Name: La visualización de los Efectos de esputo en el desarrollo del biofilm mediante un modelo de Septadas cubreobjetos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Aprenda a visualizar y cuantificar el desarrollo de biofilms bacterianos en respuesta al esputo y antibióticos usando un modelo de cámara de cubreobjetos. Este método permite analizar la eficacia de tratamientos antimicrobianos.

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TB reconoce una beca de investigación de la fibrosis quística Canadá.

Tenga en cuenta que se requiere Junta Ética de Investigación (REB) para recoger y almacenar muestras de esputo de sujetos humanos. Estos estudios fueron aprobados por el Hospital para Niños Enfermos REB # 1000019444. 1. Preparación de muestras de esputo CF <ol><li> Recoger muestra de esputo de los pacientes durante las visitas rutinarias a la clínica de la fibrosis quística y mantener en hielo. </li><li> El transporte de la muestra de esputo en el hielo en la primera hora de la recogida, para el laboratorio de investigación, al objeto de tratamiento. </li></ol> 2. Procesamiento de esputo <ol><li> Registrar el volumen de la muestra de esputo obtenido. Añadir solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 2 veces el volumen de la muestra (es decir, 2 partes de PBS, 1 parte de muestra). </li><li> Mezclar bien la muestra con una pipeta de transferencia. Vortex la muestra a la máxima temperatura durante 1 minuto para mezclar completamente. </li><li> Alícuota de 1 ml de la mezcla anterior en el número 1,5 ml tubos de microcentrífuga apropiados y giran hacia abajo a 5000 xg durante20 min a 4 ° C. </li><li> Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante y desechar el sedimento. </li><li> Esterilizar por filtración del sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micras y recoger en un tubo de microcentrífuga limpio. NOTA: La esterilidad del filtrado se ensayó en placas sobre agar LB e inoculando medios líquidos. </li><li> Almacenar el sobrenadante del esputo a -80 ° C para su uso futuro. NOTA: El esputo de múltiples pacientes también pueden ponerse en común después de la filtración. </li><li> Antes de su uso, diluir el esputo filtrado 1/10 v / v (100 l de esputo, 900 l de medios de comunicación) en los medios de comunicación deseada. NOTA: En este caso, se utilizó caldo lysogeny estándar (LB) los medios de comunicación. </li></ol> 3. Método cubreobjetos calibrada para la formación de biopelículas <ol><li> Crecer aislado bacteriano de la noche a la mañana interés en los medios deseada a 37 ° C con agitación (200 rpm). Nota: Se usó una serie de diferentes bacterias, incluyendo aislados clínicos de Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Burkholderia cepacia y Achromobacter xylosoxidans. Elección de los medios depende de las cepas y las condiciones de interés, sin embargo, los medios de comunicación LB pueden ser utilizados para los experimentos iniciales. </li><li> De cultivo durante la noche, colocar 40 l de cultivo en 4 ml de medio fresco y crecer durante 3-4 horas a 37 ° C con agitación (200 rpm) para obtener un cultivo con una densidad óptica a 600 nm (OD 600) de aproximadamente 0,5 -0.6. </li><li> Se diluye la cultura desde el paso 3.2 a 1/5 en los medios de comunicación deseado con un 10% de filtrado de esputo o sin filtrado de esputo (como control). Otros concentración del filtrado de esputo puede ser probado (es decir, 50% o 100%). </li><li> Utilice 200 l de la dilución para sembrar pozos de cámaras de diapositivas. </li><li> Permiten que las bacterias se adhieran durante 4 horas a 37 ° C sin agitación. </li><li> Después de 4 horas, retire el soporte y lavar suavemente la biopelícula con medio fresco 1x. Reemplazar con 200 l de medio nuevo. NOTA: Para estudiar los efectos de esputo en el biofilm, las Fresmedios h deben contener el sobrenadante del esputo. </li><li> Permitir que las biopelículas que crecen para la cantidad deseada de tiempo a 37 ° C sin agitación, en sustitución de los medios de comunicación cada 12 horas, sin lavar hasta el momento para la microscopía. NOTA: Para estudiar el efecto de los sobrenadantes del esputo en la susceptibilidad antibiótica de biopelículas, los antibióticos se añaden a los medios de comunicación después de 24 h de crecimiento de la biopelícula y se mantienen en los medios hasta que las manchas y la imagen de las biopelículas. </li></ol> 4. Las biopelículas de tinción y microscopía confocal <ol><li> Tras el tiempo de crecimiento deseada (24-48 h funciona mejor), quitar el medio de pozos de cámara y lavar suavemente cada cámara dos veces con 300 l de PBS estéril. </li><li> Preparar la mezcla de tinción para biopelícula mediante la mezcla de 1 l de cada colorante (proporcionado en el kit de viabilidad) para cada ml de solución necesaria. Hacer colorante en solución de agua o medios de comunicación. NOTA: El agua se recomienda por el fabricante. </li><li> Añadir 200 l de mezcla de colorante a cada pocillo de covergla chamberedss e incubar a temperatura ambiente, en la oscuridad durante 45 min. </li><li> Retire la mezcla de tinción de las cámaras y lavar cada pocillo con 300 l de PBS estéril. Retirar PBS y reemplazar con agua fresca o medios de comunicación. </li><li> Proceder con la visualización de las biopelículas mediante microscopía confocal. </li></ol> 5. La visualización de biopelículas con microscopía confocal <ol><li> Leer biopelículas manchadas en las cámaras inmediatamente después de la tinción (a menos de 1 hora). Minimizar el retardo en la visualización de las diapositivas por tinción 1 a 2 cámaras de 8 pocillos a la vez. </li><li> Realizar las imágenes usando microscopio confocal láser para juegos de excitación y filtros para la adquisición. NOTA: Aquí, el sistema confocal de disco giratorio con láseres borealis espectrales (verde: 491nm, Rojo: 561 nm) se utilizó para la excitación. Emisión conjuntos de filtros de 515/40 y 624/40 fueron utilizados para visualizar las manchas de la kit biofilm viabilidad. </li><li> Tome imágenes utilizando un objetivo 25X en agua microscopio confocal con la cámara. </li><li&gt; Uso Z-pilas para modelar la biopelícula. Tomar imágenes cada 0,5-1 micras a partir del primer plano de enfoque hasta el último cuadro de enfoque de la biopelícula (por lo general abarca 30-80 micras para las biopelículas 48 hr) </li><li> Tome 3-5 imágenes de cada pocillo. NOTA: Por lo tanto durante otras 8 cubreobjetos así la recámara, se generarán imágenes 24-40. </li><li> Guardar las imágenes para su análisis. NOTA: Las imágenes deben ser guardados como archivos TIFF-OME para ser analizados mediante COMSTAT 18,19. Instrucciones para el análisis de imágenes biofilm se pueden encontrar en http://www.comstat.dk/. Una vez que las imágenes se importan, parámetros tales como espesor medio, la biomasa y la cobertura de la superficie para cada canal (rojo y verde) se pueden analizar. </li></ol>

