Name: Medición de diferencialmente metilado INS Especies de ADN en muestras de suero humano como un biomarcador de la muerte celular de islotes β (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Aprende a medir especies de ADN de preproinsulina diferencialmente metiladas en suero humano como biomarcador de muerte de células β mediante PCR digital. Este método permite detectar la muerte celular en volúmenes mínimos de muestra.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención UC4 de los Institutos Nacionales de Salud DK104166 (a RGM). Deseamos agradecer la asistencia del Centro de Traducción del Centro de Investigación de la Diabetes de Indiana, respaldado por la subvención P30 DK097512 de los Institutos Nacionales de Salud.

Declaración de ética: Los protocolos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Indiana. Los padres de los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito, y los niños mayores de 7 años dieron su consentimiento para su participación.
1. Procesamiento del suero
NOTA: El ensayo descrito se ha probado rigurosamente utilizando suero humano aislado de la siguiente manera.
<ol>
	<li>Recoja la sangre en un tubo de extracción de sangre con tapa roja (sin aditivo; sin recubrimiento).</li>
	<li>Deje reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que se forme el coágulo.</li>
	<li>Tubo de centrífuga a 2.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Transfiera el sobrenadante (suero) a un nuevo tubo designado para el almacenamiento de suero (tubos de polipropileno con tapa de rosca, el tamaño depende de las muestras).</li>
	<li>Almacenar las muestras a -80 ºC hasta que estén listas para el aislamiento del ADN.</li>
</ol>
2. Extracción de ADN sérico
NOTA: El ADN se extrae con un kit de extracción de ADN utilizando 50 μl de suero (recomendado), siguiendo el protocolo del fabricante con algunas modificaciones.
<ol>
	<li>Prepare 200 μl de tampón de lisis + 1 μl de poli(A) (5 μg) por muestra en un tubo de microcentrífuga. Vórtice durante 15 s. Dejar a un lado hasta el paso 2.3.</li>
	<li>Extraer muestras de suero del congelador a -80 ºC y descongelar a temperatura ambiente. Aumentar el volumen de la muestra de suero hasta 200 μl en total utilizando solución salina tamponada con fosfato (PBS, con cloruro de calcio y cloruro de magnesio).</li>
	<li>Lisar la muestra añadiendo 20 μl de proteasa (1,4 unidades de Anson/ml) a la muestra, seguido de 200 μl de tampón de lisis/mezcla de poliA (del paso 2.2) y vórtice durante 8 segundos. Incubar la muestra a 56 °C durante 10 minutos, luego centrifugar brevemente durante 7 segundos a máxima velocidad en una microcentrífuga (>10.000 x g).</li>
	<li>Precipite el ADN añadiendo 230 μl de etanol al 100% a la muestra y al vórtice durante 8 segundos. Centrifugar brevemente durante 7 segundos a velocidad máxima (>10.000 x g).</li>
	<li>Aplique el ADN a la columna de centrifugado añadiendo una mezcla de muestra de 600 μl a la mini columna de centrifugación. Centrifugar a 6.000 x g durante 1 min. Deseche el flujo y coloque la columna en un tubo limpio.</li>
	<li>Lave el ADN añadiendo 500 μl de tampón de lavado 1 a la columna. Centrifugar a 6.000 x g durante 1 min. Deseche el flujo y coloque la columna en un tubo limpio. Añadir 500 μl de tampón de lavado 2 a la columna y centrifugar a máxima velocidad (>10.000 x g) durante 3 min. Coloque la columna en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y vuelva a centrifugar a máxima velocidad durante 1 min.</li>
	<li>Eluir el ADN colocando la columna en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añadiendo 60 μl de tampón de elución directamente sobre el filtro. Es importante cambiar las puntas entre muestras para evitar la contaminación cruzada. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos, luego centrifugar a 6.000 x g durante 1 minuto. Añadir otros 60 μl de tampón de elución y centrifugar a 6.000 x g durante 1 min. </li>
