de cristal del plato. NOTA: una vez curado el elastómero debe ser firme y seco al tacto. </li><li> Preparar la solución de Babb (alcohol bencílico 1 parte por 2 partes de benzoato de bencilo). Esto se debe almacenar en una botella de vidrio y protegido de la luz. PRECAUCIÓN: BABB es una solución tóxico, corrosivo. Manipular de una campana de humos, mientras que el uso de ropa protectora adecuada. </li><li> Mix Babb y metanol para hacer una solución 50:50 (1 - 5 ml) en un vial de vidrio. Proteger de la luz, por ejemplo, envolviendo el vial en papel de aluminio. </li></ol> 4. La deshidratación, Compensación y montaje de los corazones por microscopía confocal NOTA: Larger muestras se pueden borrar en 4 viales de vidrio ml, sin embargo, para muestras pequeñas (por ejemplo, corazones hasta E13.5) es mejor para llevar a cabo el proceso de compensación directamente en el plato de la microscopía. Esto ayuda a evitar &quot;perder&quot; las muestras como los corazones se vuelven muy transparente, una vez aclarado. Por estas pequeñas muestras de compensación es muy rápida, que se producen a los pocos minutos. NOTA: Proteja las muestras de la luz durante todos los pasos siguientes de envolver / cubrir tubos y las placas con papel de aluminio. <ol><li> Antes de borrar, deshidratar los corazones inmuno-a través de una serie de metanol mediante la rotación de los corazones en la sala de temperatura en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en cambios sucesivos de las siguientes soluciones: 25% de metanol / 75% de PBS, 50% de metanol / 50% de PBS y 75% de metanol / 25% de PBS (5 min en cada uno). Finalmente, gire durante 3 x 5 min en metanol al 100%. </li><li> Para los corazones hasta E13.5, lugar en el centro del plato de microscopía; bajo el microscopio asegurar el corazón está orientada con su lado dorsal superior. Eliminar cualquier metanol de todo el corazón con una pipeta de plástico Pasteur de punta fina. </li><li> El uso de un plástico Pasteur pipeta limpia de punta fina, añadir de Babb: metanol 50:50 solución en un volumen suficiente para sumergir el corazón (aproximadamente 300 a 400 l). Como el corazón a veces puede dar la vuelta otra vez en la solución, compruebe la orientación de nuevo, mientras que los corazones están siendo opaca. Deja en la solución durante 5 min. </li><li> Eliminar la solución de 50:50 a una botella de residuos de vidrio en la campana de humos y reemplazar con Babb, otra vez usando una pipeta de plástico Pasteur de punta fina. NOTA: No se requiere un gran volumen; añadir sufciente para que el corazón se encuentra dentro de una gota de solución. El corazón debe desaparecer dentro de 5 minutos. </li><li> Para los corazones más grandes, desactive las muestras en viales de vidrio. NOTA: Un corazón E15.5 debe desaparecer dentro de 30 min-1 hr, pero puede calentarse durante la noche si es necesario. </li><li> Después de que la muestra es clara, se retira la solución y reemplazar con un volumen mínimo de Babb. Opcionalmente, cubrir la muestra con una hoja de cubierta, para ayudar a mantenerlo en su lugar, sin embargo, esto no es absolutamente necesario. Utilice el corazón para la imagen. </li></ol> 5. Borrado de imagen Corazones por microscopía confocal NOTA: Las imágenes fueron capturadas en un microscopio confocal invertido usando 10X o 20X objetivos secos. Aunque es posible utilizar los platos en un confocal en posición vertical, un cuidado especial se debe tomar para evitar el contacto del objetivo con la solución de Babb. <ol><li> Se recoge una z-scan del corazón 15. Dependiendo del tamaño del corazón, una exploración azulejo puede ser requerido para imagen todo el corazón 16. <br/&gt; PRECAUCIÓN: Babb es una solución corrosiva, use guantes limpios y asegurar la parte exterior del plato de microscopía es libre de Babb. Manejar el plato con cuidado y mantener la tapa sobre el plato para minimizar el riesgo de derrame accidental sobre el microscopio. </li><li> Si la distancia de trabajo objetivo permite, use un aumento mayor para lograr imágenes de alta resolución de las regiones de interés. </li></ol> 6. Análisis de Datos El uso de Fiji Software <ol><li> Abra la pila z de imágenes en Fiji 17. </li><li> Para realizar la proyección z de toda la pila o parte de ella, haga clic en la imagen y seleccionar la pila, seguido por el proyecto Z. Introduzca el inicio y detención de números de sector, y seleccione el tipo de proyección z, por ejemplo, intensidad media, la intensidad máx. </li><li> Para resaltar los vasos individuales dentro de una pila de cortes de imagen utilizan la herramienta de Blow (en el menú de selección de plugins de segmentación, y luego Blow / herramienta Lazo) y hacer clic en las áreas de la imagen para ser llenado en earebanada ch. Utilice el comando Fill (haga clic en Editar, a continuación, seleccione Fill) para rellenar las zonas seleccionadas con el color de primer plano de elección (haga clic en Editar, a continuación, seleccione Opciones, seguido de Colores y primer plano). </li><li> proyecto de Z la imagen de pila como antes. </li></ol> 7. Representación 3D de la superficie del volumen de las arterias coronarias generada usando Imaris <ol><li> Haga clic en el icono Superar la vista en la parte superior de la pantalla y arrastrar y soltar el archivo de imagen en la ventana de datos. Haga clic en el icono de Vista 3D en la parte superior de la pantalla. </li><li> Seleccione el icono de superficies (icono azul) y, a continuación, haga clic en la pestaña Crear. Haga clic en el cuadro de diálogo &#39;Skip creación automática, edite manualmente &quot;y haga clic en el icono Dibujar (icono de lápiz fino). </li><li> Seleccione la pestaña de contorno, y luego en la ficha Modo. En el modo, haga clic en la varita mágica o iconos de isolíneas. Elija el modo de puntero en la selección del puntero en la parte derecha de la pantalla haciendo clic junto a &quot;Seleccionar&quot;, y luego haga clic en el &#39;Draw9; cuadro (en la esquina inferior izquierda de la pantalla). </li><li> Utilice la isolínea o herramienta Varita mágica para seleccionar los contornos de las arterias en rebanadas sucesivas. Desplazarse de una rebanada de cortar con el control deslizante Posición de la rebanada. </li><li> Cuando todos los contornos se han seleccionado, haga clic en el cuadro Crear superficie. El volumen que rodea puede hacerse invisible, o se hace más o menos opaco usando el Modo de mezcla; haga clic en el volumen para resaltarlo y luego seleccione la ficha Configuración, seguido de la ficha Modo. Seleccione Mezcla y utilizar el control deslizante para cambiar la opacidad. </li><li> Capturar imágenes utilizando la función de instantáneas. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

