La visualización de los Efectos de esputo en el desarrollo del biofilm mediante un modelo de Septadas cubreobjetos
14 de diciembre de 2016
Este protocolo describe la visualización del desarrollo de biopelículas después de la exposición a factores del huésped utilizando un modelo de cámara de portaobjetos. Este modelo permite la visualización directa del desarrollo de la biopelícula, así como el análisis de los parámetros de la biopelícula mediante programas informáticos.
El objetivo general de este procedimiento es visualizar y cuantificar los cambios en las biopelículas en respuesta al esputo y los antibióticos. Este método puede ser utilizado por los investigadores para comprender preguntas clave, como cómo la eficacia de varios antibióticos contra las biopelículas bacterianas puede verse afectada por la presencia de esputo. La principal ventaja de esta metodología es que permite a las personas ver los cambios que ocurren en las biopelículas en respuesta a diferentes factores.
Para comenzar el experimento, registre el volumen de la muestra de esputo obtenida previamente. Agregue solución salina tamponada con fosfato, o PBS, agregue dos veces el volumen de la muestra. A continuación, utilice una pipeta de transferencia para mezclar bien la muestra.
Agite la muestra en la configuración más alta durante un minuto para mezclarla por completo. Alícuota de un mililitro de la mezcla en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. A continuación, gira por los tubos.
Después de la centrifugación, guarde el sobrenadante y deseche el pellet. Filtro: esterilice el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micras y recójalo en un tubo de microcentrífuga limpio. Almacene el sobrenadante de esputo a 80 grados centígrados para su uso futuro.
Coloque 40 microlitros de cultivo previamente preparado en cuatro mililitros de caldo Luria fresco, o medio LB, y cultive las bacterias para obtener un cultivo con una densidad óptica de 0,55 a 600 nanómetros. A continuación, diluya 100 microlitros de cultivo de 0,5 OD en 400 microlitros de filtrados de esputo al 10% preparados en LB. Utilice 200 microlitros de la dilución para sembrar los pocillos de las cámaras de portaobjetos. Deje que las bacterias se adhieran durante cuatro horas a 37 grados centígrados sin agitar.
Después de cuatro horas, retire el medio y lave suavemente la biopelícula con 1X lb fresco. Reemplace el medio restante con 200 microlitros de LB fresco. Deje que las biopelículas crezcan a 37 grados centígrados sin temblar. Reemplace el medio cada 12 horas sin lavar hasta que la biopelícula esté lista para la microscopía. Es muy importante lavar suavemente los portaobjetos para no alterar las bacterias adheridas.
Después del crecimiento, retire los medios de los pocillos de la cámara y lave suavemente cada cámara dos veces con 300 microlitros de PBS estéril. A continuación, para preparar la mezcla de tinción de biopelícula, agregue un microlitro de cada colorante proporcionado en el kit de viabilidad a cada mililitro de solución necesario y mezcle la solución. La cantidad óptima de tinte y el tiempo de tinción se determinan empíricamente para cada organismo.
Agregue 200 microlitros de la mezcla de tinción a cada pocillo del cubreobjetos con cámara. Incuba el cubreobjetos. Después de la incubación, retire la mezcla de tinción de las cámaras y lave cada pocillo con 300 microlitros de PBS estéril.
Reemplace el PBS con medios nuevos. Finalmente, proceda con la visualización a través de microscopía confocal. Las imágenes representativas del complejo Burkholderia cepacia, o aislados clínicos de BCC, después de 48 horas de crecimiento en un cubreobjetos con cámara con medios solos o en presencia de filtrados de esputo al 10%, demuestran que su presencia puede cambiar la arquitectura de la biopelícula.
Las imágenes se analizaron con el software Comstat para obtener los parámetros clave de la biopelícula, incluido el espesor promedio de la película, que aumentó cuando se trató con esputo al 10%. Con el fin de apreciar los efectos de los diferentes factores sobre el crecimiento de la biopelícula, los aislados clínicos se cultivaron solo en medio o con esputo y se trataron con o sin antibiótico. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo formar y tratar biopelículas en cubreobjetos con cámara y prepararlos para la tinción y el análisis confocal.
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Descripción general
Este protocolo describe la visualización y cuantificación del desarrollo de biopelículas en respuesta a esputo y antibióticos utilizando un modelo de cámara de portaobjetos. Este modelo facilita la observación directa de los cambios en las biopelículas y permite un análisis detallado mediante software informático.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Investigación de biopelículas
- Eficacia de antibióticos
Antecedentes
- Los biofilms son comunidades complejas de microorganismos.