	<li>Almacene el ADN a -20 ºC para su uso posterior, o proceda inmediatamente a la conversión de bisulfito.</li>
</ol>
3. Conversión de bisulfito
NOTA: La conversión de bisulfito se realiza utilizando un kit de conversión de bisulfito, siguiendo el protocolo del fabricante con algunas modificaciones.
<ol>
	<li>Para convertir citosinas no metiladas en uracilos, agregue 130 μl de reactivo de conversión de bisulfito a 20 μl de ADN del paso 2.7 en un tubo de PCR (tubo de PCR de 0,2 ml o tubos de PCR de 8 tiras). Guarde los 40 μl restantes de ADN para su uso futuro o para utilizarlos en reacciones replicadas. Mezcle 20 veces pipeteando hacia arriba y hacia abajo y centrifugue brevemente para asegurarse de que no haya gotas en los lados o en la tapa. Incubar en un baño de agua o termociclador de la siguiente manera: 98 °C durante 8 min, 54 °C durante 60 min, 4 °C durante 5 min.
	<ol>
		<li>Continúe con el paso 3.2 o almacene a 4 °C durante un máximo de 20 horas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Añada 600 μl de tampón aglutinante a la columna de centrifugado y colóquela en el tubo de recogida suministrado. Aplique el ADN bisulfitado a la columna y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Centrifugar a máxima velocidad (>10.000 x g) durante 30 seg. Deseche el flujo.</li>
	<li>Lave el ADN añadiendo 100 μl de tampón de lavado a la columna y centrifuga a máxima velocidad (>10.000 x g) durante 30 segundos.</li>
	<li>Realice la desulfonación para eliminar el grupo sulfonato y finalizar la conversión de citosinas no metiladas en uracilo agregando 200 μl de tampón de desulfonación a la columna. Deje reposar a temperatura ambiente durante 20 minutos, luego centrifugue a velocidad máxima (>10,000 x g) durante 30 segundos.</li>
	<li>Lave el ADN añadiendo 200 μl de tampón de lavado a la columna y centrifuga a máxima velocidad durante 30 segundos. Deseche el flujo y repita este paso de lavado.</li>
	<li>Coloque la columna en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Eluya el ADN añadiendo 10 μl de tampón de elución directamente al filtro de columna. Incubar durante 1 min. Centrífuga durante 30 s a toda velocidad para eluir el ADN. Cuantificar el ADN recuperado por espectrofotometría en A260. 
	NOTA: El ADN detectado por espectrofotometría representa principalmente el ADN poliA portador que se agregó en el paso 2.3 anterior. Normalmente, la recuperación de poliA es el ≥85% de la entrada (>4,25 μg).</li>
	<li>Almacene el ADN a -20 °C hasta que esté listo para proceder con la PCR digital.</li>
</ol>
4. PCR digital multiplexada
<ol>
	<li>Hacer una mezcla maestra con suficiente solución para cada muestra y control. Incluya al menos una muestra que contenga agua (control negativo), una muestra de un plásmido que contenga INS no metilado (1 pg, control positivo), una muestra de plásmido que contenga INS metilado (1 pg, control positivo) y una muestra que contenga una mezcla 1:1 de plásmidos.
	<ol>
		<li>Para preparar la mezcla maestra de PCR, agregue 12,5 μl por reacción de tampón de PCR (p. ej., 125 μl por 10 muestras), 1,25 μl por mezcla de cebador/sonda de reacción (p. ej., 12,5 μl por 10 muestras), 8,25 μl por agua de reacción (p. ej., 82,5 μl por 10 muestras), 0,5 μl por reacción de la enzima EcoR1 (p. ej., 5 μl por cada 10 muestras). 
		NOTA: Los cebadores y sondas utilizados aquí son los siguientes: Imprimación directa: 5'-GGAAATTGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGT-3'; Imprimación inversa: 5'-AAAACCCATCTCCCCTACCTATCA-3'; Sonda FAM: FAM-5'-ACCCCTACCACCTAAC-3'-MGB; Sonda VIC: VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Configure la reacción de PCR multiplex en una placa de 96 pocillos. Agregue 19,5 μl de mezcla maestra a cada pocillo. Agregue 2,5 μl de muestra de ADN convertido en bisulfito en cada pocillo apropiado (guarde los 7,5 μl restantes de ADN convertido en bisulfito o utilícelos en reacciones replicadas). Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. 