vasos coronarios en los corazones de embriones enteros fueron imágenes por inmunotinción wholemount con anticuerpo anti-PECAM1 seguido por el aclaramiento óptica y microscopía confocal. El método directo descrito aquí, para la liquidación de los corazones de embriones de ratón con Babb, aumenta la penetración óptica y permite la captura de imágenes de alta resolución de los vasos sanguíneos localizados en las paredes de la aorta y ventriculares. Basado en glicerol de reactivos de montaje tales como Vectashield (índice de refracción 1,45) también se han utilizado para obtener imágenes de la vasculatura coronaria 22 sin embargo, el más alto índice de refracción de Babb (1,56) reduce la dispersión de luz aún más, lo que permite la penetración del tejido más profundo. aclaramiento del tejido evita la necesidad de formas más complejas y costosas de la microscopía como multifotónica y microscopía de lámina de luz que puede ser menos fácilmente disponibles para los investigadores. El proceso de compensación es extremadamente rápida en comparación con otros métodos y 6-9 para muestras pequeñas pueden ser carried a cabo usando pequeños volúmenes de reactivos directamente en el plato de la microscopía. se requiere tinción robusta de la vasculatura con el fin de lograr imágenes de alta calidad; anticuerpo anti-PECAM1 se seleccionó ya que marca todos los tipos de ECs coronaria y un número de anticuerpos comerciales fueron encontrados para dar adecuadamente altos niveles de tinción. Además, la tinción fluorescente parece ser extremadamente estable en Babb; las muestras almacenadas a temperatura ambiente en Babb (protegido de la luz) conservaron su señal fluorescente durante varios meses. El hecho de que el anticuerpo PECAM1 etiquetas de manera eficiente el endocardio coronaria, así como la vasculatura ocasionalmente fue problemático, especialmente cuando la captura de imágenes del plexo peritruncal. Más fuerte tinción de la luz aórtica en comparación con el peritruncal ECs dio como resultado un riesgo de sobre-saturación en algunas zonas de las imágenes, lo que significa que se requiere un ajuste cuidadoso de los parámetros de imagen. Idealmente, una tinción de anticuerpos solamente vascular ECs sería utilizado; en la práctica,Sin embargo, la búsqueda de anticuerpos adecuados que producen el nivel requerido de tinción wholemount puede ser difícil. Recientemente, la proteína de unión de ácidos grasos 4 (FABP4) se ha demostrado que es un marcador de la coronaria ECs vascular 23 y por lo tanto puede representar una alternativa a PECAM1. Con el fin de conservar la morfología 3D de las cámaras del corazón y la aorta las muestras no fueron montadas en plano, pero en cambio fueron reflejado en platos con fondo de vidrio. La profundidad de las muestras en ser fotografiado impedía el uso de objetivos de gran aumento, debido a sus cortas distancias de trabajo. Sin embargo imágenes de alta resolución fueron todavía alcanzable usando un objetivo de 10X mediante el aumento de tiempo de permanencia de píxel y utilizando un tamaño de matriz de píxeles de al menos 1024 x 1024 para la captura de imagen. Esto fue suficiente para el análisis de la estructura y distribución de los vasos coronarios, sin embargo análisis más fino de la estructura celular puede requerir de montaje plana de las muestras. La disección de las partes individuales del corazón para el montaje,por ejemplo, paredes del ventrículo, o en la aorta, también puede ser necesario. Alternativamente, puede llevarse a cabo sobre-muestreo de la imagen seguido de deconvolución con el fin de aumentar la resolución y sensibilidad; Sin embargo, esto requiere mucho más tiempo tiempo de análisis y crea extremadamente grandes archivos de imagen que requieren mucha potencia de computación para procesar. Corazones de hasta E15.5 fueron imágenes con éxito utilizando este método, y también es posible analizar la vasculatura de los embriones enteros (hasta al menos E11.5) usando el mismo protocolo. Otros tipos de células, por ejemplo, células de músculo liso también se han reflejado en nuestro laboratorio utilizando esta técnica. Para tejidos más gruesos, por ejemplo, corazones mayores de E15.5, la penetración de anticuerpo puede ser un factor limitante; incubaciones más largas y / o el aumento de detergente pueden ser requeridos. Además, en la recogida de una gran pila de imágenes z intensidad de la señal se puede reducir como los láseres penetran en las porciones más alejadas de tejido; sin embargo, la confconfiguración vecinales se pueden ajustar para aumentar la potencia del láser al aumentar la distancia z. Este método facilita el análisis microscópico confocal de ambas las primeras etapas de la formación de vasos coronarios y el patrón de las arterias coronarias en las etapas de desarrollo posteriores. Toda la información sobre la distribución, la ramificación y la estructura de los vasos sanguíneos puede ser adquirido en un corto período de tiempo, haciendo de esta una herramienta valiosa para el estudio de mutantes genéticos de ratones con defectos específicos en las vías de la angiogénesis.

