Name: Un láser de sondeo rápido método facilita la determinación no invasiva y sin contacto de la hoja de Propiedades Térmicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprende a determinar propiedades térmicas de hojas sin contacto mediante sonda láser infrarrojo cercano. Este método rápido mide capacidad calorífica y conductividad térmica en Nicotiana tabacum sin dañar la muestra.

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Los autores están agradecidos al Dr. Thomas Rademacher e Ibrahim Al Amedi por cultivar las plantas utilizadas en este estudio. Nos gustaría agradecer al Dr. Richard M. Twyman por su ayuda en la edición del manuscrito. Este trabajo fue financiado en parte por la Subvención Avanzada del Consejo Europeo de Investigación "Future-Pharma", propuesta número 269110, la Fraunhofer Zukunftsstiftung (Fundación del Futuro), los Programas Internos de Fraunhofer-Gesellschaft bajo la Subvención No. Atrae 125-600164.

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Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

El método de medición sin contacto, no destructivo descrito anteriormente se puede utilizar para determinar c p, s y ʎ de una manera simultánea y reproducible. El cálculo de ʎ, en particular, depende de varios parámetros que son sensibles a los errores. Sin embargo, el impacto de estos errores se encontró era lineal o sub-proporcional, y el coeficiente de variación para todos los parámetros a ser inferior a 10%. A pesar de que el método por lo tanto puede ser considerado como robusta, algunas mejoras...

