Name: La construcción de modelos de elementos finitos para investigar pez cebra mandíbula Biomecánica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 11 s
Description: Aprende a construir modelos de elementos finitos para investigar la biomecánica mandibular en Danio rerio. Este método computacional simula cargas mecánicas y su impacto en el desarrollo esquelético.

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LHB fue financiado por el programa de doctorado de la célula Wellcome Trust dinámico; KAR fue financiado por la subvención del proyecto MRC MR / L002566 / 1 (otorgado a EJR y CLH) y CLH fue financiado por Aruk subvención 19479. También nos gustaría dar las gracias a la instalación de Wolfson Bioimagen para el asesoramiento de imagen.

Todos los pasos dentro del protocolo siguen la Universidad de cuidado de los animales de Bristol y directrices para el bienestar y los del Ministerio del Interior del Reino Unido. 1. La visualización de la anatomía musculoesquelética NOTA: Para visualizar la forma de los elementos esqueléticos, para cuantificar el músculo y para identificar la ubicación exacta de las inserciones musculares, immunostain (sección 1.1) de pescado a la edad apropiada para la miosina esquelética (que revela muscular) y colágeno tipo II (para visualizar cartílago). Alternativamente, visualizar la anatomía musculoesquelético usando líneas indicadoras fluorescentes transgénicos tales como el colágeno COL2A1 reportero a1: mCherry 13,14 para visualizar el cartílago y la miosina lenta cadena pesada smyhc reportero: GFP 15 para visualizar la posición de las inserciones musculares (Sección 1.2). líneas alternativas que marcan el cartílago y músculo podrían funcionar igualmente bien. <ol><li> fluorescente Immunostacaniza <ol><li> Fijar larva en exceso de 4% de paraformaldehído (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 1 hr. Lavar en PBS con 0,1% de Tween 20 (PBT) y deshidratar en 50% de metanol (MeOH) en PBT y 100% de MeOH durante 5 min, respectivamente. Precaución: PFA es tóxico y debe ser manejado de acuerdo con la hoja de seguridad de materiales. NOTA: Larva se puede almacenar en 100% de MeOH hasta que se requiera. </li><li> Rehidratar larva en 50% de MeOH en PBT durante 5 min. Lavar en PBT durante 5 min. </li><li> Permeabilizar la larva en tripsina al 0,25% en PBT en hielo durante 5-6 minutos. Lavar con 4x PBT durante 5 minutos cada uno. </li><li> Bloquear durante 2-3 horas en 5% de suero en PBT. </li><li> Incubar larva en la dilución recomendada de conejo anti-tipo 2 del colágeno y los anticuerpos anti-miosina de ratón en 5% de suero en PBT durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. NOTA: El intervalo de dilución recomendada es normalmente en la hoja de datos de anticuerpos. Elija anticuerpos que se plantean frente a diferentes especies entre sí y que también son difealquilar al tejido. </li><li> Lavar 6x larva durante 15 minutos en PBT. </li><li> Bloquear durante 1-2 horas en 5% de suero en PBT. </li><li> Incubar en anticuerpos secundarios en la oscuridad. Utilice la etiqueta fluorescente anti-ratón (550) y anti-conejo (488) secundaria de anticuerpos a una dilución apropiada en 5% de suero y PBT para el anticuerpo específico. </li><li> Lavar 6 veces durante 10 minutos cada uno en PBT y la imagen en un microscopio confocal de 10 veces, tan pronto como sea posible. </li></ol></li><li> Geometría de imágenes musculoesqueléticos <ol><li> Montar las larvas ventral en un cubreobjetos de agarosa al 0,3-0,5% tibia bajo punto de fusión (LMP) en solución de Danieau 16. NOTA: Los peces transgénicos tendrá que ser sedado en 0,02% MS222 (Tricaína metanosulfonato, pH 7) antes del montaje y durante la exploración. </li><li> Tome una pila de imágenes confocal de la región de interés utilizando la lente objetivo de 10X y el zoom digital de aproximadamente 2,5 veces. Preparar las imágenes del canal verde y rojo usando los 488 nm y 561 nm láseres respectivamente. Imagen con una resolución de píxeles 512 x 512 con un intervalo entre los planos z de 1,3 micras y 3 promedios de línea. La pila resultante comprenderá de aproximadamente 100 rodajas z. </li><li> Exportar los datos como una serie tiff. Proyecciones de máxima de los elementos de músculo y cartílago de una larva de pez cebra 5dpf se muestran en la Figura 1. </li></ol></li></ol> 2. Generación de una superficie 3D <ol style="margin-left: 40px;"><li> Elija un conjunto de datos representativo para cada punto de tiempo a los 3, 4 y 5 dpf (elija después de la visualización de múltiples muestras). </li><li> Abrir pila tiff 3-dimensional y seleccionar todos los canales de software de análisis. Haga clic derecho sobre el canal de cartílago y seleccione filtro de imagen y suavizado: Gauss (Figura 2B). </li><li> En vista de proyecto, haga clic derecho en la imagen filtrada y seleccione &#39;segmentación de la imagen &quot;y luego&quot; editar nueva etiqueta&#39;. Crear una nueva etiqueta para cada material, es decir, el cartílago y jmixto. Seleccione la región del cartílago de la imagen (Figura 2C, la señal de blanco, esquema púrpura) mediante la herramienta varita mágica. Utilice la herramienta de cepillo para eliminar el ruido de los contornos. NOTA: Si se utiliza la herramienta varita mágica, haga clic en &#39;Todos los cortes. </li><li> Seleccione la región de la unión con la herramienta de pincel y asignar a un componente de unión (Figura 2C, contorno azul) </li><li> Lisos múltiples cortes a la vez seleccionando la segmentación en el menú superior y etiquetas lisas. Haga clic derecho sobre la imagen y seleccionar generar superficie para producir una superficie 3D de procesamiento del componente (Figura 2D). </li><li> Haga clic en la superficie y guardar los datos como un archivo hmascii para su importación en el software de mallado. </li></ol> 3. Cálculo de las fuerzas de los músculos para ser utilizado en el modelo FE <ol style="margin-left: 40px;"><li> Contar el número de fibras musculares de imágenes confocal de smyhc: GFP pez cebra transgénico (Figura 1A, punta de flecha, 1C) y medir el diámetroeter de las fibras para calcular su área de sección transversal (2 πr). </li><li> Identificar fuerza adecuada por unidad de área del músculo de la literatura. La fuerza muscular máxima generada por unidad de superficie de los músculos esqueléticos larvas de pez cebra (40 nN / 2 micras) se utilizaron 17. </li><li> Calcular las fuerzas para cada grupo muscular anatómica multiplicando el número de fibras y su área por la fuerza por unidad de área. Véase la Tabla 1. </li></ol> 4. Generación de