El establecimiento de una red coronaria funcionamiento es crucial para la función cardíaca y el desarrollo embrionario, y el análisis de ratones mutantes genéticos pueden proporcionar información valiosa sobre las señales moleculares que subyacen a este proceso de desarrollo. La capacidad de visualizar el plexo coronarias embrionarias en su conjunto, en lugar de presentarse en una serie de secciones histológicas, es esencial para facilitar el análisis de los patrones buque en mutantes genéticos, y evita la pérdida potencial de la información que puede ocurrir como resultado de la mecánica el corte de tejido. Vasos destinado a formar arterias y capilares se localizan en lo profundo de las paredes de ambos los ventrículos y la aorta 1-3. Sin embargo, mientras que el marcaje fluorescente de células combinadas con láser microscopía confocal de barrido puede proporcionar imágenes de alta resolución de los vasos venosos superficiales-wholemount marcado / linfáticos 4,5, la profundidad de formación de imágenes está limitado por penetración óptica. -Alta resolución de imagen de la tapaillaries y arterias largo de toda la profundidad del corazón, por tanto, no es posible sin alguna forma de compensación del tejido. Poor penetración óptica es causado por el alto índice de refracción de la múltiple celulares y extracelulares de los tejidos componentes gruesos (por ejemplo, el colágeno y las fibras elásticas). Esto dispersa la luz de imagen, causando distorsión y la disminución de contraste. agentes de aduanas por lo general coincide con el alto índice de refracción de estos tejidos, lo que significa que la luz puede viajar a través de la muestra sin obstáculos y penetrar más profundamente en el tejido. Antes de borrar, los tejidos son generalmente deshidratada ya que el agua tiene un índice de refracción relativamente bajo. Una plétora de nuevos métodos de compensación se han desarrollado recientemente, sin embargo dependiendo de la técnica utilizada, el proceso de compensación puede tomar días o semanas y puede requerir reactivos costosos 6-9. Babb (una mezcla 1: 2 de alcohol bencílico y benzoato de bencilo) es un agente de eliminación de bajo costo, de uso común, que tiene laventaja de preparar las muestras de forma extremadamente rápida. Técnicas de compensación y de formación de imágenes a base de Babb se han descrito anteriormente para las muestras neurológicas y diversos órganos 10-13. Aquí se describe una técnica robusta y sencilla para el despacho de las muestras Babb inmuno seguido por microscopía confocal, con referencia específica al examen de los vasos sanguíneos en los corazones murinos de E (día embrionario) 11.5 - 15.5. Sin embargo, como también se ha demostrado, la técnica puede igualmente bien aplicarse a análisis de embriones enteros, así como otros tipos de células, siempre y anticuerpos como de alta calidad a los marcadores de interés están disponibles.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Pinza</td><td>FST</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 10 cm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Placas de Petri</td><td>Sigma</td><td>P5112</td><td></td></tr><tr><td>Pines de acero inoxidable de 0,2 mm de diámetro</td><td>FST</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Pastas de punta fina&nbsp;</td><td>Alpha Laboratories</td><td>LW4061</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de 1.000 ml</td><td>Sorenson</td><td>34000</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 48 pocillos</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Gard</td><td>World Precision Instrument</td><td>KWIKGARD</td><td>Elastómero de silicona Sylgard184 empaquetado en un cartucho para mezclar y dispensar</td></tr><tr><td>Kwik-Gard recambio</td><td>World Precision Instrument</td><td>KWIKGLUE</td><td>Recambio cartuchos y puntas dosificadoras</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Envasar en PBS y almacenar a -20 & grados; C</td></tr><tr><td>100% metanol</td><td>VWR</td><td>20847307</td><td></td></tr><tr><td>Tween&reg; 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-PECAM1, rata anti-ratón</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>Anticuerpo primario, diluido 1 en 50</td></tr><tr><td>Anti-CD31 policlonal, policlonal de conejo</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>Anticuerpo primario, diluido 1 en 50</td></tr><tr><td>Clon anti-CD31/PECAM1 2H8, hámster armenio monoclonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA3105</td><td>Anticuerpo primario, diluido 1 en 400</td></tr><tr><td>Anticuerpo de endomucina (V.7C7), monoclonal de rata</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-65495</td><td>Anticuerpo primario, diluido 1 en 50</td></tr><tr><td>Anticuerpo alfa anti-SM22, policlonal de conejo</td><td>Abcam</td><td>ab14106</td><td>Anticuerpo primario, diluido 1 en 250</td></tr><tr><td>IgG (H+L) anti-rata de cabra Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11007</td><td>Anticuerpo secundario, diluido 1 en 500</td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo IgG (H+L)Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Anticuerpo secundario, diluido 1 en 500</td></tr><tr><td>Cabra anti-Hámster Armenio IgG (H+L)Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab173003</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-rata IgG (H+L)Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21208</td><td>Anticuerpo secundario, diluido 1 en 500</td></tr><tr><td>Tapón de rosca fenólico</td><td>Wheaton</td><td>240408</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol bencílico</td><td>Sigma</td><td>402834</td><td></td></tr><tr><td>Benzoato de bencilo</td><td>Sigma</td><td>B6630</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane Imaging</td><td>software</td><td></td>de análisis de imágenes</tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td>Freeware</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de los vasos coronarios en los corazones embrionarias aclarados

