La construcción de modelos de elementos finitos para investigar pez cebra mandíbula Biomecánica

El objetivo general de esta técnica de modelado es simular el entorno mecánico experimentado por el desarrollo de mandíbulas de pez cebra. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo musculoesquelético, como por ejemplo, ¿cómo cambian los patrones de carga mecánica con el tiempo? Y, ¿cómo estimulan estas cargas el comportamiento de las células?

La principal ventaja de esta técnica es que nos permite analizar los patrones de expresión génica y los cambios en el comportamiento celular en el contexto del entorno mecánico. Este método puede proporcionar información sobre el desarrollo del esqueleto. También se puede aplicar a cualquier otra estructura biológica que experimente carga mecánica, como los elementos esqueléticos de los vertebrados superiores o el sistema cardiovascular.

Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades, porque la terminología y el software asumen una formación en ingeniería. Para visualizar la forma de los elementos esqueléticos, cuantificar el músculo e identificar la ubicación exacta de las inserciones musculares, inmunotiñe al pez a la edad adecuada para la miosina esquelética y el colágeno tipo II. Primero, fije una larva de pez en paraformaldehído al 4% y PBS durante una hora.

A continuación, lave el fijador con dos lavados de PBT. A continuación, deshidrate la larva en metanol al 50% y PBT durante cinco minutos, seguido de metanol al 100% durante cinco minutos. A continuación, las larvas pueden almacenarse en metanol al 100% hasta que se necesiten.

Cuando sea necesario, rehidrate la larva en metanol al 50% y PBT durante cinco minutos. Luego, lávelo en PBT durante cinco minutos. Ahora, permeabilice la larva con 0,25% de tripsina y PBT en hielo durante cinco o seis minutos.

Luego, lávelo en PBT durante cinco minutos y repita el lavado con PBT tres veces más. Antes de aplicar los anticuerpos, bloquee la larva durante dos o tres horas en suero al 5% y PBT. A continuación, incubar la larva en la dilución recomendada de colágeno anti-tipo II de conejo y anticuerpos anti-miosina de ratón con 5% de suero y PBT.

Realice esta incubación durante una hora a temperatura ambiente, o toda la noche a cuatro grados centígrados. Después de aplicar los anticuerpos primarios, lave la larva en PBT un total de seis veces durante 15 minutos por lavado. Después de los lavados de PBT, aplique un bloque de suero y PBT al 5% durante una o dos horas.

Ahora, aplique los anticuerpos secundarios, manteniendo a partir de ahora la preparación en la oscuridad tanto como sea posible. Utilice anticuerpos secundarios anti-ratón y anti-conejo marcados con fluorescencia en suero al 5% y PBT. Después de aplicar los anticuerpos secundarios, lave la larva en PBT seis veces durante 10 minutos por lavado.

Cualquier larva que se tiña como se describe, o que expresa marcas fluorescentes, ahora se puede obtener una imagen usando un microscopio confocal de la siguiente manera. Tome una pila de imágenes confocales de la región de interés utilizando la lente de objetivo de 10x con un zoom digital de aproximadamente 2,5x. Excite el canal verde y rojo con un láser de 488 nanómetros y un láser de 561 nanómetros.

A continuación, tome imágenes de 512 píxeles cuadrados utilizando un intervalo de plano z de 1,3 micras con tres promedios de líneas. Alrededor de 100 secciones z llenarán la pila. Exporte los datos como una pila de imágenes TIFF.

Abra la pila de imágenes TIFF y vea todos los canales en el software adecuado. Haga clic con el botón derecho en el canal de cartílago, seleccione orthoslice y cree. A continuación, haga clic con el botón derecho del ratón en el canal de cartílago y seleccione Procesamiento de imagen, suavizado y eliminación de ruido, seleccione el filtro de imagen y active o desactive el suavizado gaussiano.

En la vista de proyecto, haga clic con el botón derecho en la imagen filtrada, seleccione Segmentación de imagen y, a continuación, edite la nueva etiqueta. Cree una nueva etiqueta para cada material, como el cartílago y la articulación. A continuación, selecciona la región del cartílago de la imagen con la herramienta de varita mágica con el botón Todos los cortes activado y utiliza la herramienta de pincel para eliminar el ruido de los contornos.

A continuación, seleccione la región de la unión con la herramienta Pincel, asígnela al componente de la unión y repita la acción en toda la unión. Para suavizar varios sectores a la vez, seleccione Segmentación en el menú superior y seleccione Suavizar etiquetas. A continuación, para producir un renderizado de superficie 3D del componente, haga clic con el botón derecho en la imagen y seleccione Generar superficie.

Ahora, haga clic en la superficie renderizada y guarde los datos como un archivo HMASCII para el mallado software. 3D generación de malla es un paso crítico para generar un buen modelo. Debe comprometerse entre una malla que represente la forma real de la estructura que está tratando de modelar, sin incluir tantos detalles que introduzca elementos problemáticos, como los que tienen un ángulo demasiado pequeño o demasiado grande.

Para generar la malla, importe el modelo 3D en un paquete de software compatible. Para generar una malla bidimensional del cartílago y las superficies articulares, utilice la herramienta de envoltura retráctil en el menú 2D. Elija un tamaño de elemento entre 1,5 y 2,5.

Se puede fabricar una gama de mallas de superficie de diferentes tamaños para llevar a cabo la optimización de la malla 3D. Para garantizar que la malla sea continua entre las superficies articular y de cartílago, todos los elementos del límite deben compartir nodos comunes. Para lograr esto, retire la superficie interna de la junta, dejando un tubo hueco.