una malla <ol style="margin-left: 40px;"><li> Importe el modelo 3D generado en la sección 2 (arriba) en un paquete de software capaz de generar una malla de elementos finitos. </li><li> Generar malla A2D del cartílago y superficies de la articulación mediante el uso de la herramienta de plástico de embalar en el menú 2D. Elija un tamaño de elemento apropiado. Nota: Utilice un tamaño de elemento entre 1,5-2,5. Si es necesario, generar un rango de superficie 2D mallas de diferente tamaño para llevar a cabo la optimización de malla 3D (Sección 4.4). </li><li> Llevar a cabo controles de calidad de malla que se encuentran bajo el título «2D&gt; Herramientas&gt; Comprobar elementos&quot; del panel para comprobar si hay elementos duplicados, inserciones y penetraciones en la malla. Fijar los ángulos diedros mediante la ficha de utilidad en el árbol del modelo. </li><li> Generar una malla 3D a partir de las mallas de superficie 2D de diferente tamaño del elemento usando el subpanel 3D&gt; Tetramesh. NOTA: Comparación de los resultados de diferentes tamaños de malla y seleccione el modelo FE con el tamaño de malla menor que converge después de nuevas simulaciones y no comprometa la definición de características. El ejemplo en la figura 3 contiene 1,5 millones de elementos tetraédricos de los cartílagos de la mandíbula inferior y tenía un tamaño de elemento 2D de 2,0. </li><li> Transformar la malla de modo modelo de mandíbula está a escala según pila confocal utilizando la geometría&gt; Distancia subpanel. NOTA: Asegúrese de que el cartílago y los componentes de la junta están conectados en el modelo mediante la exportación de un modelo resultante de la fusión o mediante el uso de lazos. </li></ol> 5. Elementos Finitos ModEL Construcción <ol><li> El uso de software comercial de elementos finitos (FE), crear un modelo de elementos finitos. Usando el músculo 3D y cartílago marcado pilas confocal generados en la sección 1 como una guía, asignar los nodos que corresponden a los puntos de unión de músculos. Crear un vector entre dos nodos que representan el origen y la inserción de cada músculo (Figura 3). </li><li> Crear un colector de carga de tipo &quot;historia&quot; de aplicar una &quot;carga C &#39;para cada músculo. Especificar la magnitud en Newtons (calculados en el paso 3.3) y asignar el vector asociado. La figura 3 muestra los puntos de unión para el aductor mandibular (AM), hioideo transportador (PH) y intermandibularis (IM). NOTA: Para estos músculos de la mandíbula, la máxima fuerza de contracción se distribuye entre el origen y la inserción de manera que se aplica sólo el 50% de cada carga en cada sitio. </li><li> Asignar propiedades del material isotrópico elásticas apropiadas como se determina por la literatura. El módulo de Young para el cartílagoy la interzona en este modelo fueron de 1,1 MPa y 0,25 MPa, respectivamente, y el coeficiente de Poisson fue de 0,25 para ambos 18,19. </li><li> Crear un colector de carga del tipo &#39;límite&#39; para aplicar limitaciones iniciales del modelo. Ir a la ficha Análisis&gt; Restricciones y en el subpanel crear, recoger los nodos en el modelo que desea restringir. Seleccione los grados de libertad (DOF) que limitan el movimiento del modelo a la mejor aproximación de su rango natural de movimiento. NOTA: El modelo de la figura 3 se vio limitada en todos los ejes de movimiento (DOF: 1, 2, 3 representan x, y, z, respectivamente) en el ceratohial para anclarlo en el espacio en un punto medio en el modelo y en el eje y y z en el punto donde la palatoquadrate conecta con el resto del cráneo pez cebra (Figura 3, Tabla 1). El modelo debe ser limitado en los tres DOF ​​en un un nodo menos. </li><li> Crear un &quot;paso Cargar &#39;, para cada tipo de movimiento que desea simulcomió (es decir, apertura, cierre), en el menú de análisis y seleccionar todas las cargas relevantes (hechas en la Sección 5.2) y restricciones (hecho en la Sección 5.4) para simular este movimiento. Seleccione &#39;estático&#39; desde el menú desplegable cuando aparezca. </li><li> modelo de exportación incluyendo la malla, cargas, restricciones y propiedades de los materiales en un formato de archivo apropiado, en este caso el formato &quot;.inp&quot;. </li><li> modelo de carga en el software de análisis de FE. Crear y ejecutar un trabajo para el modelo usando el módulo de empleo. </li><li> Analizar la salida de tensión, deformación, desplazamiento, etc. que se encuentra en la pestaña de resultados y el menú de visualización (Figura 4 y 5). </li></ol> 6. Validación de la mandíbula Deformación / Desplazamiento Distancias <ol><li> Seleccione 3-6 Tg (Col2a1aBAC: mCherry) pez cebra transgénico. </li><li> Ligeramente anestesiar a las larvas con 0,02% MS222 hasta que dejan de responder al tacto, pero sus corazones siguen latiendo. </li><li> Montarlas larvas lateralmente (mientras anestesiado) en cubreobjetos en tibia de agarosa LMP al 1% (preparada en solución de Danieau). </li><li> Retire la agarosa a partir alrededor de la cabeza y la mandíbula con una pinza. </li><li> Enjuague solución fresca de Danieau (sin MS222) sobre la cabeza de la larva para eliminar la anestesia utilizando una pipeta Pasteur hasta que los movimientos normales de la boca se reanudan. </li><li> Utilice el software de captura de películas para tomar de campo brillante vídeos de alta velocidad de movimientos de la boca. Tome películas de alrededor de un minuto de duración en la velocidad de fotogramas más alta, o suficiente para grabar múltiples ciclos de apertura de la mandíbula. </li><li> Seleccione los fotogramas que muestran la mandíbula abierta a su máximo desplazamiento. Medir la distancia entre la punta anterior del cartílago de Meckel y el maxilar superior (punta de la placa etmoidal) en micras. </li><li> Calcular el desplazamiento medio de las larvas de peces múltiple. </li><li> Extraer datos de desplazamiento a partir del modelo. Utilice el desplazamiento promedio calculado en 6.8 para verificar el comportamiento de desplazamiento modelo ( <strong&gt; Figura 4). Si el modelo se desvía de lo esperado, el análisis de sensibilidad mediante la alteración de ejecutar secuencialmente las propiedades del material y cargas musculares. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar. Algunos datos de las Figuras 3-5 se ha reproducido de J.Biomech, 48 (12), Brunt et al., Modelización de elementos finitos predice cambios de forma conjunta y comportamiento de las células debido a la pérdida de la tensión muscular en el desarrollo de la mandíbula, 3112-22. de 2015, con permiso de Elsevier 15.