	NOTA: Los 8 pocillos seguidos deben contener control de muestra o tampón.</li>
	<li>Selle con un sello de aluminio usando un sellador de placas y centrifugue en un centrifugador de placas hasta que no haya líquido en los lados de los pocillos.</li>
	<li>Configure el generador automático de gotas en la pantalla táctil. 
	NOTA: Los 8 pocillos del cartucho deben contener control de muestra o tampón.
	<ol>
		<li>Establezca el número de filas que se utilizan tocando las filas en las que se cargan las muestras en la placa de 96 pocillos del paso 4.2 y resalte la fila en azul para indicar una fila activa.</li>
		<li>Cargue los consumibles de atrás hacia adelante para evitar la contaminación. Para comenzar, agregue cartuchos a lo largo de la fila posterior del instrumento. Cargue las puntas en la fila central del instrumento. 
		NOTA: Los cartuchos solo pueden caber en los soportes en la orientación correcta.</li>
		<li>Coloque la placa de 96 pocillos en el instrumento. Retire un bloque frío del congelador a -20 °C y coloque en él una nueva placa con faldón de 96 pocillos. Colóquelo dentro del instrumento junto a la placa de 96 pocillos cargada con muestra.</li>
		<li>Agregue aceite al dispensador en la parte delantera del instrumento. Seleccione el tipo de aceite en la pantalla táctil.</li>
		<li>Toque el botón azul de inicio para iniciar la carrera. Confirme la configuración de la placa y toque el botón de inicio de ejecución para comenzar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Una vez que haya terminado, retire la placa de 96 pocillos que contiene las gotas recién formadas y selle con un sello de aluminio con un sellador de placas.</li>
	<li>Realice PCR10 en un termociclador utilizando el siguiente programa: 95 °C durante 10:00 min; 40 ciclos a: 94 °C durante 00:30 min, 57,5 °C durante 01:00 min; 98 °C durante 10:00 min; 12 °C durante 10 min o hasta 24 h.</li>
	<li>Coloque la placa en el lector de gotas y configure el lector.
	<ol>
		<li>Haga clic en la pestaña de configuración. Abra una nueva plantilla haciendo clic en plantilla > nueva. Introduzca un nombre de archivo.</li>
		<li>Utilice el editor de pocillos para establecer los parámetros de cada muestra. Asigne un nombre único a cada muestra, establezca el experimento en Detección de eventos raros (R-RED) y establezca la mezcla maestra en la mezcla utilizada en el paso 4.1.</li>
		<li>Asigne un nombre al objetivo 1 (es decir, sin metilar) y establezca el objetivo 1 como desconocido (U). Asigne un nombre al objetivo 2 (es decir, metilado) y establezca el objetivo 2 como referencia (R).</li>
		<li>Haga clic en la pestaña Ejecutar para iniciar la ejecución. En la ventana de opciones de ejecución, seleccione la química de detección (FAM/VIC).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Análisis de datos
<ol>
	<li>Abra los resultados en la pestaña Analizar y analice utilizando un gráfico 2D basado en controles positivos (consulte la Figura 1).</li>
	<li>Exporte el archivo CSV generado por el lector de gotas a un programa de hoja de cálculo para el análisis de datos.</li>
	<li>Para generar "copias por μl" de suero, use la fórmula: (concentración * 250) / (volumen de suero utilizado para el aislamiento de ADN en μl). 6 
	NOTA: Por lo general, los datos se convierten enlog 10 cuando se adquieren del suero humano para garantizar una distribución normal. Alternativamente, los datos pueden trazarse en una escala logarítmica10 y analizarse mediante estadísticas no paramétricas.</li>
</ol>
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</style>