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

La visualización del plexo coronario embrionario a partir del cual se formarán las redes capilar y arterial se vuelve problemática utilizando técnicas de microscopía estándar, debido a la dispersión de la luz de imagen por el grueso tejido cardíaco, ya que estos vasos se localizan profundamente dentro de las paredes del corazón en desarrollo. Dado que se ha demostrado que la limpieza óptica de tejidos con disolventes orgánicos como el BABB (1 parte de alcohol bencílico por 2 partes de benzoato de bencilo) mejora en gran medida la profundidad de penetración óptica que se puede lograr, combinamos la eliminación de corazones enteros inmunoteñidos con PECAM1 con microscopía confocal de barrido láser, para obtener imágenes de alta resolución de los vasos de todo el corazón. La eliminación de BABB de los corazones embrionarios se lleva a cabo rápidamente y también actúa para preservar la señal fluorescente durante varias semanas; Además, las muestras se pueden fotografiar varias veces sin pérdida de señal. Este sencillo método también es aplicable a la obtención de imágenes de otros tipos de vasos sanguíneos en embriones enteros.

A medida que se desarrolla el corazón, el miocardio ventricular es invadido por las células endoteliales (ECS) de varias fuentes, y se forma un plexo vascular. Los buques que se desarrollan dentro del miocardio ventricular pasarán a formar las redes capilares arteriales y la entrega de sangre oxigenada a los tejidos del corazón 18. Al mismo tiempo (alrededor de E11.5) la coronaria tallos comenzar a desarrollar independientemente de una red capilar separado (conocido como el plexo peritruncal) que rodea el lumen de la aorta 14,19,20. Plexo Peritruncal ECs inicialmente formar múltiples conexiones con el lumen de la aorta a nivel de los senos de la válvula, sin embargo, en última instancia un único recipiente persistirá en cada lado de la aorta, de pasar a formar las raíces de las arterias coronarias izquierda y derecha 21. Desde alrededor de E13.5 la peritruncal y ventriculares vasos miocárdicos se unen para formar una red interconectada, permitiendo el flujo de sangre de la unaorta en los vasos coronarios 14,22. La tinción de ECs con anti-PECAM-1 anticuerpo, en combinación con el aclaramiento de Babb de los corazones intactos, permite el análisis de las redes coronarias en desarrollo desde las etapas más tempranas posibles. En etapas posteriores del desarrollo del patrón de las arterias coronarias de maduración también puede ser examinado. Este método también se puede utilizar para teñir la vasculatura de los embriones enteros (hasta E11.5 por lo menos), y con diferentes anticuerpos, por ejemplo, anti-alfa actina de músculo liso (Sm22α) y Endomucin. La Figura 1 muestra la concentración máxima intensidad z proyecciones de un corazón E11.5 generado utilizando el software de Fiji. La función del azulejo se utilizó para recopilar varias imágenes parciales del corazón y combinarlas para formar una imagen completa; esto es útil para dar una visión general de la tinción en todo el espécimen. En este anticuerpo etapa PECAM1 manchas principalmente el revestimiento del endocardio del corazón y flujo de salida vessels, sin embargo unos pocos ECs puede también observarse en la pared ventricular izquierda (región en caja en la Figura 1A, se muestra ampliada en 1A &#39;). Además, el plexo peritruncal se pueden observar claramente en la pared del tracto de salida (OT) (región en caja en la Figura 1B). En este último caso, reduciendo el número de cortes en la z-pila utilizado para generar la proyección mejoró la claridad de la imagen, lo que permite las conexiones con el lumen de la aorta para ser visualizado más claramente (Figura 1B &#39;). En la Figura 2, el aumento de la vasculatura proximal a la aorta se puede observar en un corazón E12.5. Figura 3 muestra el plexo peritruncal en un corazón E12.5. El z proyección 12 cortes en la Figura 3A muestra todo el plexo, sin embargo, como algunos vasos están localizados ventralmente a la luz de la aorta (que también está fuertemente manchado por anti-PECAM1 anticuerpo), la división de la pila Z into una serie de sub-pilas (Figura 3B-D) proporciona más información visual. Por ejemplo, la sub-pila proyectada en la Figura 3B muestra un recipiente peritruncal de conexión a la superficie ventral de la luz aórtica, que no es visible en la proyección completa. La Figura 4 muestra parte de un corazón E15.5; las arterias coronarias son claramente visibles en esta etapa (Figura 4A, la proyección 30-slice). En las proyecciones z 5-rebanada que se muestran en las figuras 4B y C de las válvulas aórtica y pulmonar también se pueden visualizar por tinción PECAM1; las ramas y las interconexiones de la red capilar coronaria son también más clara en estas proyecciones subpila más pequeños. Manual de técnicas de segmentación se han utilizado para resaltar las arterias coronarias mediante Fiji (Figura 4D) o Imaris (Figura 4D y E). La representación de volumen 3D de la superficie de las arterias coronarias / luz de la aorta u generanSing Imaris se puede ver con o sin la vasculatura circundante (Figura 4E y F). La vasculatura de los embriones enteros también puede ser examinada usando tinción PECAM1 despacho / Babb. La figura 4A y A &#39;, muestran proyecciones z generados a partir de sub-pilas desde el lado derecho (z rebanadas 11 - 65) y lado izquierdo (z rebanadas 66-110) del embrión respectivamente. La comparación de las dos imágenes muestra que la intensidad de la señal fluorescente no disminuyó significativamente con la penetración más profunda en el tejido. En la figura 4B, PECAM1 (señal roja) y Endomucin (señal verde) se combinaron anticuerpos para etiquetar las arterias intersomitic (NIA) y venas, respectivamente, de un embrión E11.5. La figura 4C muestra SM22α (señal roja) y la tinción PECAM1 (señal verde) de las NIA en un embrión E11.5. En la Figura 6, los embriones E11.5manchado con PECAM 1 se obtuvieron imágenes inmediatamente después del despacho Babb (Figura 4A), o después de un intervalo de aproximadamente dos meses (Figura 4B). La señal fluorescente era todavía lo suficientemente fuerte a la imagen con éxito después de un almacenamiento prolongado de la muestra en Babb. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig1.jpg" /> Figura 1. La inmunotinción de un corazón E11.5 con Anti-PECAM1 de anticuerpos (detectado con anti-IgG de rata conjugado con Alexa 594). (A, B) de una imagen de 2 x 2 de baldosas se recogió utilizando el objetivo 10X de un microscopio confocal invertido. manchas de anticuerpos PECAM1 tanto endocárdicos y ECS vascular. Las proyecciones (máxima intensidad) se generaron a partir 22 (A) o 5 (B) Z rodajas de cada uno de 4 espesor m, utilizando el software de Fiji. A &#39;y B&#39; son Enlargemenct de las áreas enmarcadas en A y B, respectivamente. Las flechas en A &#39;indican vasos sanguíneos de la pared del ventrículo; en B &#39;, el soporte indica el plexo peritruncal. OT, tracto de salida; VI, del ventrículo izquierdo, ventrículo derecho RV. Todas las imágenes son vistas frontales. Las barras de escala en A y B = 200 micras; barras de escala en A &#39;y B&#39; = 100 micras. Grupo 1B &#39;fue adaptado de Ivins y col., 2015 19. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig2.jpg" /> Figura 2. La inmunotinción de un corazón E12.5 con Anti-PECAM1 de anticuerpos. El panel A muestra la proyección z (intensidad máxima) de una exploración 2x2 baldosas. La región en caja en A se muestra enlarged en A &#39;; flechas indican múltiples vasos sanguíneos proximal a la aorta (Ao). VI, del ventrículo izquierdo, ventrículo derecho RV. Todas las imágenes son vistas frontales. La barra de escala en A = 200 micras; barra de escala en A &#39;= 100 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig3.jpg" /> Figura 3. Imagen de la Peritruncal Plexus en un corazón E12.5. Las imágenes confocales de una aorta E12.5 (Ao) se tiñeron con anticuerpo anti-PECAM1 se recogieron utilizando el objetivo 10X. La proyección z (intensidad máxima) en A se genera a partir de 12 rebanadas z (4 micras de espesor); las flechas indican los vasos del plexo peritruncal. El BD 12 rebanadas z fueron divididos en tres sub-pilas como se indica y se utiliza para generar projecti separadacomplementos; puntas de flecha indican las conexiones formadas por el plexo peritruncal a la luz de la aorta. Vasos Peritruncal localizadas ventralmente a la luz de la aorta son visibles en B y C. Todas las imágenes son vistas frontales. Barra de escala = 50 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig4.jpg" /> Figura 4. Arterias Coronarias y los capilares del plexo en un corazón E15.5. Confocal de imágenes de un corazón E15.5 teñidas con anticuerpo anti-PECAM1 fueron obtenidos mediante el objetivo de 10X. El panel A muestra una proyección de máxima intensidad z generada a partir de 30 rebanadas z (4 micras de espesor); flechas indican las arterias coronarias izquierda y derecha (LCA y RCA) que se pueden ver la conexión con la aorta (Ao). El uso de difet 5 z rebanada sub-apila las válvulas aórtica y pulmonar (AOV y PV) pueden verse en B y C, respectivamente (soportes azules). El plexo capilar ventricular es también clara en estas proyecciones subpila más pequeños; vasos sanguíneos proximal a la válvula pulmonar (caja pequeña) se muestran ampliada en la parte inferior derecha del panel C (caja grande). Fiji se utiliza para resaltar los vasos sanguíneos individuales, por ejemplo, para el panel D del / herramienta Lazo golpe fue usado para llenar las arterias coronarias con el rojo manualmente en cada rebanada z antes de la proyección. Imaris de software se utiliza para crear imágenes en 3D de las arterias (rojo) y luz de la aorta (verde) en E y F; de nuevo esto se hacía manualmente, utilizando la herramienta varita mágica para crear contornos de objetos en cada rebanada z. La opacidad del volumen que rodea puede ser alterado en Modo de mezcla, como en E. Alternativamente, la imagen en 3D puede ser extraído, como se muestra en F </strong&gt;. LV: ventrículo izquierdo. Todas las imágenes son vistas frontales. La barra de escala en A = 100 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54800/54800fig5.jpg" /> Figura 5. Formación de imágenes de Embryonic vasculatura. Los paneles A y mostrar imágenes confocal A &#39;de un embrión de tipo natural E10.5 teñidas con anticuerpo anti-PECAM1, recogidos mediante el objetivo de 10X (exploración de azulejos). Intensidad media proyecciones z se generaron a partir rebanadas z 11-65 (A) y 66 a 110 (A &#39;) de una exploración de rebanada 120 z (4 micras rodajas gruesas), mostrando sólo una ligera pérdida de intensidad de fluorescencia a través del espesor del embrión . El panel B muestra los vasos intersomitic de un embrión E11.5 teñidas con antibod<html> IES contra PECAM1 (señal de rojo de anticuerpo secundario 594 conjugado) y Endomucin (EMCN, señal verde de anticuerpo secundario 488 conjugado), que manchan las arterias intersomitic (flecha) y venas (punta de flecha), respectivamente (proyección de intensidad media z de alicatado escanear). El panel C muestra las arterias intersomitic (NIA) de un embrión de tipo natural E11.5 teñidas con anticuerpos contra PECAM1 (señal verde de anticuerpo secundario conjugado con 488) y SM22α (señal roja del anticuerpo secundario conjugado con 594). Las imágenes confocales se recogieron usando el objetivo seco 20X y se utilizan para generar el máximo proyecciones intensidad z. Todas las imágenes son vistas sagital. Las barras de escala en A y B = 250 micras, barra de escala en C = 100 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> d / 54800 / 54800fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6. Las muestras inmunote~nido despejado en Babb Conservar fluorescente señal durante al menos dos meses. E11.5 embriones se tiñeron con anticuerpos PECAM1 y borran con Babb; embriones del mismo lote fueron imágenes inmediatamente o después de un intervalo de dos meses. El panel A muestra las arterias intersomitic del embrión imagen formada inmediatamente y el panel B muestra el embrión fotografiada dos meses más tarde. Las imágenes confocales se recogieron usando el objetivo seco 10X y se utilizan para generar el máximo proyecciones intensidad z. dAO, aorta dorsal. Las imágenes muestran vistas sagital. Las barras de escala en A y B = 100 m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54800/54800fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Se presenta un protocolo para el análisis de los vasos coronarios en los corazones enteros murinas embrionarias hasta E15.5, utilizando métodos de tinción inmunológicos estándar seguido por la separación óptica y microscopía confocal. Esta técnica permite la visualización de los vasos sanguíneos en todo el corazón sin la necesidad de análisis que consume tiempo de secciones en serie.