<ol><li>Beaudoin, T., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+with+biofilm+formation%3A+selection+of+antimicrobials+and+role+of+prolonged+antibiotic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.Infect.Dis.J%22%5BJournal%5D)">Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy.</a> Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).</li>
<li>Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giving+structure+to+the+biofilm+matrix%3A+an+overview+of+individual+strategies+and+emerging+common+themes%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.Rev%22%5BJournal%5D)">Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes.</a> FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).</li>
<li>Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review%3A+Microbial+coaggregation%3A+ubiquity+and+implications+for+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development.</a> Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation%3A+a+clinically+relevant+microbiological+process%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process.</a> Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).</li>
<li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The in vivo biofilm.</a> Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).</li>
<li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-specific+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li>
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<li>Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clonal+strains+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+in+Ontario%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada.</a> Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).</li>
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<li>Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+caused+by+mucA+mutations+result+in+activation+of+TLR2+in+addition+to+TLR5+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.Biophys.Res.Commun%22%5BJournal%5D)">Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells.</a> Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+level+of+p38alpha+mitogen-activated+protein+kinase+activation+in+airway+epithelial+cells+determines+the+onset+of+innate+immune+responses+to+planktonic+and+biofilm+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa.</a> J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).</li>
<li>LaFayette, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis-adapted+quorum+sensing+mutants+cause+hyperinflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.Adv%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses.</a> Sci.Adv. 1 (6), e1500199(2015).</li>
<li>Staudinger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditions+associated+with+the+cystic+fibrosis+defect+promote+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Respir.Crit.Care+Med%22%5BJournal%5D)">Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).</li>
<li>Kennedy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+Tobramycin+against+Cystic+Fibrosis+Isolates+of+Burkholderia+cepacia+Complex+Grown+as+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).</li>
<li>Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+High-Dose+Antimicrobials+on+Biofilm+Growth+of+Achromobacter+Species+Isolated+from+Cystic+Fibrosis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).</li>
<li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li>
<li>Vorregaard, M. Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms
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<li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Biofilm+Formation+in+an+8-well+Chamber+Slide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide.</a> J. Vis. Exp. (47), e2481(2011).</li>
</ol>