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<li>Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+islet+%CE%B2-cell+death+in+vivo+by+multiplex+PCR+analysis+of+differentially+methylated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA.</a> Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).</li>
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<li>Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation-specific+PCR+unraveled%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Methylation-specific PCR unraveled.</a> Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).</li>
<li>Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+methylation-specific+polymerase+chain+reaction+method+for+monitoring+beta+cell+death+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes.</a> PloS One. 7 (10), 47942(2012).</li>
<li>Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Droplet+Digital+PCR+System+for+Absolute+Quantitation+of+DNA+Copy+Number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.</a> Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Sozzi, G., Roz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+storage+of+whole+plasma+or+isolated+plasma+DNA+on+the+results+of+circulating+DNA+quantification+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays.</a> J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La metilación de las citosinas por metiltransferasas de ADN permite el control epigenético de la transcripción en muchos genes. El gen INS en los seres humanos se expresa casi exclusivamente en los islotes β células, y no parece haber una correlación entre la frecuencia de metilación de citosinas en el gen INS para silenciamiento de su transcripción 11. Como tal, la mayoría de tipos de células muestran frecuencias sustancialmente más altos de metilación del gen INS en varias citosin...

La diabetes de tipo 1 (T1D) es una enfermedad autoinmune que se caracteriza por la destrucción de los islotes productoras de insulina por las células β células T autorreactivas 1. El diagnóstico de la diabetes tipo 1 se hace típicamente en la medición de (glucemia&gt; 200 mg / dl) la hiperglucemia en un individuo joven magra, que podría presentar con cetoacidosis como evidencia de la deficiencia de insulina. En el momento del diagnóstico de T1D, hay evidencia de una pérdida sustancial de la función de células β y la masa (de 50 - 90%) 2. En estudios clínicos, varios fármacos moduladores inmunes que fueron instituidas en el momento del diagnóstico como resultado la estabilización de la función de las células β (y, presumiblemente, la masa), pero ninguno ha dado lugar a la remisión clínica de la enfermedad, un hallazgo que ha levantado la llamada para el desarrollo de biomarcadores para la detección precoz de la enfermedad y para el seguimiento longitudinal de la efectividad de las terapias de combinación 3,4. Los esfuerzos de los consorcios internacionales, como unaEs la Red de Investigación Consorcio de islotes humanos en los Institutos Nacionales de Heath 5, han hecho hincapié en la necesidad de desarrollar biomarcadores que se centran en el estrés celular β y la muerte en la DM1. En línea con estos esfuerzos, nuestro grupo y otros han desarrollado recientemente ensayos de biomarcadores que miden la circulación, fragmentos de ADN epigenetically modificados que se derivan principalmente de las células que mueren beta 6 - 9. En todos los ensayos publicados hasta la fecha, la atención se ha centrado en la cuantificación del gen humano que codifica la preproinsulina (INS), lo que demuestra un mayor grado de sitios CpG no metilados en las regiones codificantes y promotores en comparación con otros tipos de células. La liberación de fragmentos de ADN INS no metilados se planteó la hipótesis de que surja principalmente de la muerte (necrosis, apoptosis) las células beta. Nuestros estudios recientes demostraron que en la juventud, las elevaciones en el ADN INS tanto metilado y no metilado en la posición -69 pb (con relación al tél inicio de la transcripción sitio) se observaron en nueva aparición de diabetes tipo 1, y juntos sirvió como biomarcadores específicos para esta población 6. Estos ensayos de biomarcadores implican el aislamiento de ADN libre de células a partir de suero o plasma usando kits comerciales de giro, seguido de una conversión de bisulfito del ADN aislado (para convertir las citosinas no metiladas a uracilos, dejando citosinas metiladas intacta). En este informe, se describen los aspectos técnicos de la recogida de muestras de suero, el aislamiento de ADN libre de células a partir de suero, la conversión de bisulfito, y el rendimiento de la PCR digital de la gotita (en adelante, digital PCR) para el ADN metilado diferencialmente INS.