- Comprender la respuesta de los biofilms a los antibióticos es crucial para las estrategias de tratamiento.
- El esputo puede influir en la eficacia de los antibióticos contra los biofilms.
- Este estudio tiene como objetivo visualizar eficazmente estas interacciones.
Objetivo del estudio
- Visualizar los cambios en los biofilms debido a la exposición a esputo y antibióticos.
- Cuantificar el impacto de los factores del huésped en el desarrollo del biofilm.
- Mejorar la comprensión de la eficacia de los antibióticos frente a los biofilms.
Métodos Utilizados
- Recolección de muestras de esputo.
- Dilución del esputo con solución salina tamponada con fosfatos (PBS).
- Mezcla de las muestras para lograr uniformidad.
- Visualización del desarrollo de biopelículas utilizando un modelo de cámara de portaobjetos.
Resultados principales
- Visualización directa de los cambios en el biofilm en respuesta a los antibióticos.
- Análisis cuantitativo de los parámetros del biofilm.
- Información sobre la interacción entre el esputo y la respuesta del biofilm.
- Demostración de la eficacia de diferentes antibióticos.
Conclusiones
- El modelo de cámara de portaobjetos es eficaz para estudiar la dinámica de los biofilms.
- Factores del huésped como el esputo afectan significativamente el comportamiento del biofilm.
- Esta metodología puede orientar futuras estrategias de tratamiento con antibióticos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La visualización cuantitativa del desarrollo del biofilm en presencia de esputo de origen hospedador y antibióticos aborda un desafío crítico en el descubrimiento de agentes antiinfecciosos y la fidelidad del modelo traslacional. Este enfoque permite reducir riesgos mecanicistas al revelar cómo los factores del hospedador modulan la eficacia del antibiótico y la arquitectura del biofilm, aportando información para la validación temprana de dianas y estrategias de cribado. El método respalda la confianza predictiva en las decisiones de cartera en investigación y desarrollo de enfermedades infecciosas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar hipótesis terapéuticas sobre la influencia de factores del huésped en la resistencia del biofilm.
- Apoya la reducción de riesgos biológicos mediante la cuantificación de la respuesta del biofilm a los antibióticos en matrices relevantes para la enfermedad.
- Facilita la validación funcional de dianas al medir la viabilidad y la arquitectura del biofilm en condiciones definidas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara sistemas de biopelículas validados para la selección de compuestos posteriores en presencia de factores clínicamente relevantes.
- Normaliza las condiciones del ensayo para garantizar la reproducibilidad y la comparación cuantitativa entre los diferentes grupos experimentales.
- Genera resultados cuantitativos robustos, como el grosor y la viabilidad de la biopelícula, para una evaluación fiable de los compuestos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea modelos de biofilm in vitro con entornos huésped relevantes para la enfermedad, mejorando la continuidad traslacional.
- Apoya el avance ajustado al riesgo al revelar el rendimiento de los antibióticos en matrices biológicas complejas.
- Proporciona información mecanicista sobre las interacciones huésped-patógeno-fármaco para la reducción de riesgos predictiva.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este modelo de cubreobjetos con cámaras se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al permitir pruebas basadas en hipótesis sobre la eficacia de los antibióticos en sistemas de biopelículas que imitan al huésped.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre el impacto de factores del huésped y la aclaración de vías en el desarrollo del biofilm.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles para la priorización de compuestos en contextos de biofilm.
- Análisis: Ofrece mediciones basadas en imágenes y resultados estadísticos para la comparación entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos in vitro con modelos preclínicos mediante la incorporación de matrices relevantes para la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma estandarizada y adaptable para la evaluación repetida de estrategias anti-biofilm.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la I+D de agentes antiinfecciosos.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, reproducibilidad y escalabilidad de los ensayos de biopelículas.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción del desarrollo y la eficiencia del capital al revelar la eficacia del fármaco dependiente del contexto.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos basada en su desempeño en sistemas que imitan al huésped.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de biopelículas, microscopía confocal y análisis cuantitativo de imágenes.
- Necesita acceso a sistemas de cubreobjetos con cámaras, kits de tinción de viabilidad y software analítico como Comstat.
- Exige estandarización entre equipos en los protocolos de preparación de muestras y adquisición de imágenes.
- Puede requerir adaptaciones para diferentes especies bacterianas o matrices derivadas del hospedador.
- Depende de la optimización empírica de los parámetros de tinción y adquisición de imágenes para cada organismo.