Los métodos descritos en este documento permiten la visualización de las biopelículas bacterianas cultivadas en la presencia de productos exógenos. No es sorprendente que la producción de los exoproductos es de importancia cuando se utiliza este tipo de sistema. Por ejemplo, ditiotreitol (DTT), se utiliza a menudo en muestras de esputo humanos para ayudar a licuar las muestras. Sin embargo, el efecto de la TDT solo puede disminuir el desarrollo de biopelículas y la viabilidad (datos no mostrados). Por lo tanto, los cont...

biopelículas bacterianas son grupos de microorganismos que están unidos entre sí y encerrados en una matriz de auto-secretada. 1,2 Clásicamente, que representan bacterias unidas físicamente a una superficie abiótico o biótico formado bajo condiciones de flujo. Las biopelículas también se han demostrado para crecer en condiciones estáticas (ausencia de flujo) y distal de las superficies, tales como en la interfase aire-líquido de piscinas térmicas o unas películas formadas en tubos de ensayo. Estas biopelículas hace tiempo se reconoce en el medio ambiente y son un detrimento importante para los procesos industriales, ya que se pueden formar en los depósitos de agua o en las tuberías, lo que resulta en la contaminación biológica, la corrosión y los bloqueos. 3,4 Las biopelículas son también críticos en establecimientos de salud, ya que se ha demostrado estar implicado en infecciones relacionadas con el catéter, infecciones pulmonares en pacientes con fibrosis quística, así como en numerosas otras infecciones. 5,6 Uno de los rasgos distintivos de las infecciones biofilm es el dearrugado susceptibilidad de las bacterias a los antibióticos y deficientes despeje de la sistema inmune innato. 7-9 El más estudiados, escenarios clínicamente relevantes que supongan una infección basada en la biopelícula se produce en pacientes con fibrosis quística (FQ), que están infectados crónicamente con las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa puede someterse a una serie de cambios durante el establecimiento de la infección crónica que la hacen muy difícil de tratar. 10,11 Las biopelículas pueden activar diferencialmente la inmunidad innata y conducir la inflamación. 12-14 Como estas infecciones provocan un aumento de la morbilidad y la mortalidad en los pacientes con FQ, es crucial para entender los factores que pueden afectar el desarrollo del biofilm en este contexto. Un estudio reciente sugiere que host-factores son críticos en la formación de agregados de biopelícula P. aeruginosa. 15 Estas biopelículas contribuyen a la reducción de la susceptibilidad a los antibióticos y los mecanismos de defensa del huésped. el presena vez de factores derivados del huésped, tales como la elastasa de neutrófilos, así como productos secretados a partir de microorganismos presentes en el pulmón con FQ, tienen el potencial para modular en gran medida la formación y el desarrollo de biopelículas. 16 Además, las biopelículas interactuar con el anfitrión para modular la expresión de numerosos caminos e iniciar la inflamación. Si bien los métodos de alto rendimiento, tales como el ensayo de cristal violeta estándar, puede proporcionar alguna información con respecto al proceso de biopelícula, la visualización de la biopelícula en respuesta a estos factores proporcionan más información en profundidad. En este manuscrito se describe un método para el uso de factores de el esputo de pacientes con FQ para estudiar el desarrollo de biopelículas in vitro. Este método permite una rápida visualización de biofilms expuestos a esputo que contiene factores del huésped utilizando un kit de biofilm viabilidad comercial. Esta técnica se puede utilizar para identificar visualmente los cambios que ocurren durante el crecimiento de biopelículas en presencia de exógenonos productos, y representa un método mejorado para analizar los cambios en el desarrollo de biopelículas en diversas condiciones.