<table><tbody><tr><td>Vacutainer de tapa roja&nbsp;</td><td>Beckon Dickinson</td><td>366441</td><td>sin aditivo, interior sin recubrimiento, 10 ml</td></tr><tr><td>Tubo criovial</td><td>Simport</td><td>T310-3A</td><td>polipropileno, tubo con tapón de rosca, cualquier tamaño</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51106</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A)</td><td>Sigma</td><td>P9403</td><td>desencantado en tampón TE (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) a 5 &micro; g/&micro; l&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol absoluto (200 pruebas)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (con CaCl2 y MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml PCR 8-strip Tubos</td><td>MidSci</td><td>AVST</td><td></td></tr><tr><td>8-strip Caps, Dome</td><td>MidSci</td><td>AVSTC-N</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Methylation-Lightning Kit</td><td>Zymo</td><td>D5031</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix para sondas (sin dUTP)</td><td>Biorad</td><td>1863024</td><td></td></tr><tr><td>control de tampón para sondas</td><td>Biorad</td><td>1863052</td><td></td></tr><tr><td>mezcla de cebador/sonda humana no metilada/metilada</td><td>Life Technologies</td><td>AH21BH1</td><td></td></tr><tr><td>EcoR1 New</td><td>England Biolabs</td><td>R0101L</td><td></td></tr><tr><td>twin.tec PCR Plate 96, semifaldón</td><td>Eppendorf</td><td>951020346</td><td></td></tr><tr><td>Sellado térmico de lámina perforable</td><td>Biorad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>PX1 Sellador de placas</td><td>PCR Biorad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QX200 AutoDG Sistema de PCR digital de gotas</td><td>AutoDG Biorad</td><td>1864101</td><td></td></tr><tr><td>Generación automatizada de gotas Aceite para sondas</td><td>Biorad</td><td>186-4110</td><td></td></tr><tr><td>DG32 Cartucho para generador de gotas automatizado</td><td>Biorad</td><td>186-4108</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta para generador de gotas automatizado</td><td>Biorad</td><td>186-4120</td><td></td></tr><tr><td>Contenedores de puntas de pipeta para generador de gotas automatizado</td><td>Biorad</td><td>186-4125</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Termociclador</td> táctil <td>Biorad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Lector de gotas Biorad</td><td></td><td>186-4003</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Aceite Lector de gotas</td><td>Biorad</td><td>186-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

medición de diferencialmente metilado<em&gt; ins</em&gt; especies de adn en muestras de suero humano como un biomarcador de la muerte celular de islotes β

Measurement of Differentially Methylated INS DNA Species in Human Serum Samples as a Biomarker of Islet &#946; Cell Death

Se cree que la muerte de las células de los β de los islotes subyace a la patogénesis de prácticamente todas las formas de diabetes y precede al desarrollo de una hiperglucemia franca, especialmente en la diabetes tipo 1. El desarrollo de biomarcadores sensibles y fiables de la muerte celular β puede permitir una intervención terapéutica temprana para prevenir o retrasar el desarrollo de la diabetes. Recientemente, varios grupos, incluido el nuestro, han informado que el ADN libre de células y diferencialmente metilado que codifica preproinsulina (INS) en la circulación se correlaciona con la muerte de células β en la diabetes pretipo 1 y la diabetes tipo 1 de nueva aparición. Aquí, presentamos un protocolo paso a paso que utiliza PCR digital para la medición del ADN INS libre de células que se metila diferencialmente en la citosina en la posición -69 pb (en relación con el sitio de inicio transcripcional). Demostramos que el ensayo puede distinguir entre citosina metilada y no metilada en la posición -69 pb, es lineal en varios órdenes de magnitud, proporciona una cuantificación absoluta del número de copias de ADN y se puede aplicar a muestras de suero humano de individuos con diabetes tipo 1 de nueva aparición y controles libres de enfermedad. El protocolo descrito aquí se puede adaptar a cualquier especie de ADN para la que se desee la detección de citosinas metiladas diferencialmente, ya sea a partir de la circulación o de células y tejidos aislados, y puede proporcionar una cuantificación absoluta de fragmentos de ADN.

Para interpretar los datos de forma adecuada, utilizamos plásmido controles tanto para el ADN diana INS no metilado y no metilado en cada PCR plazo digital. Estos controles aseguran que las señales correspondientes a ADN metilado y no metilado son claramente distinguibles. La Figura 1 muestra los gráficos de dispersión 2-D correspondientes a las gotas para los controles de plásmido que contienen bisulfito convertido no metilada de ADN INS (Figur...

la muerte de las células β de los islotes precede al desarrollo de la diabetes tipo 1, y la detección de este proceso puede permitir una intervención terapéutica temprana. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de cómo medir las especies de ADN INS metiladas diferencialmente en suero humano como biomarcador de la muerte celular β.

Medición de diferencialmente metilado<em&gt; INS</em&gt; Especies de ADN en muestras de suero humano como un biomarcador de la muerte celular de islotes β

The death of islet &#946; cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank ...