Análisis de los vasos coronarios en los corazones embrionarias aclarados

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

El objetivo general de este método de aclarado de tejidos basado en BABB es permitir la obtención de imágenes no invasivas de estructuras marcadas profundas dentro de muestras de interés. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo cardiovascular, como qué células o moléculas contribuyen a la formación normal de las coronarias. Las principales ventajas de esta técnica son que es sencilla de realizar, no requiere reactivos costosos y es rápida en comparación con otros métodos de aclarado de tejidos.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la enfermedad cardíaca coronaria, ya que comprender la formación de vasos sanguíneos puede conducir a estrategias terapéuticas para prevenir la enfermedad o restablecer la función cardíaca normal. En el día del procedimiento, utilice un microscopio de disección y pinzas para abrir cuidadosamente las bolsas corioalantoideas de un ratón preñado sincronizado. Retire el saco vitelino de cada embrión y corte el cordón umbilical.Para extraer el corazón, utilice alfileres de acero inoxidable para fijar cada embrión sobre su espalda en una placa de Petri de 35 milímetros recubierta con elastómero de silicona y llena con PBS. Use pinzas finas para abrir cuidadosamente el tórax y seccionar los vasos grandes adyacentes al corazón. Lleve las pinzas por detrás del corazón, sujete los vasos cardíacos posteriores y tire suavemente para extraer el órgano.Coloque el corazón en una placa de Petri fresca de 35 milímetros que contenga PBS. Utilice pinzas finas para recortar el tejido pulmonar según sea necesario y transfiera el corazón a un pocillo de una placa de 48 pocillos que contenga PBS frío. Cuando se hayan recolectado todos los corazones, use una pipeta Pasteur de plástico con punta fina para reemplazar el PBS en cada pocillo con 0,5 mililitros de paraformaldehído al 4% en una campana extractora.Al finalizar el período de fijación, retire el fijador y lave los corazones dos veces con PBS frío. Para permeabilizar los corazones para la inmunotinción en montaje completo, transfiera las muestras a tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros y lave los tejidos con tres lavados de 10 minutos cada uno en 0,5 a 1 mililitro de PBST, con rotación a temperatura ambiente. Después del tercer lavado, bloquee los corazones durante una hora con rotación a temperatura ambiente en 1 mililitro de suero de cabra al 10 por ciento recién preparado en PBST.Luego, sustituya el suero con 400 a 500 microlitros del anticuerpo primario de interés en tampón bloqueador fresco para una rotación nocturna a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, retire el anticuerpo y lave los corazones con seis enjuagues de una hora cada uno en un mililitro de PBST, con rotación a temperatura ambiente. Después del último lavado, sustituya el PBST por tampón bloqueador fresco, añadiendo el anticuerpo secundario conjugado con el fluoróforo adecuado, e incube durante la noche a cuatro grados Celsius protegido de la luz.Luego, lave los corazones seis veces con PBST tal como se acaba de demostrar. Para preparar las placas recubiertas con elastómero de silicona para microscopía confocal, coloque en una campana extractora una tapa de un vial roscado de cuatro mililitros en el centro de cada placa de cultivo con fondo óptico de vidrio, por cada corazón. A continuación, utilizando gafas de seguridad, llene cada placa con elastómero de silicona hasta una profundidad aproximada de 0,5 centímetros.Utilice un cartucho aplicador para mezclar los dos componentes mientras se aplican según las instrucciones del fabricante. Deje que el compuesto se cure durante al menos 24 horas, asegurándose de que la tapa del vial permanezca en el centro de cada placa. Retire las tapas de las placas una vez que el elastómero haya fraguado.Antes de aclarar los corazones, rote las muestras mediante una serie de metanol diluido en PBS a temperatura ambiente en tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros cubiertos con papel de aluminio durante cinco minutos cada uno. Después de la rotación con metanol al 75 por ciento, sumerja los corazones en metanol al 100 por ciento durante tres