<table><tbody><tr><td>Lab-Tek II Cubreobjetos con cámara, borosilicato #1.5, 8 pocillos</td><td>Thermo Sicher Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer Kit de viabilidad de biofilm vivo/muerto Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>L10316</td><td></td></tr><tr><td>Placas de agar sangre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R10215</td><td>Confirmación de la viabilidad mediante recuentos de UFC o selección de colonias para la inoculación</td></tr><tr><td>COMSTAT</td><td>Software disponible en línea</td><td></td><td>COMSTAT es un software para analizar imágenes de biopelícula. Disponible en www.comstat.dk&nbsp;</td></tr><tr><td>Millers LB Caldo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12780-052</td><td>Medios estándar para el crecimiento nocturno de biopelículas</td></tr><tr><td>Filtros de jeringa Millex-GV</td><td>Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td>Filtrado de supernantes de esputo</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (Dulbecco A)</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>Lavado de cámaras de biofilm después de la eliminación de medios</td></tr><tr><td>Zeiss AxioVert 200M</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu C9100-13 EM-CCD</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectral Borealis</td><td>Qs Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Volocity</td><td>QS Technologies Inc.</td><td></td><td>Las instrucciones para este software se pueden encontrar en: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf</td></tr></tbody></table>

la visualización de los efectos de esputo en el desarrollo del biofilm mediante un modelo de septadas cubreobjetos

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Las biopelículas consisten en grupos de bacterias encapsuladas en una matriz de auto-secretada. Juegan un papel importante en la contaminación industrial, así como en el desarrollo y persistencia de muchas infecciones relacionadas con la salud. Una de las biopelículas más bien descritos y estudiados en la enfermedad humana se produce en la infección pulmonar crónica de los pacientes con fibrosis quística. Al estudiar biofilms en el contexto del huésped, muchos factores pueden afectar a la formación y el desarrollo de biopelículas. Con el fin de identificar cómo los factores del huésped pueden afectar a la formación y el desarrollo de biopelículas, se utilizó un método cubre objetos de cámara estática para crecer biopelículas en presencia de factores derivados del huésped en forma de sobrenadantes de esputo. Las bacterias se sembraron en cámaras y se expusieron a filtrados de esputo. Después de 48 h de crecimiento, las biopelículas se tiñeron con un kit de viabilidad comercial biopelícula antes de la microscopía confocal y análisis. Tras la adquisición de imágenes, las propiedades del biofilm pueden evaluarse utilizando diferentes plataformas de software.Este método nos permite visualizar las propiedades clave de la formación de biopelículas en presencia de diferentes sustancias, como los antibióticos.

El diseño general del experimento está representado en la Figura 1. El uso de este protocolo proporciona un método conveniente para visualizar los cambios en las biopelículas que crecen durante diferentes períodos de tiempo (por ejemplo, 24, 48 o 72 hr). Es importante destacar que las señales exógenas, tales como esputo filtrados, se puede añadir a visualizar los cambios en el desarrollo de biopelículas. Como se ve en la Figura 2, la presencia d...

Este protocolo describe la visualización del desarrollo de biopelículas después de la exposición a factores del huésped utilizando un modelo de cámara de portaobjetos. Este modelo permite la visualización directa del desarrollo de la biopelícula, así como el análisis de los parámetros de la biopelícula mediante programas informáticos.