Modelos de elementos finitos se han utilizado para relacionar las zonas de elementos esqueléticos que están bajo tensión con las que experimenta la formación de hueso 10, así como para mapear las áreas bajo tensión durante la osificación endocondral y la morfogénesis conjunta 8,12,21. Otros estudios también han sido capaces de aplicar los modelos teóricos de crecimiento para replicar los cambios durante el desarrollo conjunto 11,12. Aquí se muestra el protocolo para la construcción de modelos de FE para un sistema relativamente simple, la mandíbula de pez cebra 20. A diferencia de otros métodos de recopilación de imágenes en bruto para los modelos FE, tales como la TC 22, la imagen confocal de líneas transgénicas de pez cebra o inmunotinción permite múltiples tejidos para ser estudiados. Puede, por lo tanto, proporcionar información directa sobre los puntos de unión de músculos en relación con el cartílago. Entre los modelos de vertebrados pez cebra son particularmente susceptibles a la manipulación genética y farmacológica. La generación de modelos de FE para el pez cebracartílago craneofacial ahora se abre la posibilidad de un mayor estudio de la interacción entre la biomecánica y la genética en la morfogénesis conjunta. Hay una serie de pasos críticos para el proceso de creación de un modelo de elementos finitos; la primera es la generación de una representación tridimensional precisa del sistema. Esto requiere formación de imágenes a una resolución lo suficientemente alta como para definir claramente los límites. Tenga en cuenta que incluso con imágenes de alta resolución para hacer una buena superficie uno puede tener que suavizar algunas regiones. Otro paso crítico es la definición de la colocación correcta de la carga y las limitaciones correctos. Un modelo insuficientemente limitada fallará para resolver y la colocación incorrecta de las cargas provocará un movimiento anormal. Algunos de procesamiento de los datos en bruto (Figura 2) es necesario como una superficie generada a partir de los datos en bruto sería difícil de malla (Figura 2B). Filtramos los datos usando un filtro de Gauss (Figura 2C </strong&gt;) y que llevan a cabo algunos de suavizado manual de las curvas para producir un conjunto de contornos limpios que se pueden transformar en una superficie 3D. El exceso de suavizado puede producir una superficie &quot;fundido&quot; que ha perdido muchas de sus características. Elegir el tamaño del elemento correcta es un proceso iterativo como elegir demasiado pequeño un tamaño de elemento demasiado grande crea una malla que es computacionalmente intensivas. Sin embargo, elegir demasiado grande un tamaño de elemento producirá una malla que no recapitular la forma correcta de la estructura. La malla correcta tenía el tamaño más pequeño elemento que capturó la forma correcta de la mandíbula y se reunieron en una solución correcta, verifica por medio del desplazamiento de la mandíbula. También puede ser necesario modificar las propiedades del material o de los cálculos de carga para emular mejor el desplazamiento correcto como diferentes edades y especies tendrán propiedades sustancialmente diferentes. Es importante recordar que siempre hay limitaciones a un modelo hipotético y unassumptions hizo correr modelos FE. Cuando sólo el modelado de uno o un pequeño número de muestras es crítica para asegurar que una muestra representativa se elige ya que es probable que sean pequeñas variaciones entre los individuos. Ya que sólo se incluyeron algunos de los elementos de mandíbula y los músculos, el modelo es una versión simplificada del sistema músculo-esquelético craneofacial pez cebra. Por lo tanto, las restricciones tuvieron que ser posicionado para tener en cuenta cuando los elementos de mordaza modelados conectarían con el resto del cráneo y el modelo fueron limitadas artificialmente en el centro para fijarlo en el &quot;espacio&quot;. Esta restricción artificial no tuvo ningún impacto sobre la interpretación extraída de los modelos como el ceratohial en sí no fue analizado. La inclusión de más de la estructura craneofacial, especialmente otros músculos de la mandíbula de apertura como los sternohyals y su cartílago adjunta 23, podría haber añadido al modelo, pero las limitaciones incluyen la capacidad de los modelos más grandes para funcionar en el software de elementos finitos. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Otra limitación es que no hemos modelado inserción de ligamentos, aunque esto podría lograrse mediante la inserción de los resortes 8. Otra suposición hecha en este caso fue que el modelo se comportaría de forma lineal. Las magnitudes de las tensiones en los modelos eran comparables a los de los modelos publicados y se aplicaron a células in vitro 10,24, con cepas de estar por debajo de 3500 y por encima de -5,000 μɛ aparte de puntos de restricción y de unión de músculos. Por lo tanto, las cepas en las regiones relevantes del modelo se consideraron dentro de un rango aceptable para un modelo lineal. El cartílago no se comporta como un material enteramente lineal y previamente se ha modelado como un material poroelástico, lo que permitió el análisis del comportamiento del fluido en el modelo de 25. La difusión de los puntos de unión de músculos entre un grupo de nodos locales distribuiría los picos de fuerza y ​​representar con mayor precisión la inserción del músculo de ciertos músculos. ent &quot;&gt; El uso de FE permite una evaluación de las deformaciones y tensiones que actúan sobre una estructura. Como una técnica que se utiliza con frecuencia en muchas disciplinas de ciencias biológicas, incluyendo la ortopedia, la paleontología y más recientemente la biología del desarrollo. A continuación se describe cómo construir FE para el pez cebra la mandíbula inferior. en el futuro estos modelos podría extenderse a mirar a toda la mandíbula, que incluye el paladar. técnicas similares se podrían utilizar para modelar la biomecánica de la columna vertebral en el pescado, que hasta la fecha la mayoría han sido estudiados por medios cinemáticos.

