Una plataforma de ensayos anti-biopelícula Adecuado para la Exploración de bibliotecas de compuestos naturales

El objetivo general de esta plataforma de ensayos es proporcionar un flujo de trabajo de cribado significativo que combine tres puntos finales relevantes, viabilidad, biomasa y matriz de biopelícula, para la identificación y caracterización de nuevos compuestos anti-biopelícula. Esta plataforma puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del descubrimiento de agentes antibiopelículas, al permitir una distinción temprana de los efectos quimioterapéuticos a corto y largo plazo de una manera rápida y compatible con la explicación. La principal ventaja de esta plataforma desarrollada es que combina diferentes ensayos para proporcionar una imagen más completa de los efectos anti-biofilm de las bibliotecas químicas, especialmente de los compuestos naturales.

Para comenzar el experimento, prepare muestras de control sin tratar con 200 microlitros de 10 a la sexta UFC por mililitro de cultivo bacteriano por pocillo de una placa estéril de 96 micropocillos. Incluya controles de medios sin cultivo bacteriano. A continuación, en las mismas placas de 96 pocillos, prepare muestras con cuatro microlitros de solución madre antibiótica 50x y 196 microlitros del cultivo de bacterias por pocillo, luego, incube los cultivos.

Continúe con la tinción con resazurina utilizando una pipeta multicanal para transferir toda la solución planctónica, con cuidado, sin tocar las biopelículas ni crear burbujas de aire, a una placa de 96 pocillos separada y limpia. De nuevo, utilizando una pipeta multicanal, lavar los biofilms, una vez, con PBS estéril añadiendo 200 microlitros por pocillo y retirar la solución con cuidado. Agregue 200 microlitros de solución de resazurina de 20 micromolares, por pocillo, de la placa de biopelícula e incube la biopelícula, en la oscuridad, a 200 rpm durante 20 minutos, hasta que los controles de biopelícula sin tratar estén uniformemente rosados.

A continuación, mida la fluorescencia con un lector de placas. Retire la mancha de resazurina con cuidado de los pocillos. Fije las biopelículas con 200 microlitros de metanol, durante 15 minutos.

Después de la fijación, retire el metanol y deje que la placa se seque al aire durante 10 minutos. A continuación, utilice una pipeta multicanal para añadir con cuidado 190 microlitros de solución de violeta cristalina al 0,02% al biofilm. Evite tocar los lados de los pocillos, con la mancha, mientras pipetea, y evite la formación de burbujas de aire, y no presione la pipeta para completar el soplado.

Luego, incuba la placa durante cinco minutos a temperatura ambiente. Con una pipeta multicanal, elimine la mancha con cuidado. Lavar el biofilm con 200 microlitros de agua desionizada.

Deje que los pocillos se sequen durante cinco minutos a temperatura ambiente y disuelva la mancha restante en ácido acético al 33%. Incubar la placa durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, lea la absorbancia a 595 nanómetros.

Mida la turbidez a 595 nanómetros de la placa de solución planctónica preparada. Esto se puede hacer durante la incubación de la placa teñida de violeta cristalino. A continuación, tiñe las bacterias planctónicas, con resazurina, añadiendo 10 microlitros de la reserva de resazurina, por pocillo.

Pipetea la solución para mezclarla bien. Incubar la placa, en la oscuridad, a temperatura ambiente, 200 rpm, durante aproximadamente cinco minutos, hasta que los controles sin tratar estén uniformemente rosados. A continuación, mida la fluorescencia.

Obtenga una de las placas de muestra paralelas para esta tinción y utilice una pipeta multicanal para eliminar la solución planctónica de los pocillos. Lave los pocillos, una vez, con PBS estéril cuidadosamente, sin tocar las biopelículas. Agregue 200 microlitros de aglutinina de germen de trigo, o solución de WGA, por pocillo, para teñir.

Luego, incuba la placa. Después de la incubación, lave las células con PBS, tres veces, para eliminar la mancha no unida. Deje que la placa se seque durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Visualice las muestras con un microscopio de fluorescencia y un filtro FITC. Disuelva la mancha ligada en 200 microlitros de ácido acético al 33% por pocillo. Selle los pozos con tapas de tiras y soniquelos con un sonicador de baño de agua.

Después de la sonicación, incubar la placa, durante una hora, a 37 grados centígrados. Después de una hora, repita la sonicación mientras mantiene los pocillos sellados entre los pasos de sonicación. Mida la fluorescencia con un lector de placas.

De nuevo, tome una de las placas de muestra paralelas para esta tinción y, con una pipeta multicanal, retire la solución planctónica de los pocillos. Luego, lave los pocillos una vez con PBS estéril. Agregue seis microlitros de la solución de tinción por pocillo e incube la placa en la oscuridad durante 15 minutos.

Antes de la microscopía, retire el exceso de líquido, manualmente, utilizando una pipeta multicanal. Capture las imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia con un filtro FITC, para fluorescencia verde, para visualizar células viables y un filtro TRITC, para fluorescencia roja, para visualizar células muertas. Utilice una de las placas de muestra paralelas para esta tinción, y retire la solución planctónica de los pocillos, y lave los pocillos una vez con PBS estéril, utilizando una pipeta multicanal.

A continuación, agregue 200 microlitros de la solución de tinción, por pocillo, e incube, durante 15 minutos, en oscuridad. Por último, mida la fluorescencia con un lector de placas. Se realizaron dos proyecciones para demostrar el rendimiento de la plataforma como porcentaje del control de biopelícula sin tratar.

El cribado de una biblioteca de derivados de alcaloides de quina identificó un compuesto activo. El cribado de una biblioteca de diterpenoides de tipo abietano y sus derivados, identificó cinco compuestos activos. Tanto la penicilina G como la ciprofloxacina disminuyen significativamente la viabilidad, la biomasa y el contenido de PNAG de la matriz de biopelícula antes de la formación de la biopelícula.

Sin embargo, este no fue el caso cuando se utilizó la postexposición. El resultado más destacado fue el aumento de la matriz de la biopelícula a más del 200% cuando las biopelículas preformadas se trataron con altas concentraciones de penicilina G. Esta imagen fluorescente confirma que la penicilina G mata alrededor del 50% de la población bacteriana de la biopelícula preformada, Staphylococo aureus. El promedio de las proporciones de fluorescencia verde a rojo para los pocillos de biopelícula no tratados indica un predominio de células vivas.

Mientras que los pozos tratados con penicilina tienen alrededor del 56% de células vivas. Las células que permanecieron vivas, después del tratamiento con penicilina, produjeron una cantidad significativamente mayor de sustancia polimérica extracelular, o EPS, en comparación con las biopelículas no tratadas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe prestar atención a la manipulación manual de la pipeta para evitar la contaminación de bacterias y manchas entre pocillos.

Siguiendo esta plataforma, se pueden identificar y caracterizar rápidamente los compuestos antibiofilm eficaces contra el Staphylococcus aureus. Si se utilizan otras especies bacterianas, será necesaria otra optimización de los protocolos de tinción, pero la racionalidad de la plataforma seguirá siendo la misma.