La visualización de los Efectos de esputo en el desarrollo del biofilm mediante un modelo de Septadas cubreobjetos

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y cuantificar los cambios en los biofilms en respuesta a la flema y a los antibióticos. Este método puede ser utilizado por investigadores para comprender preguntas clave, como la manera en que la eficacia de diversos antibióticos frente a biofilms bacterianos puede verse afectada por la presencia de flema. La principal ventaja de esta metodología es que permite a las personas observar los cambios que ocurren en los biofilms en respuesta a diferentes factores.Para comenzar el experimento, registre el volumen de la muestra de esputo obtenida previamente. Añada solución salina tamponada con fosfato, o PBS, en una cantidad equivalente al doble del volumen de la muestra. A continuación, utilice una pipeta de transferencia para mezclar completamente la muestra.Vortex la muestra en la configuración más alta durante un minuto para mezclarla completamente. Aliquotar un mililitro de la mezcla en tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros. Luego centrifugar los tubos.Tras la centrifugación, guarde el sobrenadante y deseche el sedimento. Filtre el sobrenadante en condiciones estériles a través de un filtro de 0,22 micrones y recójalo en un tubo microcentrífugo limpio. Almacene el sobrenadante de esputo a 80 grados Celsius para uso futuro.Coloque 40 microlitros de cultivo previamente preparado en cuatro mililitros de caldo Luria fresco, o medio LB, y cultive las bacterias para obtener un cultivo con una densidad óptica de 0,55 a 600 nanómetros. A continuación, diluya 100 microlitros de cultivo con OD 0,5 en 400 microlitros de filtrados de esputo al 10% preparados en LB. Utilice 200 microlitros de la dilución para sembrar los pocillos de las cámaras portaobjeto. Permita que las bacterias se adhieran durante cuatro horas a 37 grados Celsius sin agitación.Después de cuatro horas, retire el medio y lave suavemente el biofilm con LB fresco 1X. Reemplace el medio restante con 200 microlitros de LB fresco. Deje crecer los biofilms a 37 grados Celsius sin agitación. Reemplace el medio cada 12 horas sin lavar hasta que el biofilm esté listo para la microscopía. Es muy importante lavar suavemente las laminillas para no perturbar las bacterias adheridas.Después del crecimiento, retire el medio de los pocillos de la cámara y lave suavemente cada cámara dos veces con 300 microlitros de PBS estéril. A continuación, para preparar la mezcla de tinción de biofilm, agregue un microlitro de cada colorante proporcionado en el kit de viabilidad por cada mililitro de solución necesaria y mezcle la solución. La cantidad óptima de colorante y el tiempo de tinción se determinan empíricamente para cada organismo.Añada 200 microlitros de la mezcla de tinción a cada pocillo del portaobjetos con cámaras. Incube el portaobjetos. Tras la incubación, retire la mezcla de tinción de las cámaras y lave cada pocillo con 300 microlitros de PBS estéril.Sustituya el PBS con medio fresco. Finalmente, continúe con la visualización mediante microscopía confocal. Imágenes representativas del complejo Burkholderia cepacia, o aislamientos clínicos de BCC, tras 48 horas de crecimiento en cámaras de cubreobjetos con medio solo o en presencia de filtrados de esputo al 10%, demuestran que su presencia puede alterar la arquitectura del biofilm.Las imágenes se analizaron con el software Comstat para obtener parámetros clave del biofilm, incluyendo el espesor promedio del biofilm, el cual aumentó cuando se trató con esputo al 10 %. Con el fin de evaluar los diferentes efectos de los factores sobre el crecimiento del biofilm, se cultivaron aislamientos clínicos en medio únicamente o con esputo, y cada uno se trató o no con antibiótico. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo formar y tratar biofilms sobre cubreobjetos con cámara y prepararlos para la tinción y el análisis confocal.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este documento describe los diferentes métodos de...