Modelización de elementos finitos (FE) es una técnica de ingeniería que computacionalmente puede calcular y asignar la magnitud y la localización de las cepas que actúan sobre una estructura 1. El modelo consta de la estructura 3D, representada por una malla de &quot;elementos finitos&quot;, y el resultado final del análisis se rige por una serie de factores incluyendo la estructura y número de elementos de la malla, la magnitud y la ubicación de la mecánica cargas y las propiedades del material. Propiedades de los materiales describen ciertos aspectos del comportamiento de un material bajo un determinado tipo de carga; el módulo de Young (E) describe la elasticidad del material, mientras que la relación de Poisson describe la disminución proporcional en la anchura de un material a su longitud cuando se estira una muestra. modelado FE se puede utilizar para calcular una variedad de variables tales como el desplazamiento, el estrés, la presión y la tensión que actúa sobre el modelo teniendo en cuenta los datos de entrada único acerca de la estructura &#39;; S forma, ubicación y magnitud de las cargas y de las propiedades de los materiales específicos. Modelado de FE es ampliamente utilizado en la ingeniería 2 y 3 cada vez más para ortopédicos y paleontológicos aplicaciones 4. En el desarrollo se conocen fuerzas biomecánicas para actuar como un estímulo en muchas células para activar respuestas de las células 5-8 y es útil para predecir tanto las posiciones relativas y las magnitudes de los estímulos mecánicos dentro de desarrollo de sistemas de órganos, sin embargo, en la actualidad modelado FE ha sido poco utilizado para el desarrollo de pez cebra. Tanto el cartílago y el hueso se ha demostrado que ser materiales mechanosensitive. Por ejemplo, la compresión in vitro se ha encontrado para activar las vías condrogénicas, mientras que la tensión se ha demostrado que es necesario para la formación de hueso 9. análisis FE (FEA) se ha explotado para modelar cepas que actúa en muestras biológicas, incluyendo las que actúan sobre los elementos esqueléticos durante hueso formación 10. Otras aplicaciones de desarrollo incluyen su uso para predecir la forma de una articulación después de que ha sido expuesto a fuerzas biomecánicas teóricos 11,12 y para mostrar el patrón de las cepas presentes durante polluelo rodilla morfogénesis conjunta 8. Este protocolo está dirigido a compartir la experiencia de la generación de superficies de 3 dimensiones, mallas y modelos de elementos finitos de imágenes confocales con miras a la comprensión de la mecánica de los tejidos en desarrollo. También ponen de manifiesto formas de validar los modelos FE pesar de la captura de información conjunta desplazamiento real en vivo. Mientras que utilizamos la mandíbula de pez cebra como un ejemplo de las mismas técnicas podrían utilizarse en cualquier sistema biológico pequeño para el que la información en 3D sobre la estructura del sistema musculoesquelético se puede obtener mediante formación de imágenes confocal o multifotónica.

<table><tbody><tr><td>Coll2</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>Anticuerpo de colágeno tipo II: tiñe todo el cartílago</td></tr><tr><td>A4.1025 / MF20</td><td>Banco de hibridomas de estudios del desarrollo</td><td>A4.1025</td><td>Anticuerpo de misoína esquelética: marca todo el músculo esquelético&nbsp;</td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Sigma &nbsp;</td><td>A9414-5G</td><td>Para el montaje de pez cebra</td></tr><tr><td>MS222 (3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato )</td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>Para hacer anestésico</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Fisher</td><td>T/3760/48</td><td>permeabilización de muestras</td></tr><tr><td>Dylight 488 Ratón IgG</td><td>Thermofisher</td><td>35502</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Dylight 550 Conejo IgG</td><td>Thermofisher&nbsp;</td><td>84541</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>SP8/SP5 o SPE confocal</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td>Para la imagen&nbsp;</td></tr><tr><td>Software de captura LAS Leica</td><td>Software de imagen</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Aviso (versión 7.0.0)</td>Software de análisis de imágenes 3D <td>FEI Visualization Science Group</td><td></td><td>(Sección 2)</td></tr><tr><td>Hypermesh parte del paquete Hyperworks (versión 10)Software de generación de</td> <td>modelos Altair Engineering</td><td></td><td></td> FE (Sección 4-5)</tr><tr><td>Abaqus (versión 6.14)</td>Software de análisis <td>SIMULIA</td><td></td><td>FE (Sección 5.7-5.8)</td></tr></tbody></table>

la construcción de modelos de elementos finitos para investigar pez cebra mandíbula biomecánica