El procesamiento a gran escala de materiales biológicos a menudo requiere pasos de tratamiento térmico tales como la pasteurización. El equipo para tales procesos se puede diseñar con más precisión si las propiedades térmicas de los materiales biológicos están bien caracterizadas, incluyendo la capacidad específica de calor (c p, s) y la conductividad térmica (λ). Estos parámetros se pueden determinar fácilmente para líquidos, suspensiones y homogeneizados mediante calorimetría 1. Sin embargo, la medición de estos parámetros en muestras sólidas pueden ser de mano de obra, y a menudo requiere el contacto directo con la muestra o incluso su destrucción 2. Por ejemplo, las técnicas de fototérmicos requieren contacto directo entre la muestra y el detector 3. Estas limitaciones son aceptables durante el procesamiento de alimentos, pero son incompatibles con los procesos altamente regulados, tales como la producción de proteínas biofarmacéuticas en plantas en el contexto de las buenas prácticas de fabricación 4. yon este contexto, puede ser necesario repetir (por ejemplo, semanal) el seguimiento de las propiedades térmicas durante un período de siete semanas de crecimiento para las plantas individuales como una herramienta de control de calidad. Si una supervisión de este tipo requeriría y consumir una hoja para cada medición, no habría biomasa izquierda a procesar en el momento de la cosecha. Además, utilizando únicamente piezas de hoja en lugar podría causar heridas a la planta y aumentar el riesgo de necrosis o infección por patógenos, de nuevo disminuyendo el rendimiento del proceso. La probabilidad de que la infección por patógenos también puede aumentar si se utiliza un método de contacto directo con la muestra, que induce el riesgo de que un lote entero de las plantas puede estar infectada por el contacto con un dispositivo sensor contaminada. Aspectos similares tienen que ser considerados para la supervisión de la planta destaca como la sequía, por ejemplo, en un contexto ecofisiológica. Por ejemplo, la pérdida de agua es a menudo controlado por un cambio en la biomasa fresca, lo que requiere un tre invasivaatment de las plantas que se investigan 5, por ejemplo, una hoja de disección. En lugar de ello, la determinación de la capacidad de calor específico, que depende del contenido de agua de una muestra, de una manera no invasiva como se ha descrito aquí, se puede utilizar como un parámetro sustituto para el estado de hidratación de las plantas. En ambos escenarios (producción farmacéutica y ecofisiología), tensiones artificiales inducidos por técnicas de medición destructivas o invasivos serían perjudiciales ya que pueden distorsionar los datos experimentales. Métodos de flash, por lo tanto, se informó anteriormente 6 o la colocación de muestras entre las placas de plata 7 no son adecuados para este tipo de procesos y experimentos, ya sea porque requieren contacto directo con la muestra o son destructivos. Los parámetros c p, s y λ deben determinarse con el fin de diseñar el equipo de proceso de una etapa de blanqueo que puede simplificar la purificación del producto y reducir así los costes de fabricación 8-10. tanto cp, s y λ ahora pueden determinarse rápidamente por láser sin contacto infrarrojo cercano no destructivo (NIR) de sondeo de una manera consistente y reproducible 11 y este nuevo método se explicarán en detalle a continuación. Los resultados obtenidos con este método se utilizaron con éxito para simular la transferencia de calor en las hojas de tabaco 12, lo que permite el diseño de equipos de procesamiento apropiada y la selección de los parámetros correspondientes tal como la temperatura de escaldado. El método es fácil de configurar (Figura 1) y tiene dos fases, la medición y el análisis, cada una de las cuales comprende dos etapas principales. En la fase de medición, una muestra de hoja se calienta primero a nivel local por un pulso de láser corto y se registra la temperatura máxima de la muestra. El perfil de temperatura de la muestra se registra a continuación, para una duración de 50 s. En la fase de análisis, las propiedades de la hoja tales como la densidad (con facilidad y precisión determinados por measurem picnométricoent) se combinan con la temperatura máxima de la muestra para calcular c p, s. En el segundo paso, el perfil de temperatura de la hoja se utiliza como entrada para una ecuación de balance de energía, teniendo la conducción, convección y radiación en cuenta, para calcular λ. Detalladas instrucciones paso a paso se proporcionan en la sección de protocolo, ampliando el contenido del video que lo acompaña. mediciones típicos se muestran a continuación en la sección de resultados. Por último, los beneficios y limitaciones del método se resaltan en la sección de discusión, junto con las posibles mejoras y nuevas aplicaciones. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54835/54835fig1.jpg"> Figura 1: Aparato utilizado para determinar las propiedades térmicas de las hojas. A. Fotografía del aparato de medición utilizado para determinar la capacidad de calor específico y la conductividad térmica de leAves. Los dispositivos periféricos (ordenadores, osciloscopio) no se muestran. B. Representación esquemática del aparato de medición. El láser y el equipo conectado están resaltados en rojo, el detector NIR para la medición de la temperatura se muestra en la púrpura, la muestra de la hoja es verde y el sensor de potencia fotodiodo es de color azul. C. Dibujo de los elementos de la configuración de la medición con el mismo código de color como en B. La barra indica el tamaño de 0,1 m. D. Captura de pantalla que ilustra los elementos típicos del software de control de láser. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54835/54835fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Tubo de 1"</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L10E</td><td>Tubo para soporte de fibra</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0701</td><td>Agarosa</td></tr><tr><td>Lente Bi-Convexa f=25.4</td><td>Thorlabs</td><td>LB1761</td><td>Lente</td></tr><tr><td>Digital Óptica de Mano&nbsp; Consola de medidor de potencia y energía</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>Consola para sensor de absorción de superficie</td></tr><tr><td>térmica Osciloscopio de fósforo digital&nbsp;</td><td>Tektronix</td><td></td><td>DPO7104 Osciloscopio</td></tr><tr><td>DMR Microscopio óptico</td><td>Leica</td><td>n.a.Microscopio</td><td></td></tr> óptico <tr><td>Falcon 50 mL Tubos de centrífuga cónicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-2</td><td>Picnómetro</td></tr><tr><td>Ferty 2 Mega</td><td>Kammlott</td><td>5.220072</td><td>Fertilizante</td></tr><tr><td>Soporte de fibra</td><td>Thorlabs Soporte de</td><td></td><td>fibra</td></tr><tr><td>Forma -86 &#176; C Ultracongelador</td><td>ThermoFisher</td><td>88400</td><td>Congelador</td></tr><tr><td>Invernadero</td><td>n.a.n.a.Para</td><td></td> <td>el cultivo de plantas</td></tr><tr><td>Grodan Rockwool Cubos 10 x 10 cm</td><td>Grodan</td><td>102446</td><td>Bloque de lana de roca</td></tr><tr><td>Detector de infrarrojos Optris CT</td><td>Optris OPTCTLT15</td><td></td><td>Detector de infrarrojos</td></tr><tr><td>Software de detección de infrarrojos Compact Connect</td><td>Optris</td><td>n.a.Control</td> <td>software para detector de infrarrojos</td></tr><tr><td>Lambda 1050 espectrofotómetro UV/Vis</td><td>PerkinElmer</td><td>L1050</td><td>Espectrofotómetro UV/VIS</td></tr><tr><td>Laser 400 &mu; m, 1.550&nbsp; Módulo acoplado de fibra de una sola barra refrigerado por conducción nm</td><td>DILAS</td><td>M1F-SS2.1</td><td>Cubierta</td></tr><tr><td>láser</td><td>Amtron</td><td>LM200</td><td>Cubierta</td></tr><tr><td>láser Controlador láser&nbsp;</td><td>Amtron</td><td>CS 408</td><td>Laser Driver</td></tr><tr><td>Osram blanco frío 36 W</td><td>Osram</td><td>4930440</td><td>Fuente</td></tr><tr><td>de luz Sensor de fotodiodo&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>PDA20H-EC Sensor de</td><td>potencia para mediciones de transmisión</td></tr><tr><td>Peso de precisión Ohaus Analytical Plus</td><td>Ohaus</td><td>80251552</td><td>Peso de precisión</td></tr><tr><td>Marco de muestra</td><td>Fraunhofer ILT</td><td>n.a.Fijación</td> <td>de la muestra de hoja</td></tr><tr><td>Software Pyro Control</td><td>Amtron</td><td>n.a.Software</td> de <td>control de potencia láser</td></tr><tr><td>Soporte de acero inoxidable</td><td>n.a.n.a</td><td>.</td><td>Soporte para la configuración de la medición</td></tr><tr><td>Placas de teflón 2 cm</td><td>Fraunhofer ILT</td><td>n.a.Atenuación</td> <td>del teflón</td></tr><tr><td>Absorbedor térmico de la superficie Sensor de potencia</td><td>Thorlabs</td><td>S314C</td><td>Sensor para mediciones de potencia láser</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>1491200S001</td><td>Vibratome</td></tr><tr><td>Zoc/Pro 6.51&nbsp;</td><td>EmTec Software Innovador</td><td>n.a.Software</td> <td>de Control Láser&nbsp;</td></tr></tbody></table>