Los modelos de co-cultivo de Pseudomonas aeruginosa Biofilms Cultivado en las células vivas las vías respiratorias humanas

En este artículo se describe el procedimiento para la formación y la visualización de un biofilm bacteriano crecido dentro de una cámara de diapositivas 8...

En la formación de biofilm in vitro en una diapositiva Cámara de 8 pocillos

Fuente: Beaudoin, T., et al. Visualización de los efectos del esputo en el desarrollo de biofilm utilizando un modelo de coverglass con cámara. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demuestra el uso de un tapa con cámara para estudiar el efecto de los factores del esputo derivados de pacientes con fibrosis quística en el desarrollo de biofilm bacteriano.

Un método de coverglass con cámara para la formación in vitro de biofilm bacteriano

Fuente: Beaudoin, T., et al. Visualización de los efectos del esputo en el desarrollo de biofilm utilizando un modelo de coverglass con cámara. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demuestra un método in vitro para evaluar cómo la fibrosis quística derivada del paciente influye en la formación de biofilm bacteriano. Utilizando portaobjetos de cámara, tinción fluorescente y microscopía confocal, revela un mayor grosor, arquitectura alterada y una mayor biomasa viable en biofilms cultivados con esputo,...

Imagen confocal de biofilmes bacterianos inducidos por filtrados de esputo en pacientes con fibrosis quística

Se discuten los protocolos para el estudio de la formación de biopelículas en un dispositivo microfluídico que imita medios porosos. El dispositivo microfluídico consta de una matriz de micropilares y se investiga la formación de biopelículas por Pseudomonas fluorescens en este dispositivo.

Protocolo para Biofilm Streamer Formación en un dispositivo de microfluidos con Micro-pilares

Este estudio presenta el desarrollo de metodologías reproducibles para estudiar los inhibidores de biopelículas y sus efectos sobre la multicelularidad de Bacillus subtilis.

Metodologías para el estudio<em&gt; B. subtilis</em&gt; Las biopelículas como modelo para la caracterización de Pequeño Biofilm inhibidores de moléculas

El moco enchufado vías respiratorias de la fibrosis quística (FQ) son un ambiente ideal para los patógenos microbianos para prosperar. El manuscrito describe un nuevo método para el estudio de la microbioma CF pulmón en un entorno que imita donde causan enfermedad y cómo alteraciones de condiciones químicas pueden conducir dinámica microbianas.

El modelo de WinCF - un microcosmos barato y tractable de un bronquio enchufado del moco para estudiar la microbiología de las infecciones pulmonares

Este protocolo describe el uso de un dispositivo microfluídico automatizado personalizable para visualizar la formación de biopelículas de Candida albicans en condiciones fisiológicas de host.

Visualización de la formación de Biofilm de Candida albicans utilizando un dispositivo microfluídico automatizado

Describimos el montaje, operación y limpieza de un aparato de flujo diseñado para la formación de biopelículas fúngicas de imagen en tiempo real bajo flujo. También ofrecemos y discutir los algoritmos cuantitativos para ser utilizado en las imágenes adquiridas.

Imagen en tiempo real y cuantificación del desarrollo de biopelículas fúngicas mediante un sistema recirculación de flujo bifásico

Los cambios inducidos por antimicrobianos en la arquitectura de la biopelícula de Pseudomonas aeruginosa difieren entre los aislados clínicos cultivados de pacientes con fibrosis quística e infección pulmonar crónica. Después de la microscopía confocal, el software COMSTAT se puede utilizar para cuantificar las variaciones en la arquitectura de la biopelícula (por ejemplo, área de superficie, espesor, biomasa) para aislados individuales para evaluar la eficacia de los agentes antiinfecciosos.

Cuantificación de los efectos de los antimicrobianos en la arquitectura de biopelículas in vitro mediante el software COMSTAT

Aprenda a visualizar y cuantificar el desarrollo de biofilms bacterianos en respuesta al esputo y antibióticos usando un modelo de cámara de cubreobjetos. Este método permite analizar la eficacia de tratamientos antimicrobianos.

La visualización de los Efectos de esputo en el desarrollo del biofilm mediante un modelo de Septadas cubreobjetos

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