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

La morfogénesis esquelética ocurre a través de comportamientos celulares estrictamente regulados durante el desarrollo; muchos tipos de células alteran su comportamiento en respuesta a la tensión mecánica. Las articulaciones esqueléticas están sometidas a cargas mecánicas dinámicas. El análisis de elementos finitos (FEA) es un método computacional, utilizado con frecuencia en ingeniería, que puede predecir cómo responderá un material o estructura a la entrada mecánica. Al dividir un sistema completo (en este caso, el esqueleto de la mandíbula del pez cebra) en una malla de "elementos finitos" más pequeños, el FEA se puede utilizar para calcular la respuesta mecánica de la estructura a las cargas externas. Los resultados se pueden visualizar de muchas maneras, incluso como un "mapa de calor" que muestra la posición de las deformaciones principales máxima y mínima (una deformación principal positiva indica tensión, mientras que una negativa indica compresión. El máximo y el mínimo se refieren a la mayor y menor cepa). Estos se pueden utilizar para identificar qué regiones de la mandíbula y, por lo tanto, qué células probablemente estén bajo cargas de tensión o compresión particularmente altas durante el movimiento de la mandíbula y, por lo tanto, se pueden usar para identificar relaciones entre la deformación mecánica y el comportamiento de la célula. Este protocolo describe los pasos para generar modelos de elementos finitos a partir de datos de imágenes confocales en el sistema musculoesquelético, utilizando la mandíbula inferior del pez cebra como ejemplo práctico. El protocolo guía al lector a través de una serie de pasos: 1) tinción de los componentes musculoesqueléticos, 2) obtención de imágenes de los componentes musculoesqueléticos, 3) construcción de una superficie tridimensional (3D), 4) generación de una malla de elementos finitos, 5) resolución del FEA y finalmente 6) validación de los resultados mediante la comparación con los desplazamientos reales observados en los movimientos de la mandíbula del pez.

La inmunotinción para muscular (Figura 1A) y el cartílago (Figura 1B) o formación de imágenes de reporteros transgénicos (Figura 1C) permite que la estructura 3D de la mandíbula para ser visualizada, junto con la musculatura asociada. Por formación de imágenes a alta resolución que era posible construir un modelo que captura tanto la forma tridimensional de la mandíbula (Figura 2) y la ubicación y la colocación de las cargas (Figura 3). La utilización de los desplazamientos in vivo visto a través de la captura de vídeo de alta velocidad (Figura 4) se verificó que el rango de movimiento en el modelo estaba dentro de un rango realista. Los modelos FE Una vez ejecutado se pueden utilizar para mostrar una variedad de datos, como el estrés (Figura 5A), mínimo y máximo de deformaciones principales (Figura 5B - K). Estos resultados son de tres dim<html> ensional lo que el modelo se puede ampliar para ver patrones finos de detalle (Figura 5E, 5I) hace girar para obtener puntos de vista relevantes (Figura 5F, 5G, 5J, 5K) y digital seccionadas (Figura 5E &#39;, 5E&#39; &#39;, 5I&#39;, 5I &#39;&#39;) para mostrar cómo los patrones de tensión, deformación o cambio de presión en todo el modelo. También es posible extraer los datos cuantitativos a partir del modelo (no mostrado). Al verificar el modelo y el uso de las propiedades de los materiales más precisos, cargas y malla forma el modelo FE puede ser utilizado para explorar la mejor estimación del entorno mecánico experimentado por las células durante esa ventana de desarrollo. Los resultados del modelo se pueden comparar directamente con los cambios en el comportamiento celular y la expresión génica 20. <html> re 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Imágenes representativas de los elementos del aparato locomotor de la mandíbula inferior del pez cebra a 5 dpf pilas confocal representativos de la mandíbula inferior de las larvas 5dpf muestra con toda anterior al inicio (A) La inmunotinción para A4.1025 que tiñe toda la miosina esquelética (B) la inmunotinción para el colágeno tipo II que marca todo el cartílago (C) Pila de una larva viva expresión de los reporteros COL2A1 transgénicos: mCherry marcado cartílago (rojo) y smyhc: GFP músculo lento (verde). IA: intermandibularis anterior, PH: transportador hioideo, AM: mandibular aductor, Hawai: hioideo inferior, Hawai: hioideo superior, CH: esternohioideo, MC: cartílago de Meckel, PQ: palatoquadrate, CH:. Ceratohial <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" /> Figura 2: Generación de una superficie 3D a partir de datos confocal de imágenes que muestran la transición de datos confocal en una superficie 3D de la mandíbula inferior del pez cebra con una mayor ampliación de la zona de unión.. (A) los datos sin procesar confocal; (B) del conjunto de datos después de la aplicación de un filtro de Gauss; (C) Esquema filtrada; Superficie (D) en 3D. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" /> Figura 3: mallas representativo que muestra las limitaciones y los vectores de fuerza mallas representativos para una larva 5 dpf para (A) de cierre y la boca.(B) abertura de la boca. Los puntos blancos indican los lugares donde se ve limitada el modelo y en el que las dimensiones (por ejemplo, x e y o x, y y z). Las líneas blancas indican las posiciones de músculos, con el vector de la fuerza muscular indicado por las flechas blancas. Rojo muestra el cartílago y la interzona amarillo. Esta cifra ha sido modificado a partir de material complementario publicado previamente en Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" /> Figura 4:. Pruebas de sensibilidad FE-modelo que simula el desplazamiento de la mandíbula en el pez cebra 5dpf para diferentes cartílago y interzonales módulos de Young. La mandíbula de desplazamiento (abierto a cerrado en micras) está marcado en la mandíbula; grabada utilizando la tecla de color. Cada modelo (A - L) tiene una combinación diferente de cartílago (c = 1,1, 3,1, o 6,1 MPa) o 1 MPa propiedades) interzona (i = de 0,25, 0,5, 0,75, o. Horizontal flecha negro resalta el valor del desplazamiento de la mandíbula en la punta del cartílago de Meckel (representado por la flecha negro vertical). M y N fotogramas de vídeos de 5 dpf larvas que presenten mínimo, es decir, la mandíbula cerrada (M) y el máximo, es decir, la mandíbula completamente abierta (N) con los dos superpuesta (O) - línea blanca en O representa el desplazamiento (de 43 micras). En este caso las propiedades del cartílago relativa de 1,1 con una interzona de 0,25 (A) la mejor partido de los desplazamientos observados en peces vivos (O). Sobre placas de aluminio de esta figura se han publicado previamente en Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para conocer el vers más grandes</a>ión de esta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" /> Figura 5: Los datos representativos de los modelos de simulación FE FE-modelo de todos los músculos aplicados en un 5 dpf larva (A - C).. (A) de Von Mises (EMaxmin) (B) cepa principal mínimo (E Min. P, μɛ) (C) la tensión principal máxima (E máx. P., μɛ). simulación con EF-modelo de cepas máximos y mínimos principales durante la apertura de la mandíbula. (D - K): la tensión principal máxima (. E Max P., μɛ) en (D) Muestra de la mandíbula ventral y (E) vista conjunta ventral (E) muestra la ubicación de las secciones proximal-distal a través del cartílago de Meckel conjunta y la interzona en (e &#39;) y (e&#39; &#39;), respectivamente. (F): lateralla mandíbula vista. (G): vista lateral conjunta. (H - K): la tensión principal mínima (. E Min P, μɛ) en (H) vista ventral y la mandíbula (I) vista conjunta ventral. (I) muestra la ubicación de las secciones proximal-distal a través del cartílago articular de Meckel y en interzona (I &#39;) y (I&#39; &#39;) respectivamente (J): Vista lateral de la mandíbula. (K): vista lateral conjunta. Esta cifra ha sido publicado previamente en Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Número de fibras musculares </td><td> Área de la fibra muscular (m 2) </td><td> área de grupo muscular (micras2) </td><td> Fuerza (N) </td></tr><tr><td> 5 dpf intermandibularis anterior </td><td> 5 </td><td> 23.8 </td><td> 119 </td><td> 4.76e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf transportador hioideo </td><td> 6 </td><td> 23.8 </td><td> 142,8 </td><td> 5.71e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf aductor mandibular </td><td> 9 </td><td> 23.8 </td><td> 214,2 </td><td> 8.57e-6 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: La cuantificación del músculo. Calculado promedio fuerzas musculares para el Intermandibularis anterior, aductor mandibular y prolongador hioideo a 5 dpf utilizando 40 nN / m 2 (valor por unidad de superficie tomado de referencia 17). (Lorga et al., 2011) (n = 3).