El objetivo general de este procedimiento es medir especies de ADN de preproinsulina diferencialmente metiladas en suero humano como biomarcador de la muerte de células beta. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la diabetes, como, ¿ocurre la muerte de células beta en un momento determinado durante el desarrollo de la diabetes tipo uno? La principal ventaja de esta técnica es que, al utilizar la PCR digital, podemos determinar la cantidad de muerte de células beta en cantidades muy pequeñas de suero.Después de recolectar suero de muestras de sangre humana según el protocolo descrito, prepare 200 µL de tampón de lisis y 1 µL de poli(A) por muestra en un tubo de microcentrífuga. Vortexee el tubo durante 15 segundos. Retire las muestras de suero del congelador a -80 °C y déselas a temperatura ambiente.Luego, utilice PBS para llevar el volumen de la muestra de suero hasta 200 microlitros. Lise las muestras añadiendo 20 microlitros de proteasa y 200 microlitros del tampón de lisis poly(A)mix. Vortexee los tubos durante ocho segundos e incube las muestras a 56 grados Celsius durante 10 minutos.Luego, centrifugue los tubos a velocidad máxima durante siete segundos. Precipite el ADN añadiendo 230 microlitros de etanol al 100 % a las muestras y vortexee los tubos durante ocho segundos. A continuación, centrifugue los tubos a velocidad máxima durante siete segundos.A continuación, aplique 600 microletros de las mezclas de muestra a columnas de centrifugación y centrifugue las columnas a 6000 ×g durante un minuto. Deseche el flujo atravesante y coloque las columnas en tubos limpios. Añada 500 microletros del tampón de lavado uno a las columnas y centrifugue las muestras a 6000 ×g durante un minuto.Luego, deseche el flujo pasante y coloque las columnas en tubos limpios. Añada 500 microletros del tampón de lavado dos a las columnas y centrifúgelas a velocidad máxima durante tres minutos. A continuación, coloque las columnas en nuevos tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros y centrifúgelos nuevamente durante un minuto.Para eluir el ADN, coloque las columnas en nuevos tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros y agregue 60 microlitros de tampón de elución directamente sobre los filtros. Después de incubar las columnas a temperatura ambiente durante cinco minutos, centrifugue las muestras a 6000 × g durante un minuto. Deseche la columna y almacene las muestras hasta que estén listas para la conversión con bisulfito.Para convertir citosinas no metiladas en uracilos, agregue 130 µL de reactivo de conversión con bisulfito a 20 µL de ADN en tubos para PCR. Mezcle las muestras 20 veces pipeteando arriba y abajo, y centrifugue brevemente los tubos para asegurarse de que no queden gotas en las paredes ni en la tapa. Incube las muestras en un baño de agua o en un termociclador como se indica aquí.Coloque las columnas en los tubos de recolección proporcionados y añada 600 microlitros de tampón de unión a las columnas de centrifugación. Aplique el ADN bisulfitado a las columnas y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Luego, centrifugue las muestras a máxima velocidad durante 30 segundos y deseche el flujo atravesante.A continuación, agregue 100 microletros de tampón de lavado a la columna y centrifugue durante 30 segundos. Luego, para eliminar los grupos sulfinito y finalizar la conversión de citosinas no metiladas a uracilo, agregue 200 microletros de tampón de desulfinación a las columnas. Después de dejar reposar las muestras a temperatura ambiente durante 20 minutos, centrifugue las columnas durante 30 segundos.Lave el ADN añadiendo 200 microlitros de tampón de lavado a las columnas y centrifugue durante 30 segundos. Luego, deseche el flujo pasante y repita el paso de lavado. Coloque las columnas en tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros y eluya el ADN añadiendo 10 microlitros de tampón de elución directamente sobre los filtros de las columnas.Incube las muestras durante un minuto, luego centrifúgelas durante 30 segundos para eluir el ADN. Deseche las columnas y almacene las muestras. Cuantifique el ADN recuperado mediante espectrofotometría a una absorbancia de 260 nanómetros.Prepare una mezcla maestra con suficiente solución para cada muestra y control. Incluya al menos una muestra que contenga agua, una muestra de plásmido que contenga insulina no metilada y una muestra que contenga una mezcla uno a uno de plásmidos. Configure reacciones de PCR múltiple en una placa de 96 pocillos añadiendo primero 19,5 µL de la mezcla maestra a cada pocillo.Añada 2,5 microlitros de la muestra de ADN convertido con bisulfito en los pozos correspondientes. Luego, mezcle los pozos pipeteando arriba y abajo varias veces. Utilice papel de aluminio y un sellador de placas para sellar la placa y