un láser de sondeo rápido método facilita la determinación no invasiva y sin contacto de la hoja de propiedades térmicas

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

Las plantas pueden producir sustancias valiosas tales como metabolitos secundarios y proteínas recombinantes. La purificación de este último a partir de biomasa de la planta puede ser simplificado mediante el tratamiento de calor (escaldado). Un aparato de escaldado se puede diseñar con más precisión si las propiedades térmicas de las hojas se conocen en detalle, es decir, la capacidad de calor específico y conductividad térmica. La medición de estas propiedades es mucho tiempo y mucha mano de obra, y por lo general requiere métodos invasivos que entran en contacto la muestra directamente. Esto puede reducir el rendimiento del producto y puede ser incompatible con los requisitos de contención, por ejemplo, en el contexto de buenas prácticas de fabricación. Para abordar estos problemas, un método no invasivo, sin contacto fue desarrollado que determina la capacidad de calor específico y la conductividad térmica de una hoja de la planta intacta en aproximadamente un minuto. El método implica la aplicación de un pulso de láser corto de la longitud y la intensidad se define a una pequeña área de lamuestra de hoja, causando un aumento de la temperatura que se mide usando un sensor de infrarrojo cercano. El aumento de temperatura se combina con conocidas propiedades de la hoja (espesor y densidad) para determinar la capacidad de calor específico. La conductividad térmica se calcula entonces basándose en el perfil de la disminución de la temperatura posterior, teniendo la radiación térmica y la transferencia de calor por convección en cuenta. Se discuten los cálculos asociados y aspectos críticos de la manipulación de las muestras.