El análisis de elementos finitos es una herramienta de uso frecuente para investigar el rendimiento mecánico de estructuras bajo carga. Aquí aplicamos su uso para modelar la biomecánica de la mandíbula del pez cebra.

La construcción de modelos de elementos finitos para investigar pez cebra mandíbula Biomecánica

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

El objetivo general de esta técnica de modelado es simular el entorno mecánico al que están expuestos los maxilares en desarrollo del pez cebra. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del sistema músculo-esquelético, como, ¿cómo cambian los patrones de carga mecánica con el tiempo? Y, ¿cómo estimulan estas cargas el comportamiento celular?La principal ventaja de esta técnica es que nos permite analizar los patrones de expresión génica y los cambios en el comportamiento celular en el contexto del entorno mecánico. Este método puede proporcionar información sobre el desarrollo esquelético. También puede aplicarse a cualquier otra estructura biológica que experimente carga mecánica, como los elementos esqueléticos en vertebrados superiores, o el sistema cardiovascular.Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades, ya que la terminología y el software suponen una formación en ingeniería. Para visualizar la forma de los elementos esqueléticos, cuantificar el músculo e identificar la ubicación exacta de las inserciones musculares, realice una inmunotinción del pez a la edad adecuada para la miosina esquelética y el colágeno tipo II. Primero, fije una larva de pez en paraformaldehído al 4% en PBS durante una hora.A continuación, elimine el fijador mediante dos lavados con PBT. Después, deshidrate la larva en metanol al 50% y PBT durante cinco minutos, seguido de metanol al 100% durante cinco minutos. Las larvas pueden entonces almacenarse en metanol al 100% hasta que sean necesarias.Cuando sea necesario, rehidrate la larva en metanol al 50% y PBT durante cinco minutos. Luego, lávela en PBT durante cinco minutos. Ahora, permeabilice la larva con tripsina al 0,25% en PBT sobre hielo durante cinco a seis minutos.Luego, lávese con PBT durante cinco minutos y repita el lavado con PBT tres veces más. Antes de aplicar los anticuerpos, bloquee la larva durante dos a tres horas en suero al 5 % y PBT. A continuación, incube la larva en la dilución recomendada de anticuerpos de conejo anti-colágeno tipo II y anticuerpos de ratón anti-miosina con suero al 5 % y PBT.Realice esta incubación durante una hora a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius. Después de aplicar los anticuerpos primarios, lave la larva en PBT un total de seis veces durante 15 minutos por lavado. Después de los lavados con PBT, aplique un bloqueo con suero al 5 % en PBT durante una o dos horas.Ahora, aplique los anticuerpos secundarios, conservando desde este momento la preparación en la oscuridad tanto como sea posible. Use anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia anti-ratón y anti-conejo en suero al 5 % y PBT. Después de aplicar los anticuerpos secundarios, lave la larva en PBT seis veces, durante 10 minutos por lavado.Cualquier larva que se tiña como se describe, o que exprese etiquetas fluorescentes, puede ahora ser observada mediante un microscopio confocal como sigue. Adquiera un conjunto de imágenes confocales de la región de interés utilizando el objetivo de 10x con aproximadamente un aumento digital de 2,5x. Excite el canal verde y el rojo usando un láser de 488 nanómetros y un láser de 561 nanómetros.Luego, tome imágenes de 512 píxeles cuadrados utilizando un intervalo de plano z de 1,3 micrómetros con tres promedios de línea. Aproximadamente 100 secciones z llenarán la pila. Exporte los datos como una pila de imágenes TIFF.Abra la pila de imágenes TIFF y visualice todos los canales en el software adecuado. Haga clic con el botón derecho en el canal del cartílago, seleccione corte ortogonal y cree uno. A continuación, haga clic con el botón derecho en el canal del cartílago y seleccione Procesamiento de Imagen, Suavizado y Reducción de Ruido, elija el filtro de imagen y active el suavizado gaussiano.En la vista del proyecto, haga clic con el botón derecho en la imagen filtrada y seleccione segmentación de imagen y luego editar nueva etiqueta. Cree una nueva etiqueta para cada material, como cartílago y articulación. Luego, seleccione la región de cartílago de la imagen utilizando la herramienta de varita mágica con el conmutador de todas las cortes activado, y utilice la herramienta de pincel para eliminar el ruido de los contornos.A continuación, seleccione la región articular con la herramienta de pincel y asígnela al componente articular, repitiendo la acción a lo largo de toda la articulación. Para suavizar varias secciones a la vez, seleccione Segmentación en el menú superior y luego elija Suavizar etiquetas. A continuación, para generar una representación tridimensional de la superficie del componente, haga clic con el botón derecho sobre la imagen y seleccione Generar superficie.Ahora, haga clic en la superficie renderizada y guarde los datos como un archivo HMASCII para el software de mallado. La generación de mallas 3D es un paso crítico para crear un buen modelo. Es necesario encontrar un equilibrio entre una malla que represente la forma real de la estructura que se desea modelar, sin incluir tantos detalles que introduzcan elementos problemáticos, como aquellos con ángulos demasiado pequeños o demasiado grandes.Para generar la malla, importe el modelo 3D en un paquete de software adecuado. Para generar una malla bidimensional de las superficies del cartílago y de la articulación, utilice la herramienta de ajuste envolvente (shrinkwrap) en el menú 2D. Elija un tamaño de elemento entre 1,5 y 2,5.Puede elaborarse una variedad de mallas superficiales de diferentes tamaños para realizar la optimización de mallas 3D. Con el fin de garantizar que la malla sea continua entre las superficies de la articulación y el cartílago, cualquier elemento en el límite debe compartir