La visualización del Tejido Interrenal androgénica, y su microambiente vascular en el pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es detectar células esteroidogénicas interrenales diferenciadas en el pez cebra en desarrollo a través de un ensayo simple de actividad enzimática de montaje completo. Este procedimiento de tinción puede ayudar a responder preguntas clave sobre los mecanismos moleculares y celulares de la formación y malformación de la glándula interrrenal. La principal ventaja de este ensayo de tinción es que es rápido, sencillo y fiable, lo que lo convierte en una potente herramienta para los cribados genéticos o químicos en el pez cebra.

Este procedimiento se puede realizar en líneas reporteras fluorescentes trágnicas, marcando el riñón y los vasos sanguíneos para que se puedan analizar múltiples tejidos en el mismo embrión. En combinación con el corte de vibratome, la inmunohistoquímica y la microscopía confocal, también se puede visualizar el microambiente vascular del tejido interrrenal. Después de preparar soluciones madre para tres tinciones con actividad de beta-Hsd de acuerdo con el protocolo de texto, coloque los embriones de pez cebra en desarrollo en PTU al 0,03% en agua de huevo para inhibir la formación de pigmento.

Fije los embriones decorionados, o larvas, en 2% o 4% de PFA en PBS con 0.1%Tween 20, o PFAT. Con PBST, lave los embriones cuatro veces durante 10 minutos cada uno, asegurándose de que las muestras no se sequen entre lavados. Antes de las reacciones de tinción, prepare las partes A y B en tubos separados, luego en vórtice y centrifuga las soluciones.

Es esencial preparar las partes A y B en tubos separados. La adición de todos los componentes directamente en un solo tubo causará precipitaciones severas de inmediato. Agregue todo el tubo de la parte A al tubo completo de la parte B. Mezcle bien e inmediatamente distribuya un mililitro en cada tubo de microfuga que contenga embriones fijados y lavados.

Use papel de aluminio para envolver los tubos y colóquelos a temperatura ambiente sobre un rotador o una plataforma mecedora agitando suavemente. Determinar empíricamente el tiempo de reacción mediante el uso de un microscopio para monitorear las señales cromogénicas. Con el tiempo se desarrollarán ligeras precipitaciones que no interferirán con el proceso de reacción.

Detenga la reacción usando PBST para lavar los embriones cuatro veces durante 10 minutos cada uno, luego fije los embriones teñidos con 4% de PFAT a temperatura ambiente durante 60 minutos. Para la microscopía de montaje completo, use 50% de glicerol en PBS para eliminar los embriones. Luego, después de orientarlas con el lado dorsal hacia arriba, observe las muestras usando un microscopio vertical bajo iluminación de campo brillante.

Desmonta la yema del embrión y úsala para preparar una montura plana. Luego, capture una imagen de alta resolución de la morfología del tejido interrenal. Para analizar el microambiente vascular del tejido esteroidogénico, se fije los embriones teñidos con PFA al 2%.

Compleméntelo con Triton X-100 al 1% a cuatro grados centígrados durante una hora, y use PBST-X para lavar los embriones a temperatura ambiente cuatro veces durante 10 minutos cada una. Para incrustar los embriones, prepare un 4% de agarosa de bajo punto de fusión disolviendo la agarosa en PBS a 95 grados centígrados. Luego, alícuota en tubos de microcentrífuga y almacenamiento a cuatro a ocho grados centígrados.

Derrita una alícuota de 4% de agarosa de bajo punto de fusión a 70 grados centígrados durante 10 minutos, luego mantenga la alícuota a 47 grados centígrados. Usando una tapa separada de un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros como molde, incruste un embrión en agarosa fundida y deje que se enfríe hasta que esté sólido. Para llevar a cabo el corte del vibratomo, adhiera un trozo de cinta de papel a la plataforma seca del vibratomo.

Luego, use una hoja de afeitar para quitar el bloque de agarosa endurecido del molde. Aplique superpegamento a la cinta de papel en la plataforma y fije el bloque de agarosa en la cinta de papel con el lado anterior de la muestra hacia arriba. A continuación, recorte el bloque de agarosa a una forma de prisma trapezoidal con aproximadamente cuatro a ocho milímetros a cada lado de las facetas superior e inferior respectivamente.

Utilice un gotero lleno de PBS frío con 0.5%Trident X-100 para enjuagar el bloque de agarosa. Luego, use un vibratomo de acuerdo con las instrucciones del fabricante para preparar secciones de 100 micrómetros. Con una aguja de calibre 26, retire las secciones cortadas del vibratomo y transfiera a una placa puntual que contenga 500 microlitros de 0,5 % PBST-X frío por pocillo.

Recoja las tres secciones de tejido positivas para la actividad beta-Hsd mediante una inspección con un microscopio de disección y utilice una punta de pipeta para transferir las secciones a una placa de 96 pocillos que contenga 0,5 % de PBST-X frío. Tiñe e imageniza aún más las secciones de acuerdo con el protocolo de texto. Para determinar cómo se desarrolla el tejido interrrenal esteroidogénico con el glomérulo renal pronefrrico y su vasculatura naciente, se realizó el ensayo de actividad enzimática de tres beta-Hsd en un embrión de pez cebra transgénico doble, que expresa fluorescencia específica del riñón y específica del endotelio.

Como se muestra aquí, tres tejidos esteroidogénicos beta-Hsd positivos se encuentran a la derecha de la línea media e inmediatamente se adhieren al glomérulo renal pronefricio. Algunas células esteroidogénicas también comienzan a migrar a través de la línea media. Estas secciones de vibratomo de embriones transgénicos que expresan GFP endotelial sometidos al ensayo de tres beta-Hsd se analizaron mediante inmunohistoquímica para detectar fibronectina y su efector posterior, la quinasa de adhesión focal fosforilada.

El depósito de fibronectina en la aorta peridorsal es esencial para apoyar el crecimiento de los vasos interrenales. Para el embrión o larva de pez, la tinción histoquímica de montaje completo se puede realizar en un día si se realiza correctamente. Aunque este método de tinción es simple y rápido, es importante recordar que detecta solo una enzima de la vía esteroidogénica.

Si se pretende un análisis del desarrollo del tejido interrenal, además de este ensayo, se deberá realizar una habitación in situ para detectar la expresión de otros genes críticos implicados en la esteroidogénesis.