Utilice la tecla de función F2 para acceder al acceso directo al menú Eliminar elementos. Seleccione los elementos que desea eliminar. Ajuste los nodos límite para que coincidan con la superficie del cartílago.

Utilice una combinación de teclas de función F2, F3 y F6 para eliminar, mover nodos y crear nuevos elementos, respectivamente. Por último, duplique la superficie del cartílago en la articulación utilizando el menú de organización de componentes del colector. Utilice la tecla de función F2 para eliminar todos los elementos que no sean conjuntos.

Después, realice comprobaciones de calidad yendo al panel Comprobar elementos. Compruebe si hay elementos, inserciones y penetraciones duplicados en la malla. Si los encuentras, edítalos con la pestaña Herramientas.

Compruebe los ángulos diedros utilizando la pestaña de utilidad que se encuentra en la opción de árbol del modelo. Para generar una malla 3D a partir de las mallas de superficie 2D de diferentes tamaños de elemento, utilice la herramienta Tetramesh. Compare diferentes tamaños de malla y seleccione el modelo de FE con el tamaño de malla más bajo que converja después de simulaciones adicionales y que no comprometa la definición de características.

A continuación, con la herramienta Distancia, transforme la malla para que el modelo de mandíbula esté a escala. Asegúrese de que los componentes del cartílago y la articulación estén conectados en el modelo exportando un modelo combinado o utilizando lazos. A continuación, aplique cargas, restricciones y propiedades del material al modelo FE para simular la función de mordaza.

Usando las pilas confocales etiquetadas como guía, defina los músculos. Primero, asigne nodos que correspondan a los puntos de inserción muscular. A continuación, crea vectores entre los nódulos que representan el origen y la inserción de cada músculo.

Una vez que todos los músculos estén definidos, cree un colector de carga de historial y aplique una Cload a cada músculo. Especifique la magnitud en newtons y asigne el vector asociado. A continuación, asigne las propiedades elásticas apropiadas del material isotrópico elástico, según lo determine la literatura.

A continuación, cree un colector de carga de límite y aplique algunas restricciones iniciales en el modelo. Elija los nodos que desea restringir y seleccione un factor de grados de libertad similar al rango de movimiento natural del músculo definido por esos nodos. Ahora, cree un paso de carga para cada tipo de movimiento a simular.

En el menú de análisis, seleccione todas las cargas y restricciones relevantes para simular el movimiento que se está especificando. A continuación, seleccione estático en el menú desplegable. Cuando esté listo, exporte el modelo en un formato de archivo adecuado, incluidas las propiedades de la malla, las cargas, las restricciones y el material.

En este caso, se elige el formato INP. A continuación, cargue el modelo en el software de análisis de elementos finitos. Allí, cree y ejecute un trabajo para el modelo y analice la salida de la tensión, la deformación, el desplazamiento, etc.

Seleccione de tres a seis larvas de pez cebra transgénicas y anestesiar ligeramente las larvas con 0.02%MS-222 hasta que dejen de responder al tacto, pero sus corazones aún latan. A continuación, monte las larvas lateralmente en cubreobjetos de agarosa tibia con un 1% de punto de fusión bajo en la solución de Danieau. A continuación, retire con cuidado la agarosa de alrededor de la cabeza y la mandíbula con pinzas.

Luego, con una pipeta Pasteur, enjuague la solución fresca de Danieau sobre la cabeza de la larva para eliminar el anestésico. Haga esto hasta que se reanude el movimiento normal de la boca. Ahora, use un software de captura de películas para tomar videos fluorescentes de alta velocidad de los movimientos de la boca.

Filme a la velocidad de fotogramas más alta durante el tiempo que sea necesario para grabar varios ciclos de apertura de mandíbulas. Posteriormente, analiza el desplazamiento máximo de la mandíbula. Elija los marcos que muestren la mandíbula más abierta y mida la distancia entre la punta anterior del cartílago de Meckel y la mandíbula superior.

El punto maxilar superior corresponde a la punta de la placa etmoidal. La inmunotinción para músculo y cartílago, o la obtención de imágenes de reporteros transgénicos, permite visualizar la estructura 3D de la mandíbula, junto con la musculatura asociada. Mediante la obtención de imágenes a alta resolución, fue posible construir un modelo que captura la forma tridimensional de la mandíbula.

El modelo incorpora cargas cuya ubicación y magnitud se derivaron de las imágenes confocales del músculo y el cartílago. A partir de este modelo, se probaron una serie de diferentes propiedades del material. Utilizando el desplazamiento in vivo visto a través de la captura de video de alta velocidad, se seleccionó un modelo que mejor replica ese rango de movimiento.

Utilizando los datos más precisos sobre las propiedades del material, las cargas y la forma de la malla, se utilizó el modelo FE para explorar la mejor estimación del entorno mecánico experimentado durante este período de tiempo. Por ejemplo, se midieron las magnitudes de la tensión. El modelo se puede ampliar para ver los detalles finos del patrón, y luego mirar en secciones digitales para observar el detalle en todas las dimensiones.

Después de ver este video, tendrá una buena comprensión de cómo usar imágenes confocales para construir un modelo 3D fisiológicamente preciso de una estructura biológica que está bajo carga mecánica. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que este es un modelo lineal y elástico, y el cartílago no se comporta completamente como un material lineal. Se pueden incorporar otras propiedades del material, como la permeabilidad, pero pueden requerir más modificaciones en la malla.