Un método para extraer pigmentos de calamar Pealeii Doryteuthis

El objetivo general de este procedimiento es describir cómo extraer pigmentos ubicados dentro de los gránulos nanoestructurados de calamares recién disecados, cromatóforos Doryteuthis pealeii. Los cefalópodos son animales marinos complejos que experimentan cambios rápidos y adaptativos en su color dérmico. y cambios adaptativos en su color dérmico.

Sin embargo, todavía se desconoce mucho sobre el funcionamiento de estos sistemas. La principal ventaja de esta técnica es que se dirige específicamente a los gránulos nanoestructurados del órgano cromatóforo. Esto permitirá a los investigadores dilucidar el mecanismo del cambio de color que se origina en la nanoescala.

Además de profundizar en la biología de los cefalópodos, puede servir de base para el diseño de sistemas sintéticos construidos para imitar el rango dinámico del color adaptativo que se muestra en los cefalópodos utilizando nanopartículas pigmentadas preempaquetadas. Generalmente, las personas nuevas en este método luchan porque la recolección de tejido de cromatóforo puro es difícil debido a su proximidad con el tejido circundante. Nuestro método está optimizado para reducir estos contaminantes.

Para comenzar la disección, primero vierta aproximadamente 250 mililitros de agua de mar filtrada en una bandeja de disección. Coloque un espécimen en la sartén y, con unas tijeras rectas de punta fina de acero inoxidable, corte desde la base del manto ventral a lo largo de la cara posterior del animal, terminando en la región de la aleta. Extirpa todos los órganos internos levantándolos suavemente con pinzas de disección y cortando el tejido conectivo con las tijeras.

Deseche los órganos en una bolsa de muestras. Usando clavos en T de disección, sujete el lado de la aleta del manto hacia arriba en la almohadilla de disección. Con pinzas, retire con cuidado la capa opaca de la piel epidérmica, manteniendo intacta la capa de piel que contiene cromatóforos.

Deseche la capa epidérmica en una bolsa de muestras. A continuación, retire la capa de cromatóforo. Corta el tejido cromatóforo en secciones pequeñas de un centímetro por un centímetro.

Coloque las secciones en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, llenando cada tubo hasta la mitad con tejido disecado. Por último, añade 500 microlitros de agua de mar filtrada a los tubos. Para aislar los gránulos de pigmento, primero centrifugar las secciones de tejido del cromatóforo durante cinco minutos a 14.000 x g.

Deseche la capa superior de agua de mar. Agregue 500 microlitros de solución de colagenasa de papaína a las muestras y vórtice durante uno o dos minutos en la configuración más alta. A continuación, sonicar las muestras durante cinco minutos a 40 kHz para disociar las células del tejido circundante.

Centrifugar durante cinco minutos más a 14.000 x g y, a continuación, desechar el sobrenadante. Repita la centrifugación otras dos veces, desechando el sobrenadante cada vez. A continuación, añade la resuspensión en colagenasa.

Use fórceps para quitar manualmente cualquier sección grande de tejido restante que no se haya digerido antes de continuar. La pureza de la solución de gránulos de partida influye en la extracción del pigmento. Por lo tanto, es importante asegurarse de que los materiales del cromatóforo de partida se digieran por completo.

Encontramos que las secciones de tejido de alrededor de un centímetro son óptimas para recolectar la población más pura de gránulos. Prepare el tampón de homogeneización tomando un tubo con tapón de rosca de 150 mililitros y agregando la cantidad adecuada de HEPES, cloruro de magnesio, aspartato de potasio y ditiotreitol. Agregue una mini tableta comercial de inhibidor de proteasa.

Con un cilindro graduado, mida 100 ml de agua desionizada y agréguela al tubo que contiene las sales de homogeneización. Agite el tubo para mezclar hasta que la solución se vuelva clara. Centrifugar las muestras de tejido y luego desechar el sobrenadante.

Agregue 500 microlitros de tampón de homogeneización a cada tubo y haga un vórtice de 2 minutos para mezclar completamente. Sonicar las muestras durante 30 minutos a 40 kHz. Y luego centrífugalos de nuevo.

Después de desechar el sobrenadante, repita la adición de homogeneización, la sonicación y la centrifugación dos o tres veces para garantizar la digestión completa del tejido extracelular. Finalmente, el tubo debe contener un sobrenadante de color amarillo claro y una bolita de color rojo que consta de los gránulos de pigmento aislados. Deseche el sobrenadante.