nodos comunes. Para lograrlo, elimine la superficie interna de la articulación, dejando un tubo hueco.Utilice la tecla de función F2 para acceder al acceso directo al menú Eliminar elementos. Seleccione los elementos que desea eliminar. Ajuste los nodos del límite para que coincidan con la superficie del cartílago.Utilice una combinación de las teclas de función F2, F3 y F6 para eliminar, mover nodos y crear nuevos elementos, respectivamente. Finalmente, duplique la superficie de cartílago en la articulación utilizando el menú organizador de componentes del colector. Utilice la tecla de función F2 para eliminar todos los elementos no articulares.Posteriormente, realice controles de calidad yendo al panel Verificar elementos. Revise la presencia de elementos duplicados, inserciones y penetraciones en la malla. De encontrarlos, edítelos utilizando la pestaña Herramientas.Verifique los ángulos diedros utilizando la pestaña de utilidades que se encuentra en la opción del árbol de modelos. Para generar una malla 3D a partir de mallas superficiales 2D con tamaños de elemento diferentes, utilice la herramienta Tetramesh. Compare diferentes tamaños de malla y seleccione el modelo de EF con el tamaño de malla más pequeño que converja tras simulaciones adicionales y que no comprometa la definición de las características.A continuación, utilizando la herramienta de Distancia, transforme la malla para que el modelo de la mandíbula esté a escala. Asegúrese de que los componentes de cartílago y articulación estén conectados en el modelo mediante la exportación de un modelo combinado o mediante el uso de uniones. A continuación, aplique cargas, restricciones y propiedades de los materiales al modelo de EF para simular la función mandibular.Utilizando las pilas confocales etiquetadas como guía, defina los músculos. Primero, asigne nodos que correspondan a los puntos de inserción muscular. Luego, cree vectores entre los nodos que representen el origen y la inserción de cada músculo.Después de definir todos los músculos, cree un colector de carga de historial y aplique una Cload a cada músculo. Especifique la magnitud en newtons y asigne el vector asociado. Luego, asigne propiedades de material elástico isótropo adecuadas, según lo determinado por la literatura.A continuación, cree un colector de cargas por límite y aplique algunas restricciones iniciales al modelo. Seleccione los nodos a restringir y elija un factor de grados de libertad similar al rango natural de movimiento del músculo definido por esos nodos. Ahora, cree un paso de carga para cada tipo de movimiento que se desea simular.Bajo el menú de análisis, seleccione todas las cargas y restricciones relevantes para simular el movimiento especificado. Luego, seleccione estático en el menú desplegable. Cuando esté listo, exporte el modelo en un formato de archivo adecuado, incluyendo la malla, cargas, restricciones y propiedades del material.En este caso, se elige el formato INP. Luego, cargue el modelo en el software de análisis por elementos finitos. A continuación, cree y ejecute un trabajo para el modelo, y analice la salida para obtener tensiones, deformaciones, desplazamientos y demás.Seleccione de tres a seis larvas de pez cebra transgénicas y anestesie ligeramente las larvas con MS-222 al 0,02 % hasta que dejen de responder al tacto, pero sus corazones sigan latiendo. A continuación, monte las larvas lateralmente sobre cubreobjetos en agarosa al 1 % de punto de fusión bajo tibia en solución de Danieau. Luego, retire cuidadosamente con pinzas el agarosa alrededor de la cabeza y la mandíbula.Luego, utilizando una pipeta de Pasteur, enjuague la cabeza de la larva con solución fresca de Danieau para eliminar el anestésico. Haga esto hasta que se reanuden los movimientos normales de la boca. Ahora, utilice un software de captura de video para tomar videos fluorescentes de alta velocidad de los movimientos de la boca.Grabe con la mayor velocidad de fotogramas durante el tiempo necesario para registrar varios ciclos de apertura de la mandíbula. Posteriormente, analice el desplazamiento máximo de la mandíbula. Elija los fotogramas que muestren la mandíbula más abierta y mida la distancia entre la punta anterior del cartílago de Meckel y la mandíbula superior.El punto del maxilar superior corresponde a la punta de la placa etmoidal. La inmunotinción para músculo y cartílago, o la imagen de reporteros transgénicos, permite visualizar la estructura tridimensional de la mandíbula, junto con la musculatura asociada. Mediante la obtención de imágenes con alta resolución, fue posible construir un modelo que capture la forma tridimensional de la mandíbula.El modelo incorpora cargas cuya colocación y magnitud se derivaron de las imágenes confocales de músculo y cartílago. A partir de este modelo, se probaron una variedad de propiedades materiales diferentes. Utilizando el desplazamiento in vivo observado mediante captura de video de alta velocidad, se seleccionó un modelo que replica mejor ese rango de movimiento.Utilizando las propiedades de los materiales, las cargas y los datos de forma de la malla más precisos, se empleó el modelo de elementos finitos para explorar la mejor estimación del entorno mecánico experimentado durante este período de tiempo. Por ejemplo, se midieron las magnitudes del esfuerzo. El modelo puede ampliarse para observar los detalles finos del patrón y luego examinarse en secciones digitales para observar el detalle en todas las dimensiones.Después de ver este video, tendrá un buen entendimiento de cómo utilizar la imagen confocal para construir un modelo tridimensional fisiológicamente preciso de una estructura biológica sometida a carga mecánica. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que se trata de un modelo lineal y elástico, y que el cartílago no se comporta completamente como un material lineal. Otras propiedades del material, como la permeabilidad, pueden incorporarse, pero podrían requerir modificaciones adicionales en la malla.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

