La visualización de los Efectos de esputo en el desarrollo del biofilm mediante un modelo de Septadas cubreobjetos

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y cuantificar los cambios en las biopelículas en respuesta al esputo y los antibióticos. Este método puede ser utilizado por los investigadores para comprender preguntas clave, como cómo la eficacia de varios antibióticos contra las biopelículas bacterianas puede verse afectada por la presencia de esputo. La principal ventaja de esta metodología es que permite a las personas ver los cambios que ocurren en las biopelículas en respuesta a diferentes factores.

Para comenzar el experimento, registre el volumen de la muestra de esputo obtenida previamente. Agregue solución salina tamponada con fosfato, o PBS, agregue dos veces el volumen de la muestra. A continuación, utilice una pipeta de transferencia para mezclar bien la muestra.

Agite la muestra en la configuración más alta durante un minuto para mezclarla por completo. Alícuota de un mililitro de la mezcla en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. A continuación, gira por los tubos.

Después de la centrifugación, guarde el sobrenadante y deseche el pellet. Filtro: esterilice el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micras y recójalo en un tubo de microcentrífuga limpio. Almacene el sobrenadante de esputo a 80 grados centígrados para su uso futuro.

Coloque 40 microlitros de cultivo previamente preparado en cuatro mililitros de caldo Luria fresco, o medio LB, y cultive las bacterias para obtener un cultivo con una densidad óptica de 0,55 a 600 nanómetros. A continuación, diluya 100 microlitros de cultivo de 0,5 OD en 400 microlitros de filtrados de esputo al 10% preparados en LB. Utilice 200 microlitros de la dilución para sembrar los pocillos de las cámaras de portaobjetos. Deje que las bacterias se adhieran durante cuatro horas a 37 grados centígrados sin agitar.

Después de cuatro horas, retire el medio y lave suavemente la biopelícula con 1X lb fresco. Reemplace el medio restante con 200 microlitros de LB fresco. Deje que las biopelículas crezcan a 37 grados centígrados sin temblar. Reemplace el medio cada 12 horas sin lavar hasta que la biopelícula esté lista para la microscopía. Es muy importante lavar suavemente los portaobjetos para no alterar las bacterias adheridas.

Después del crecimiento, retire los medios de los pocillos de la cámara y lave suavemente cada cámara dos veces con 300 microlitros de PBS estéril. A continuación, para preparar la mezcla de tinción de biopelícula, agregue un microlitro de cada colorante proporcionado en el kit de viabilidad a cada mililitro de solución necesario y mezcle la solución. La cantidad óptima de tinte y el tiempo de tinción se determinan empíricamente para cada organismo.

Agregue 200 microlitros de la mezcla de tinción a cada pocillo del cubreobjetos con cámara. Incuba el cubreobjetos. Después de la incubación, retire la mezcla de tinción de las cámaras y lave cada pocillo con 300 microlitros de PBS estéril.

Reemplace el PBS con medios nuevos. Finalmente, proceda con la visualización a través de microscopía confocal. Las imágenes representativas del complejo Burkholderia cepacia, o aislados clínicos de BCC, después de 48 horas de crecimiento en un cubreobjetos con cámara con medios solos o en presencia de filtrados de esputo al 10%, demuestran que su presencia puede cambiar la arquitectura de la biopelícula.

Las imágenes se analizaron con el software Comstat para obtener los parámetros clave de la biopelícula, incluido el espesor promedio de la película, que aumentó cuando se trató con esputo al 10%. Con el fin de apreciar los efectos de los diferentes factores sobre el crecimiento de la biopelícula, los aislados clínicos se cultivaron solo en medio o con esputo y se trataron con o sin antibiótico. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo formar y tratar biopelículas en cubreobjetos con cámara y prepararlos para la tinción y el análisis confocal.