Preparación de mezcla de culturas gliales primarios de ratón adulto espinal tejido del cordón

El desarrollo del dolor neuropático implica cambios patológicos de las células gliales de la médula espinal. Se carece de un sistema de cultivo glial fiable derivada de tejido de la médula espinal adulta y diseñado para el estudio de estas células in vitro. Por lo tanto, se muestra aquí cómo establecer cultivos mixtos gliales primarios a partir de tejido de médula espinal de ratón adulto.

El objetivo general de este protocolo es establecer cultivos gliales mixtos primarios de médula espinal de ratón adulto para estudios in vitro. Este método nos proporciona un sistema in vitro para investigar el papel de las células gliales en enfermedades neurológicas que implican cambios patológicos dentro de la médula espinal, como el dolor neuropático y la esclerosis múltiple. La principal ventaja de esta técnica es que los cultivos gliales se preparan a partir de la médula espinal de ratones adultos, proporcionando un sistema que refleja con mayor precisión las condiciones in vivo.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Jennifer Malon, una técnica de mi laboratorio. Trabajando en una campana de cultivo de tejidos, transfiera cuatro médulas espinales de ratón a una placa de Petri de HBSS. Use tijeras y pinzas estériles para cortar cada una de las médula espinal en pedazos pequeños.

Luego, transfiera las piezas a un tubo cónico de 50 milímetros que contiene una mezcla de enzimas de ADN de papaína. Evite transferir HBSS a la mezcla de enzimas, ya que esto puede resultar en una disminución del rendimiento de la enzima. Es crucial que las piezas de tejido estén bien digeridas para obtener una suspensión unicelular.

Sin embargo, la digestión excesiva dará como resultado menos células viables. Cada laboratorio necesita realizar pruebas piloto para determinar el tiempo exacto de digestión en función de lo que funciona mejor para sus células. A continuación, agite suavemente el tubo y luego incube a 37 grados centígrados durante una hora con agitación orbital a 150 rotaciones por minuto.

Después de la incubación, agite el tubo en vórtice y luego triture vigorosamente el tejido con una pipeta de cinco mililitros para promover una mayor disociación. Luego, transfiera la suspensión de la celda a un tubo de 15 mililitros y centrifugue 300 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Durante la centrifugación, a 300 microlitros de solución de inhibidor de la albúmina reconstituida por 2,7 mililitros de ABSS en un tubo estéril y mezclar bien.

A continuación, añada 150 microlitros de solución de ADNasa. Después de la centifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en la solución de inhibidor de la albúmina ovomucoide y ADNasa recién preparada. Pozo de vórtice para romper la célula de pellets.

A continuación, se añaden tres mililitros de solución de inhibidor de la albúmina reconstituida, sin ADNasa, a la suspensión celular. Centrifugar las células a 70 x g durante seis minutos a temperatura ambiente. Después del centrifugado, retire el sobrenadante, que contiene fragmentos de membrana, y conserve el pellet.

Para eliminar la mielina de las células de la médula espinal disociadas, primero agregue ocho mililitros de medio de densidad de gradiente del 20% a temperatura ambiente en el tubo que contiene la célula y el vórtice suavemente. A continuación, centrifuga las células a 800 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente sin que se rompan. Después de la centrifugación, aspire con cuidado la capa superior de residuos, que contiene principalmente mielina y el sobrenadante, dejando el pellet.

Para eliminar cualquier gradiente de densidad restante, lave las células resuspendiendo el pellet con ocho mililitros de cDMEM diluido con HBSS. Centrifugar las células a 400 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y lave las células con cDMEM diluido como antes.

Después de eliminar el sobrenadante, el pellet se puede almacenar en hielo hasta sembrar las células. Una vez que esté listo para la siembra, vuelva a suspender las células en 14 mililitros de cDMEM, suplementado con 2-Mercaptoetanol. Y agregue un mililitro de la suspensión celular a cada pocillo en una placa de 12 pocillos.

Placas de pocillos adicionales que se pueden utilizar para determinar el número promedio de células por pocillo y el contenido microglial del cultivo. Una vez que las células se hayan plateado, incube las células a 35,9 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Cambie el medio el día 1, que es el día después del enchapado.

Algunas células están unidas a la placa de cultivo, pero siguen siendo en su mayoría redondas. También hay muchas celdas flotantes y escombros significativos. Repita el cambio de medio tres o cuatro días después hasta que las células estén listas para el tratamiento entre los días 12 y 14.

Las células gliales mixtas de ratones C57 negros adultos se cultivaron a 37 grados Celsius o 35,9 grados Celsius y se analizaron mediante citometría de flujo. Como puede ver, no hay una diferencia obvia en las poblaciones totales de células a estas temperaturas. Estos gráficos representativos muestran las poblaciones de microglía CD45 positivas para CD11b positivas aisladas del total de poblaciones celulares mostradas anteriormente.

Esta figura demuestra que se puede obtener un mayor contenido microglial cuando las glías mixtas se cultivan a 35,9 grados Celsius, en lugar de 37 grados Celsius. Se prepararon cultivos gliales mixtos de médula espinal adulta a partir de seis ratones negros C67. Se muestran imágenes representativas de las células cultivadas a los días uno, cuatro, ocho y 12.

Las imágenes que muestran el progreso típico de la cultura, así como la importancia de los medios de comunicación, cambian en el primer día después del establecimiento de la cultura. Una vez dominado, la configuración inicial del cultivo de células gliales mixtas puede completarse en unas cuatro horas, si se realiza correctamente. Tras el establecimiento del cultivo de glía mixta, se pueden obtener cultivos agotados y enriquecidos con microglía a partir de esta población mixta inicial.

Sin embargo, el rendimiento de células enriquecidas con microglía será limitado a menos que se utilice un gran número de médula espinal para establecer cultivos. Esta técnica fue diseñada inicialmente para investigar el papel de las células gliales durante el desarrollo del dolor neuropático. Sin embargo, se puede utilizar para estudiar otras enfermedades neurológicas que implican cambios patológicos dentro de la médula espinal adulta.