rotaciones de cinco minutos cada una. Después de la última rotación de deshidratación, coloque los corazones hasta el día embrionario 13,5 en el centro de cada pozo de elastómero.Orientar las muestras con el lado dorsal hacia arriba bajo el microscopio estereoscópico. Utilizar una pipeta Pasteur de plástico de punta fina para eliminar cualquier metanol alrededor de cada corazón. Luego, en una campana extractora, usar una pipeta nueva para añadir una solución de BABB a metanol en proporción 50 a 50, recién preparada, en un volumen suficiente para sumergir los corazones.Confirme la orientación mientras los corazones aún sean opacos. Es muy importante orientar la muestra según la posición del láser confocal antes de que la clarificación esté completa, para garantizar una buena visualización de los vasos coronarios u otras estructuras de interés. Después de cinco minutos, transfiera la solución a un frasco de vidrio para residuos en la campana extractora y agregue suficiente BABB fresco solo, de modo que las muestras queden sumergidas en una gota de solución.Las muestras deben quedar transparentes dentro de los cinco minutos. Cuando los tejidos estén transparentes, reemplace la solución con un volumen mínimo de BABB. Las muestras ya están listas para ser analizadas mediante imágenes.En el día embrionario 11.5, el anticuerpo PECAM1 tiñe principalmente el revestimiento endocárdico del corazón y de los vasos de salida. Sin embargo, también pueden observarse algunas células endoteliales en la pared del ventrículo izquierdo. Aquí se puede observar el aumento de la vascularización próxima a la aorta en un corazón del día embrionario 12.5.Esta proyección Z de 12 cortes muestra todo el plexo troncal del corazón de un embrión de día 12.5. Sin embargo, como algunos vasos se localizan finalmente en el allumum de la aorta, que está intensamente teñido con PECAM1, dividir la pila Z en varias subpilas proporciona mayor información visual. Estas proyecciones Z de cinco cortes de un corazón de embrión de día 15.5 facilitan la visualización de las válvulas aórtica y pulmonar mediante la tinción con PECAM1.Con las ramificaciones y conexiones interconectadas de la red capilar coronaria observadas más claramente en las proyecciones de subconjuntos más pequeños. El análisis mediante software de imágenes permite la segmentación manual de las muestras para resaltar las arterias coronarias con o sin la vasculatura circundante. La vasculatura de embriones completos también puede examinarse mediante tinción con PECAM1 y aclarado con BABB.Una tinción adicional de embriones de día 11,5 con PECAM1, imagenados inmediatamente después del aclaramiento con BABB o después de aproximadamente dos meses, demuestra que la señal fluorescente es lo suficientemente intensa como para obtener imágenes tras un almacenamiento prolongado en la solución de aclaramiento. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en aproximadamente una semana, desde la disección hasta la captura de la imagen. Mientras tanto, el aclaramiento y el montaje de muestras pequeñas por sí solos pueden completarse en 30 minutos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar, marcar con fluorescencia y aclarar corazones embrionarios con BABB para prepararlos para la obtención de imágenes mediante microscopía confocal. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la imagenología multiphotónica, para responder preguntas adicionales, por ejemplo, relacionadas con la morfología celular durante la formación de vasos coronarios. Esta técnica permitirá a los investigadores en el campo de la biología del desarrollo explorar el desarrollo de vasos sanguíneos en corazones embrionarios de ratón y otros sistemas modelo.Al intentar este procedimiento, es importante recordar tratar las muestras con cuidado para evitar dañar el delicado tejido embrionario. No olvide que trabajar con BABB puede ser extremadamente peligroso. Siempre deben tomarse precauciones como el uso de guantes, una bata de laboratorio y protección ocular mientras se realiza este procedimiento.

analysis-of-coronary-vessels-in-cleared-embryonic-hearts

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este artículo se describe un método para el etiquetado de la piel embrionaria y los vasos sanguíneos del timo.