Primero, prepare el metanol ácido para la extracción en un vaso de vidrio con tapón de rosca agregando 5 ml de metanol y 25 mcL de ácido clorhídrico concentrado. Agite la solución suavemente para mezclar. Deje a un lado un tubo de muestra, este será el tratamiento final de los gránulos reaccionados.

Retire el tampón de homogeneización de un segundo tubo que contenga gránulos. Agregue 500 mcL de la solución ácida de metanol a los tubos restantes y al vórtice durante tres o cuatro minutos. Sonicar las muestras durante 10 minutos a 40 kHz y luego centrifugar durante cinco minutos a 14000 x g.

Con una micropipeta, recoja el sobrenadante en un vial de vidrio con tapa de rosca de un dram. Este es el pigmento y debe aparecer de color rojo oscuro. Repita los pasos de adición, sonicación y centrifugación de metanol ácido cuatro o cinco veces recogiendo el sobrenadante hasta que no se extraiga más color.

El pellet incoloro restante es el pigmento extraído de los gránulos. Para preparar muestras de gránulos para la obtención de imágenes, primero centrifugar tanto la alícuota del gránulo sin reaccionar como los gránulos extraídos con pigmento durante cinco minutos a 14000 x g, desechar el sobrenadante y luego resuspender cada gránulo en 1 ml de etanol al 95%. Con una pipeta de transferencia, coloque 2-3 gotas de cada suspensión de gránulos en un trozo de SEM de aluminio separado.

Coloque las muestras en el desecador para que se sequen durante la noche al vacío. Cubra los trozos con una capa de oro y platino durante 3 minutos para lograr un recubrimiento de 15 nanómetros. Tome imágenes de las muestras con un microscopio electrónico de barrido.

A continuación, utilice un espectrofotómetro para recoger los perfiles de absorbancia de los gránulos no reaccionados, los gránulos extraídos y el pigmento extraído. Tome una medida en blanco para las muestras de gránulos agregando 1 ml de agua desionizada a una cubeta limpia. Deseche la pieza en bruto en un contenedor de residuos.

A continuación, agregue la suspensión que contiene los gránulos de pigmento sin reaccionar a la cubeta. Recoja los espectros de absorción UV vis para la muestra de gránulos. Tome una segunda medida en blanco para el pigmento extraído con 1 ml de metanol ácido y una cubeta limpia.

Finalmente, tome el espectro absorbente UV vis para el pigmento y luego determine la longitud de onda máxima de cada muestra. La microscopía electrónica de barrido reveló que el proceso de extracción del pigmento reduce el diámetro medio de los gránulos. Antes de la extracción, los gránulos tienen un diámetro promedio de 527,3 nm.

Después del procedimiento de metanol ácido, este tamaño disminuye significativamente a alrededor de 202,6 nm. Una reducción que se cree que se debe a la extracción del pigmento. Tras la adición del metanol ácido, el color asociado con los gránulos no reaccionados también se reduce visiblemente.

La confirmación de esta hipótesis se obtuvo mediante espectrofotometría. Este gráfico muestra un perfil de absorbancia amplio para los gránulos preextraídos y un perfil igualmente amplio pero de menor intensidad para los gránulos posextraídos. Por el contrario, el pigmento soluble extraído exhibe un lambda máximo en torno a los 500 nm y un hombro distinto en torno a los 380 nm.

En conjunto, estos datos sugieren la extracción exitosa del color visible de los gránulos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente cuatro horas de principio a fin. Al intentar este procedimiento, es importante recordar extirpar por completo el tejido que contiene plaquetas de proteínas reflectantes que pueden interferir con la extracción y el análisis.

El tejido epidérmico también puede interferir con los pasos de homogeneización y la extracción del pigmento. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos como la cromatografía en capa fina y la espectrometría de masas para purificar aún más los pigmentos y caracterizar su composición. Estos pasos pueden ayudar a dilucidar las contribuciones moleculares a la coloración en los cefalópodos.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave para biólogos, químicos e ingenieros marinos, entre ellas:¿Cuál es la composición de los pigmentos utilizados durante el cambio de color? ¿Y cómo contribuyen a la función y estructura de los gránulos nanoestructurados dentro de los órganos cromatóforos dérmicos? Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer pigmento de calamares recién disecados, cromatóforos doryteuthis pealeii.