El pez cebra maxilar barbos es un órgano sensorial que contiene tegumentario ectodérmica, mesodérmica y derivados de la cresta neural. Es importante destacar que, el barbo adultos pueden regenerarse después de una amputación proximal. Este video presenta el desarrollo del maxilar barbos y demuestra un protocolo quirúrgico para inducir la regeneración, seguida por la imagen recogida, incorporación y posterior de las muestras barbos.

Métodos para el Estudio de la barbo pez cebra maxilar

Imagen confocal Time-lapse es una técnica de gran alcance útil para caracterizar el desarrollo embrionario. Aquí se describe la metodología y caracterizamos la morfogénesis craneofacial de tipo salvaje, así como PDGFRA, Smad5 y smo embriones mutantes.

Analizando Craneofacial en la morfogénesis de pez cebra Utilizando 4D Microscopía Confocal

El embrión de pez cebra es un excelente modelo para la investigación de la biología del desarrollo. Durante la embriogénesis, el desarrollo de pez cebra con una masa de yema, que presenta retos en tres dimensiones para la observación de muestras y análisis. Este protocolo se describe cómo crear dos dimensiones planas montar preparaciones de todo el montaje in situ (WISH), teñidas muestras de embriones de pez cebra.

Preparativos Piso en observación y análisis de embrión de pez cebra muestras teñidas por todo el montaje<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

El pez cebra es un excelente sistema modelo para estudios genéticos y de desarrollo. La implantación de perlas es una valiosa técnica de manipulación de tejidos que puede utilizarse para interrogar los mecanismos de desarrollo mediante la introducción de alteraciones en los entornos celulares locales. Este protocolo describe cómo realizar la implantación de microperlas en el embrión de pez cebra.

Microbead Implantación en el embrión de pez cebra

El objetivo de este protocolo es modificar la penetrancia de fenotipos mutantes esqueléticos letal en el pez cebra por cría selectiva. Mutantes letales no pueden cultivarse a la edad adulta y crían ellos mismos, por lo tanto este protocolo describe un método de seguimiento y selección de penetración a través de múltiples generaciones por prueba de progenie.

Cambio de penetrancia mutante esquelética letal de pez cebra por prueba de progenie

Aquí, Describimos 3 modelos de lesión del pez cebra adulto y su uso combinado con tratamiento inmunosupresor. Proporcionamos orientación en proyección de imagen de regenerar los tejidos y en la detección de la mineralización ósea en esto.

Pez cebra adulto lesión modelos para estudiar los efectos de la prednisolona en regeneración de tejido óseo

Modificamos el modelo de caída de peso de Marmarou para peces cebra adultos para examinar una amplia gama de patologías después de una lesión cerebral traumática por fuerza contundente (LCT) y los mecanismos subyacentes a la regeneración neuronal posterior. Este modelo de LCT de fuerza contundente es escalable, induce una LCT leve, moderada o grave y recapitula la heterogeneidad de lesiones observada en una LCT humana.

Un modelo escalable para estudiar los efectos de la lesión por fuerza contundente en peces cebra adultos

Este protocolo describe la recolección y visualización de las escamas elasmoides del pez cebra durante la regeneración in vivo . Además, se presenta el cultivo ex vivo de estas escamas hasta 7 días después de la cosecha.

Regeneración de escamas de pez cebra en cultivo de escamas en su totalidad y ex vivo

Este protocolo ofrece un método para estudiar la dinámica celular utilizando una sencilla técnica de cultivo in vitro . Proporciona una oportunidad para que los investigadores y educadores del pez cebra estudien los procesos celulares, como los relacionados con la homeostasis ósea y la biología celular básica, mediante la visualización de núcleos fluorescentes y células apoptóticas dentro de las escamas.

Técnica de cultivo in vitro para el estudio de la dinámica celular en escamas de pez cebra

El protocolo descrito aquí presenta un procedimiento simple y fácil de seguir para teñir y diseccionar cartílagos craneofaciales en una larva de pez cebra de 5 días de edad. Se puede utilizar para estudiar la anatomía, la forma y el tamaño de estas estructuras en diversas condiciones de desarrollo.

Disección de tejidos craneofaciales de pez cebra al teñirlos con azul alcián

Este trabajo describe un protocolo para cuantificar la forma del cartílago craneofacial utilizando software libre (tpsDigs2, MorphoJ y PAST) para medir cambios en la estructura facial en larvas de pez cebra.

Análisis morfométricos de la forma: la caja de herramientas de software de análisis para la cuantificación de formas craneofaciales en peces cebra

Aprende a construir modelos de elementos finitos para investigar la biomecánica mandibular en Danio rerio. Este método computacional simula cargas mecánicas y su impacto en el desarrollo esquelético.

La construcción de modelos de elementos finitos para investigar pez cebra mandíbula Biomecánica

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