Medición de las propiedades de la hoja Utilizando el método microscópico anteriormente, un espesor de hoja de 0,22 hasta 0,29 × 10-3 m se determinó tanto para N. tabacum (0,25 ± 0,04 × 10-3 m, n = 33) y N. benthamiana (0,26 ± 0,02 × 10 - 3 m, n = 24), que está bien dentro de la 0,20-,33 × 10 - m rango 3 se...

Se desarrolló un método para determinar la capacidad calorífica específica y la conductividad térmica del tejido foliar mediante un sondeo láser de infrarrojo cercano no invasivo y sin contacto, que requiere menos de 1 minuto por muestra.

Un láser de sondeo rápido método facilita la determinación no invasiva y sin contacto de la hoja de Propiedades Térmicas

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar las propiedades térmicas de las hojas sin contacto. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la agricultura molecular sobre el control durante el proceso del crecimiento y la salud de las plantas. Las principales ventajas de esta técnica son que no requiere contacto, es rápida y no daña la muestra.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la inspección automatizada de las plantaciones con un detector móvil para definir la alimentación y la nutrición planta por planta. Para comenzar el cultivo de plantas, enjuague los bloques de lana mineral con uno o dos litros de agua desionizada cada uno, luego enjuague cada bloque con un litro de una solución de fertilizante al 0,1%. Coloque una semilla de tabaco en cada bloque y enjuague con 250 mililitros de solución de fertilizante, asegurándose de que la semilla no se lave.Cultive las plantas durante siete semanas en un invernadero o fitotrón. Una vez que las plantas hayan crecido, coseche hojas individuales intactas y sin daños para la caracterización de las plantas o use plantas intactas. Para comenzar la determinación del espesor de la hoja, prepare en autoclave 50 mililitros de una solución de agarosa del 2% en masa por volumen y solución salina tamponada con fosfato.Deje que la solución se enfríe a 40 grados centígrados y luego agregue la solución a una placa de Petri que contenga una muestra de una sola hoja. Enfríe la muestra a cuatro grados centígrados durante 30 minutos para solidificar la agarosa e incrustar la hoja. A continuación, utilice un vibratomo para cortar el bloque de agarosa en rodajas de 200 micrómetros.Monta cinco secciones transversales de hojas en un portaobjetos de vidrio con cianocrilato. Use un microscopio o un comparador para determinar el grosor de las áreas libres de venas de la muestra de hojas. Utilice otra muestra de una sola hoja en agua para determinar la densidad de las hojas con un picnómetro.A continuación, sujete otra hoja frente al detector en una cámara de muestras de espectrofotómetro UV vis. En el software del espectrofotómetro, seleccione un espectro de 900 a 1.600 nanómetros. Realice el escaneo y registre el valor de transmisión en función de la curva espectral.A continuación, sujete la hoja detrás del detector y repita el escaneo. Determine el valor de reflexión a partir de la curva espectral. Obtener mediciones de transmisión y reflexión de al menos tres muestras de hojas.Para comenzar, monte un láser de diodo de infrarrojo cercano de una sola barra acoplado a fibra de 1.550 nanómetros en el cono. A continuación, fije una lente biconvexa con una distancia focal de 25,4 milímetros en el extremo del cono. Sujete un cono de 25,4 milímetros de diámetro con un soporte de acero inoxidable a un soporte de laboratorio.Coloque un filtro de densidad neutra con una densidad óptica de 1,0 en una placa cerámica de 22 milímetros de espesor sobre el censor para atenuar el rayo láser. Monta un sensor de potencia de fotodiodo a 354 milímetros por debajo de la parte inferior de la lente. Conecte el sensor de potencia del fotodiodo a un osciloscopio.Coloque un marco de 10 centímetros por 10 centímetros con un área de exposición de muestra de seis centímetros por seis centímetros a 308 milímetros por debajo de la lente. Monte el detector a 135 milímetros por encima del atenuador cerámico. Conecte un detector de infrarrojo cercano a una computadora y prepare el software.Coloque una placa absorbente en la hoja y encienda el láser. Ajuste el ángulo del detector a 45 grados en relación con el rayo láser. Continúe ajustando el ángulo y la altura del detector hasta que se observe la lectura de temperatura máxima.En el software de control láser, seleccione control de potencia. Ajuste la potencia del láser de salida a cinco vatios y la duración del pulso a 0,5 segundos. Para comenzar las mediciones, lleve una planta entera al aparato de medición o coseche hojas individuales enteras y sin daños.Monte inmediatamente la muestra de hoja en el marco, teniendo cuidado de no dañar la hoja. No permita que la hoja entre en contacto con el atenuador cerámico. En el software de infrarrojo cercano, inicie una nueva medición de 60 segundos.Registre el perfil de temperatura de referencia durante 10 segundos antes de activar un solo pulso láser de 0,5 segundos. Continúe registrando datos durante los 49,5 segundos restantes. Cuando se complete la medición, haga clic en el botón de parada sobre el perfil térmico y luego guarde el perfil.Exporte los datos brutos de tiempo y temperatura como un archivo dot dat para su posterior análisis. Luego, en el software del osciloscopio, determine las alturas de los flancos en el perfil de voltaje, que se recopilaron automáticamente durante el pulso láser. Repita la medición del perfil de temperatura con un solo pulso láser de 0,5 segundos para cada muestra.A continuación, repita la medición de la señal láser sin una muestra de hoja como referencia. Determine las alturas de los flancos a partir de este perfil de voltaje y calcule los valores de transmisión para cada muestra. Utilice software de hoja de cálculo para calcular y graficar la capacidad calorífica específica y la conductividad térmica de las muestras.Con este método se analizaron muestras de hojas individuales de las especies vegetales Nicotiana tabacum, conocida como tabaco, y Nicotiana benthamiana. Ambas especies mostraron un rápido aumento a la temperatura máxima en menos de un segundo en respuesta al pulso láser, seguido de una disminución exponencial a la temperatura ambiente. Los valores de capacidad calorífica específica y conductividad térmica se calcularon para ambas especies a partir de hojas recolectadas en la parte inferior, media y superior de la planta.Se observó un aumento en la conductividad térmica para las hojas más arriba de la planta para ambas especies, sin embargo, Nicotiana tabacum mostró una tendencia inversa en la capacidad calorífica específica. No se observó correlación entre la duración del cultivo y la conductividad térmica en Nicotiana tabacum. Además, no se observó correlación entre las condiciones de cultivo y las propiedades térmicas en Nicotiana benthamiana.Se examinó el efecto de las variables individuales sobre la capacidad calorífica específica y la conductividad térmica. La conductividad térmica de Nicotiana benthamiana fue altamente sensible a la temperatura ambiente. La capacidad calorífica específica no fue significativamente sensible a ninguno de los parámetros implicados en su cálculo.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unos pocos minutos por muestra si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar montar correctamente la hoja con la precisión dada para garantizar mediciones de alta calidad y resultados reproducibles. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las mediciones de fluorescencia, para responder a preguntas adicionales, como la expresión de proteínas recombinantes.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biotecnología vegetal exploraran el crecimiento de las plantas en las especies de Nicotiana. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo determinar la capacidad calorífica específica y la conductividad térmica de las hojas de manera no destructiva y sin contacto. No olvide que trabajar con láseres puede ser peligroso para sus ojos y siempre se deben tomar precauciones, como usar las gafas de seguridad adecuadas, mientras se realiza este procedimiento.

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Biochemistry

Bioquímica

Se describe un método relativamente rápido (30 min) y al mismo tiempo realista para la medición de la conductancia hidráulica de hoja...

Medición de conductancia de la hoja hidráulica y la conductancia estomática y sus respuestas a la irradiación y la deshidratación mediante el método de evaporación Flux (EFM)

Formación de complejos de proteínas in vivo puede ser visualizado por complementación de fluorescencia bimolecular. Parejas de interacción se fusionan a partes complementarias de etiquetas fluorescentes y expresados ​​transitoriamente en hojas de tabaco, lo que resulta en una señal fluorescente reconstituido en una estrecha proximidad de las dos proteínas.

Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

thenoyltrifluoroacetonate europio (EuTFC) tiene una línea de luminiscencia óptica a 612 nm, cuya eficiencia de activación disminuye fuertemente con la temperatura. Si una muestra revestida con una película fina de este material es-micro fotografiado, la intensidad de la respuesta luminiscente nm 612 se puede convertir en un mapa directa de temperatura de la superficie de la muestra.

-Alta resolución de imagen térmica micro-El uso de quelato de europio luminiscente Revestimientos

Aquí se introduce una configuración experimental original para calentar células en un plato de cultivo usando radiación de láser de onda continua de 1,94 μm. Utilizando este método, se pueden investigar las respuestas biológicas de las células epiteliales del pigmento retiniano (RPE) después de diferentes exposiciones térmicas.

Láser de Thulium de onda continua para calentar las células cultivadas para investigar los efectos térmicos celulares

Este método tiene como objetivo localizar defectos verticales subsuperficiales. Aquí, unimos un láser con un modulador espacial de luz y activamos su entrada de video para calentar una superficie de muestra de forma determinista con dos líneas moduladas anti-fase mientras adquirimos imágenes térmicas altamente resueltas. La posición de defecto se recupera de la evaluación de los mínimos de interferencia de ondas térmicas.

Localización del defecto subsuperficial mediante calentamiento estructurado mediante termografía fototérmica proyectada con láser

Espectrometría de masas en aerosol foliar es una técnica de análisis químico directo que reduce al mínimo la preparación de la muestra y elimina la cromatografía, permitiendo la detección rápida de pequeñas moléculas de los tejidos vegetales.

Espectrometría de masa de hoja aerosol: Una técnica rápida ionización ambiental evaluar directamente los metabolitos de los tejidos vegetales

Una estimación precisa del índice de área de hoja (LAI) es crucial para muchos modelos de flujos de material y energía dentro de los ecosistemas de la planta y entre un ecosistema y la capa límite atmosférica. Por lo tanto, tres métodos (trampas de basura, técnica de aguja y PCA) para tomar mediciones precisas de LAI estaban en el protocolo presentado.

Estimación del índice de área hoja utilizando tres métodos distintos en soportes caducifolios puros

Los flujos de carbono en la criosfera apenas se evalúan, pero son cruciales con respecto al cambio climático. Aquí mostramos un nuevo prototipo de dispositivo que captura el potencial fototrófico en entornos supraglaciales basados en la tecnología de emisión de fluorescencia inducida por láser (L.I.F.E.) que ofrece datos de alta resolución espectral y espacial en condiciones in situ.

Emisión de Fluorescencia Inducida por Láser (L.I.F.E.) como Novedosa Herramienta No Invasiva para Mediciones In-Situ de Biomarcadores en Hábitats Criosféricos

La estimación rápida y precisa del índice de área foliar (LAI) en los ecosistemas terrestres es crucial para una amplia gama de estudios ecológicos y calibración de productos de teledetección. Aquí se presenta el protocolo para el uso del nuevo dispositivo óptico LP 110 para tomar mediciones LAI in situ basadas en tierra.

Medición de campo del índice de área foliar efectiva utilizando un dispositivo óptico en el dosel de vegetación

Este artículo presenta la técnica de Termoreflectancia en el Dominio de la Frecuencia (FDTR) para la caracterización y obtención de imágenes térmicas no destructivas locales.

La técnica de termoreflectancia en el dominio de la frecuencia para mediciones de propiedades térmicas

Aprende a determinar propiedades térmicas de hojas sin contacto mediante sonda láser infrarrojo cercano. Este método rápido mide capacidad calorífica y conductividad térmica en Nicotiana tabacum sin dañar la muestra.

Un láser de sondeo rápido método facilita la determinación no invasiva y sin contacto de la hoja de Propiedades Térmicas

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