Un método para etiquetar los Vasos sanguíneos en embriones de ratones

Los estudios de desarrollo en el ratón se ven obstaculizados por la falta de acceso al embrión durante la gestación. Para promover la cultura a largo plazo del corazón embrionario en las últimas etapas de gestación, se desarrolló un protocolo en el que el corazón extirpado se cultiva en un semi-sólido, Matrigel diluido.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de la cultura para el corazón de embriones de ratón

Describimos un protocolo para obtener imágenes volumétricas de células marcadas con proteínas fluorescentes en el interior de corazones embrionarios y postnatales intactos. Utilizando métodos de limpieza de tejidos en combinación con la tinción de montaje completo, se pueden obtener imágenes claras y precisas de células marcadas con proteínas fluorescentes individuales dentro de un corazón embrionario o posnatal.

Borrado de imágenes embrionario y postnatal Corazones en la Resolución de celda única

Este protocolo demuestra un método basado en la fluorescencia para visualizar la vasculatura y para cuantificar su complejidad en Xenopus tropicalis . Los vasos sanguíneos pueden visualizarse minutos después de la inyección de un colorante fluorescente en el corazón de un embrión después de manipulaciones genéticas y / o farmacológicas para estudiar el desarrollo cardiovascular in vivo .

Visualización y análisis cuantitativo de la angiogénesis embrionaria<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Protocolos para el estudio de la aorta murina embrionaria y perinatal mediante análisis clonal de en vivo y asignación de destino, explantes aórticos y aislada del músculo liso células se detallan aquí. Estos diversos enfoques facilitan la investigación de la morfogénesis de la aorta embrionaria y perinatal en el desarrollo normal y la patogénesis en la enfermedad.

Utilizan en Vivo y tejido y célula explante enfoques para el estudio de la morfogénesis y la patogenesia de la Aorta embrionaria y Perinatal

Presentamos los protocolos para examinar el desarrollo del corazón de ratón utilizando microscopía epifluorescente Monte todo en embriones de ratón disecados de ventricular específica MLC-2v-tdTomato reportero knock-en ratones. Este método nos permite visualizar directamente cada etapa de la formación del ventrículo durante el desarrollo del corazón de ratón sin mano de obra intensiva métodos histoquímicos.

Análisis del desarrollo de la cámara cardiaca durante la embriogénesis de ratón usando todo de Monte de epifluorescencia

Los modelos in vitro de angiogénesis coronaria se pueden utilizar para el descubrimiento de los mecanismos celulares y moleculares de la angiogénesis coronaria. Cultivos explantados in vitro de tejidos sinusales venosos y endocardio muestran un crecimiento robusto en respuesta al VEGF-A y muestran un patrón similar de expresión COUP-TFII como in vivo.

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En este protocolo, describimos procedimientos para analizar cualitativa y cuantitativamente fenotipos del desarrollo en ratones asociados con defectos cardíacos congénitos.

Análisis de defectos cardíacos congénitos en embriones de ratón utilizando métodos histológicos cualitativos y cuantitativos

Clásicamente, el endocardio del primordio de la válvula embrionaria de ratón se ha analizado utilizando secciones transversales, coronales o sagitales. Nuestro novedoso enfoque para imágenes bidimensionales en la cara del endocardio en regiones valvulogénicas permite el análisis de polaridad plana y reordenamiento celular del endocardio durante el desarrollo de la válvula.

En Face Preparación del cojín endocárdico para el análisis de morfogénesis plana en embriones de ratón

Este artículo detalla los métodos de diagnóstico de cardiopatía congénita (CHD) murina mediante ecocardiografía fetal, necropsia y captura de imágenes de fluorescencia episcópica (EFIC) mediante microscopía confocal episcópica (ECM) seguida de reconstrucción tridimensional (3D).

Una tubería para caracterizar defectos cardíacos estructurales en el ratón fetal

Este protocolo introduce un método rápido para la obtención de imágenes vasculares tridimensionales cuantitativas de montaje completo mediante microscopía de fluorescencia de lámina de luz. La eficacia del método se demuestra utilizando el sistema de arterias de arco faríngeo del modelo de embrión de pollo, con fuerzas hemodinámicas cuantificadas mediante dinámica de fluidos computacional.

Obtención rápida de imágenes de alta resolución de la vasculatura de animales pequeños para estudios cuantitativos

Aprende el método de aclarado tisular BABB para analizar vasos coronarios en corazones embrionarios de ratón mediante microscopía confocal. Esta técnica permite visualizar estructuras vasculares en profundidad sin seccionar.

Análisis de los vasos coronarios en los corazones embrionarias aclarados

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