céntrela en un centrifugador para placas hasta que no quede líquido en las paredes de los pozos.Para configurar el generador automático de gotas en la pantalla táctil, establezca el número de filas que se van a utilizar tocando las filas en las que se cargan las muestras en los pocillos de la placa. Para evitar contaminación, cargue los materiales desechables de atrás hacia adelante, comenzando con los cartuchos a lo largo de la fila trasera del instrumento. Luego, cargue las puntas en la fila central.A continuación, coloque la placa de 96 pocillos en el instrumento. Luego, tras retirar un bloque frío del congelador a menos 20 grados Celsius, coloque una nueva placa de 96 pocillos con borde en el bloque. Introduzca el bloque con la placa en el instrumento, junto a la placa con las muestras.Agregue aceite al dispensador delantero del instrumento y seleccione el tipo de aceite en la pantalla táctil. Toque el botón azul Iniciar para comenzar la corrida. Luego, confirme la configuración de la placa y toque el botón Iniciar Corrida para empezar.Una vez finalizada la corrida, retire la placa de 96 pocillos que contiene las gotas recién formadas y utilice un sellador de placas para sellarla con papel de aluminio. A continuación, realice la PCR en un termociclador utilizando el siguiente programa. Coloque la placa en el lector de gotas y configure el lector haciendo clic en la pestaña Configuración.A continuación, abra una nueva plantilla haciendo clic en Plantilla Nueva. Utilice el editor de pocillos para establecer los parámetros de cada muestra. Asigne a cada muestra un nombre único.Configure el experimento para Detección de Eventos Raros y establezca la mezcla maestra como la mezcla utilizada para preparar la reacción. Asigne un nombre al Objetivo 1, por ejemplo No Metilado, y defina el Objetivo 1 como desconocido, o U. Asigne un nombre al Objetivo 2, por ejemplo Metilado, y defina el Objetivo 2 como referencia, o R. Haga clic en la pestaña Ejecutar para iniciar la corrida e introduzca un nombre de archivo. Luego, en la ventana Opciones de Ejecución, seleccione la química de detección.Para analizar los datos, abra los resultados en la pestaña Analizar y utilice el gráfico 2D basado en los controles positivos para analizar los datos. Esta figura muestra los gráficos de dispersión 2D correspondientes a las gotas para los controles de plásmido, que contienen ADN de insulina convertido con bisulfito y no metilado, ADN de insulina metilado, y una mezcla uno a uno de los dos plásmidos. Observe que en este panel hay un ligero desplazamiento de las gotas positivas para FAM hacia el canal VIC, lo que indica la sonda para el ADN de insulina metilado.De manera similar, se observa un desplazamiento muy leve de las gotas positivas para VIC en el canal FAM, lo que indica una reactividad cruzada de la sonda para el ADN no metilado con el ADN metilado. Para demostrar la linealidad de los cebadores, se utilizaron mezclas de los dos plásmidos en varios órdenes de magnitud en las reacciones de PCR. Como se muestra aquí, se puede detectar linealmente concentraciones variables de un plásmido en presencia de una cantidad constante del segundo plásmido.En esta figura, se analizaron muestras de cuatro individuos con diabetes tipo uno de reciente aparición y cuatro muestras de control sin diabetes tipo uno. Los datos muestran que los individuos con diabetes tipo uno presentan niveles elevados de ADN de insulina tanto sin metilar como metilado en comparación con los controles, tal como se ha demostrado previamente. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en ocho horas para 30 muestras si se lleva a cabo correctamente.Al realizar este procedimiento, es importante recordar evitar la contaminación durante todos los pasos. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la diabetes exploraran el uso de esta técnica como biomarcador para el desarrollo de la diabetes tipo uno. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar la cantidad de muerte de células beta mediante la medición de preproinsulina no metilada y metilada en el ADN libre de células del suero humano.No olvide que trabajar con tampones de extracción de ADN puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como usar guantes y una bata de laboratorio, y no utilizar agentes desinfectantes que contengan lejía, durante la realización de este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Mediadas por células linfocitotoxicidad (LMC) los ensayos se pueden utilizar para evaluar las respuestas autorreactivas y los mecanismos de estudio de la muerte celular in vitro. Sin embargo, utilizando células vivas, las técnicas de microscopía confocal microscópicos con tintes fluorescentes, el tipo y la cinética de muerte celular, así como las rutas utilizadas se pueden estudiar con mayor detalle.

Métodos para evaluar la Beta mediada por la muerte celular por linfocitos T citotóxicos

Este video muestra la detección por electroquimioluminiscencia de autoanticuerpos de islotes en suero humano. Los anticuerpos en el suero conectan el antígeno conjugado con rutenio con el antígeno de captura biotinilado, formando complejos que se detectan mediante mediciones de electroquimioluminiscencia.

Detección de autoanticuerpos de islotes humanos mediante un ensayo de electroquimioluminiscencia

Microdisección por láser es una técnica que permite la recuperación de células seleccionados a partir de cantidades mínimas de parénquima. Aquí se describe un protocolo para la obtención islotes pancreáticos humanos a partir de especímenes quirúrgicos para su uso para transcriptomic estudios. Nuestro protocolo mejora la autofluorescencia intrínseca de las células beta humanas, lo que facilita su recogida.

Protocolo mejorado para microdisección láser de islotes pancreáticos humanos a partir de muestras quirúrgicas

Presentamos aquí un protocolo para el aislamiento de islotes del modelo de ratón de diabetes tipo 2, Leprdb y detalles de un ensayo de células vivas para la medición de la secreción de insulina de islotes intactos que utiliza microscopía de 2 fotones.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modelo de ratón de la Diabetes Tipo 2: El aislamiento de los islotes pancreáticos y células en Vivo 2-Photon imágenes de islotes intactos

Aquí, presentamos los métodos para la detección de autoanticuerpos del islote humano usando análisis electrochemiluminescence (ECL). El protocolo, utilizado para predecir la diabetes tipo 1, se puede ampliar a detectar autoanticuerpos para otras enfermedades autoinmunes.

Electrochemiluminescence ensayos para autoanticuerpos islote humano

Ex vivo islote pancreático estudios son importantes para la investigación de la diabetes. Técnicas existentes para el estudio de islotes cultivados en su arquitectura original de 3 dimensiones son lentos, ineficientes y uso poco frecuente. Este trabajo describe un método nuevo, simple y eficiente para la generación de secciones de la parafina de alta calidad de todo cultos islotes.

Islote pancreático inclusión de secciones de la parafina

Aquí, presentamos un protocolo para generar datos de transcriptoma de alta calidad y a gran escala de células individuales de islotes pancreáticos humanos aislados utilizando una tecnología de secuenciación de ARN microfluídico microfluídico basada en gotas.

Secuenciación y análisis de islotes pancreáticos humanos de una sola célula

Este estudio utiliza marcadores de muerte celular y apoptosis basados en fluorescencia de tinción múltiple combinados con microscopía confocal para evaluar la apoptosis inducida por citocinas y la muerte β celular específica en islotes pancreáticos. Revela cambios espaciales y temporales en la muerte celular y la apoptosis en respuesta a estímulos extracelulares.

Tratamiento de islotes pancreáticos aislados y medición de la apoptosis

Aquí, describimos los ajustes para monitorear en paralelo la bioluminiscencia circadiana y la actividad secretora de las células de los islotes humanos y los miotubos primarios. Para ello, empleamos la administración de genes lentivirales de un indicador de reloj central de luciferasa, seguido de sincronización in vitro y recolección del medio de salida por perifusión celular continua.

La medición paralela de la expresión de genes circadianos del reloj y Hormona en cultivos celulares primarios humanos

Describimos aquí un enfoque relativamente rápido y simple para mapear el tiempo de replicación de todo el genoma de los mamíferos, desde el aislamiento celular hasta el análisis básico de los resultados de la secuenciación. Se proporcionará un mapa genómico de un programa de replicación representativo siguiendo el protocolo.

Determinación de todo el genoma de los mamíferos sincronización de replicación de ADN por medición del contenido

Aprende a medir especies de ADN de preproinsulina diferencialmente metiladas en suero humano como biomarcador de muerte de células β mediante PCR digital. Este método permite detectar la muerte celular en volúmenes mínimos de muestra.

Medición de diferencialmente metilado INS Especies de ADN en muestras de suero humano como un biomarcador de la muerte celular de islotes β (Video) | JoVE Journal

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